脑微血管内皮细胞缺氧复给氧损伤后内皮细胞凋亡的实验研究

脑微血管内皮细胞缺氧复给氧损伤后内皮细胞凋亡的实验研究
作者：李良平俞方毅许智蕾陈家祥徐如祥
来源：《中外医学研究》2011年第22期
【摘要】目的探讨缺氧复给氧损伤后脑微血管内皮细胞凋亡的机制。

方法脑微血管内皮细胞缺氧复给氧损伤后，采用流式细胞仪检测细胞凋亡的程度。

结果应用毛喉素提高细胞内cAMP和蛋白激酶C抑制剂H7，能明显抑制细胞凋亡。

结论细胞凋亡的主要原因是细胞内毛喉素减少和PKC功能增强。

【关键词】内皮细胞；缺氧复给氧；细胞凋亡
The effects of cAMP on BBB damage in brain injury of rats LI Liang-ping1,YU Fang-yi1,XU Zhi-lei1,CHEN Jia-xiang1,XU Ru-xiang2.1Guangzhou Red Cross Hospital,Guangzhou 510220,China
【Abstract】ObjectiveTo explore the mechanism of apoptosis after hypoxia-reperfusion oxygen damage the cerebral microvascular endothelial cells.MethodsApoptosis was detected with flow cytometry after hypoxia-reperfusion oxygen damage of the cerebral microvascular endothelial cells.ResultsForskolin, the reagent of elevating cellular content of cAMP and H7,a PKC inhibitor can significantly inhibit apoptosis.ConclusionThe main reasons of apoptosis are the cAMP decrease and PKC increase in cells.
【Key words】Endothelial cell；Hypoxia-reperfusion oxygen；Apoptosis
脑损伤时脑微血管内皮细胞受损，通透性增加，促使脑水肿发生和发展加重脑继发性损害。

培养的脑微血管内皮细胞在缺氧复给氧损伤过程中的细胞分子生物学变化，可更好地反映脑损伤过程中脑微血管内皮细胞功能状态的变化，为维持内皮细胞良好的功能状态，保护血脑屏障，开辟新的治疗途径提供理论基础。

本研究建立脑微血管内皮细胞缺氧复给氧损伤模型，观察细胞凋亡，探讨微血管内皮细胞损伤的发生机理。

1资料与方法
1.1内皮细胞培养和损伤模型的建立采用前期建立的方法培养内皮细胞，制作缺氧复给氧损伤模型［1］。

1.2实验分组培养P3-P6代内皮细胞，分为损伤组，毛喉素组和H7组。

损伤组处理：内皮细胞用PBS缓冲液（pH 7.2）冲洗3遍，加入含A23187或乙二胺四乙酸
（ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA）的D-Hank液，置于纯氮的缺氧孵育容器中，37 ℃孵育24 h后给氧3 h；毛喉素组：损伤前加入终浓度为0.1 mol/L的毛喉素，其他同损伤组；H7组：损伤前加入终浓度为0.1 μmol/L的H7，其他同损伤组。

1.3流式细胞仪检测培养P3-P6代内皮细胞，悬浮细胞收集于离心管中，贴壁细胞经酶消化后收集于离心管中，用400目筛网过滤2次。

制备的单细胞悬液，用70%乙醇固定（4 ℃预冷），4 ℃保存，染色前用PBS进行离心沉淀，去除固定液，加入200 μl RNase A（1 mg/ml，PBS），37 ℃水浴30 min，加入800 μl PI（100 μg/ml，1.0% Triton X-100，0.01M pH 7.2 PBS）染色调匀，4 ℃避光30 min，流式细胞仪检测。

2结果
脑微血管内皮细胞缺氧复给氧损伤后损伤组、毛喉素组和H7组细胞凋亡率分别为
33.7%、16.5%和17%（见图1）。

毛喉素可以提高细胞内的cAMP水平，而H7是PKC的阻断剂，结果表明cAMP和H7在脑微血管内皮细胞缺氧复给氧损伤过程中，有明显抗细胞凋亡的作用。

3讨论
3.1缺氧复给氧损伤后细胞凋亡细胞凋亡（apoptosis）或称程序性细胞死亡（programmol cell death,PCD）是受基因控制的一种自主性细胞自杀过程，细胞凋亡不是一种被动的过程，而是一种主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达和调控。

细胞凋亡初期，细胞膜发生皱缩、凹陷、染色质变致密，最后断裂成小碎片。

进一步发展，细胞膜将细胞质分割包围，形成多个膜结构尚完整的泡状小体，称为凋亡小体（apoptotic body）；其特点是具有完整的膜性结构，胞膜表面微绒毛消失，内容除了胞质以外，还含有降解的染色质断片。

细胞凋亡和细胞坏死是两种截然不同的过程和生物学现象，在形态学、生化代谢、分子机制、结局和意义等方面都有本质的不同［2,3］。

缺氧复给氧是细胞凋亡的常见原因。

缺氧复给氧损伤后，大量氧自由基产生，作用于内皮细胞，细胞内钙离子浓度增加，促进细胞凋亡基因表达增加，凋亡抑制基因表达减少，可能是导致内皮细胞凋亡的主要原因。

研究表明氧自由基有明显促进细胞凋亡的作用［4,5］，总体而言，低浓度诱发细胞凋亡，高浓度导致细胞坏死［5］。

进一步研究证明，不同类型的抗氧化剂乙酰半胱氨酸、维生素E、抗坏血酸盐都有阻断氧自由基诱发细胞凋亡的作用［6,7］。

而氧自由基所致细胞凋亡的原理尚不清楚，近年来的研究表明，细胞内钙增加和酸化导致线粒体功能紊乱，引起细胞凋亡［8］。

氧自由基能明显增加血管内皮细胞内钙离子浓度［9］。

细胞内钙增加，不仅可使线粒体功能紊乱，而且有诱发细胞凋亡的作用［10］。

某些化学毒素破坏细胞内钙离子稳态，导致细胞内钙离子非生理性增加，诱发细胞凋亡［11］。

细胞外细胞内钙离子螯合剂，钙通道阻滞剂和钙调蛋白拮抗剂都有减少或阻止细胞凋亡的作用。

细胞内钙离子增加，激活钙离子依赖性蛋
白酶，促进细胞凋亡。

钙依赖性中性蛋白酶，钙蛋白酶可促进细胞凋亡。

钙蛋白酶抑制剂有明显阻断细胞凋亡的作用［12］。

细胞内钙离子可激活核酸内切酶，促进细胞凋亡的发生、发展［13］。

缺氧复给氧损伤后，促进细胞凋亡的Fas基因表达明显增加，抑制细胞凋亡的Bcl-2基因表达明显减少［14］，以及细胞内的信息传导通路都参与了细胞凋亡的调节。

本研究结果，培养的脑微血管内皮细胞，在缺氧复给氧损伤过程中，细胞凋亡率达33.7%，可能是血脑屏障不可逆性损害的基础，如果能够减少细胞凋亡，保护内皮细胞，达到减少血脑屏障不可逆性损害，可达到减轻脑水肿的目的。

3.2内皮细胞凋亡的机理
3.2.1PKC的作用在内皮细胞缺氧复给氧损伤过程中，PKC表达明显增加［15］。

应用PKC抑制剂，在脐静脉内皮细胞缺氧复给氧损伤过程中，能明显抑制氧化低密度脂蛋白诱发的细胞凋亡的作用［16］。

Pohgracz［17］报道细胞凋亡的PKCβ亚型表达明显增加，PKCξ亚型减少。

Devente［18］报道phorbol esters刺激细胞引起凋亡，PKCξ过分表达，PKCα/β表达亦有所增加。

各种不同条件下，细胞凋亡过程中PKC同工酶亚型表达存在明显差异性，哪种亚型参与细胞凋亡的过程，目前尚不清楚。

也有报道phorbol esters和其他PKC激动剂可抑制核酸内切酶的作用，阻断细胞凋亡的发生发展［19］。

PKC在细胞凋亡中的作用可能与细胞内PKC功能状态有关。

PKC过分表达时可促进细胞凋亡，细胞内PKC功能状态低下时应用PKC激动剂可阻止细胞凋亡。

本研究结果在脑微血管内皮细胞缺氧复给氧损伤过程中，PKC 抑制剂H7有明显抑制细胞凋亡的作用。

提示：在脑损伤过程中可能有阻止内皮细胞凋亡，减少血脑屏障不可逆性损害，保护血脑屏障的作用。

3.2.2cAMP的作用在缺氧复给氧损伤过程中，cAMP依赖的蛋白激酶功能明显下降［15］，在培养的牛肺动脉内皮细胞，2-甲氧基雌乙醇诱发细胞凋亡过程中，cAMP激动剂毛喉素有明显抑制细胞凋亡的作用［20］。

在许多实验模型中，cAMP有抑制细胞凋亡的作用，比较典型的是体外培养的神经细胞，去除神经营养因子后，可产生细胞凋亡，提高细胞内cAMP有明显抑制凋亡的作用［21］。

也有报道，细胞内cAMP增加，同样也可诱发细胞凋亡［22］。

细胞内cAMP对细胞凋亡的不同作用，可能与不同条件下细胞内cAMP功能状态有关，细胞内cAMP下降，提高细胞内cAMP可阻止细胞凋亡，细胞内cAMP增加，降低cAMP 可阻止细胞凋亡的发生。

本研究结果显示，在脑微血管内皮细胞缺氧复给氧损伤中，存在大量的细胞凋亡，应用毛喉素，提高细胞内cAMP水平，有明显阻止细胞凋亡，保护内皮细胞的作用。

PKC不仅参与了血脑屏障可逆性开放过程，而且也参与了脑微血管内皮细胞凋亡，血脑屏障不可逆性开放过程，PKC阻断剂H7有明显阻止脑微血管内皮细胞凋亡，保护血脑屏障的作用。

内皮细胞内cAMP增加，有稳定细胞骨架结构、阻断血脑屏障可逆性开放的作用，在缺氧复给氧损伤过程中，细胞内cAMP增加，有明显阻止脑微血管内皮细胞凋亡的作用，减轻血脑屏障不可逆性损害。

细胞内信号转导机制的深入研究，可望为临床治疗提供一些新的途径。

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【收稿日期】2011-06-03
（本文编辑：陈春梅）。