Prokineticin 2对高糖高脂诱导的心肌细胞损伤的保护作用

Prokineticin 2对高糖高脂诱导的心肌细胞损伤的保护作用崔伟力;王敏;余薇
【摘要】目的探讨Prokineticin 2(PK 2)对高糖高脂环境下心肌细胞损伤的保护作用.方法通过体外H9c2大鼠心肌细胞培养,采用33 mmol/L的葡萄糖合并使用150 μmol/L的棕榈酸刺激12、24、36、48h不同的时间造成心肌细胞高糖高脂损伤,给予不同浓度的PK 2干预治疗,通过MTT检测PK 2对高糖高脂诱导的心肌细胞损伤的作用.结果 0.1、1、10、100 nmoL/L的PK 2可致正常的心肌细胞存活率增加,与正常对照组比较具有明显差异;高糖高脂刺激H9c2心肌细胞24 ～48 h后细胞存活率开始明显下降,且具有时间依赖性.0.1、1、10nmol/L的PK2可逆转存活率的降低.结论 PK 2对高糖高脂诱导的心肌细胞损伤有显著的保护作用,其机制有待进一步的研究.
【期刊名称】《湖北科技学院学报（医学版）》
【年(卷),期】2018(032)001
【总页数】4页(P5-7,11)
【关键词】糖尿病;心肌病;Prokineticin 2;心肌细胞;细胞存活率
【作者】崔伟力;王敏;余薇
【作者单位】湖北科技学院药学院,湖北咸宁437100;湖北科技学院药学院,湖北咸宁437100;湖北科技学院药学院,湖北咸宁437100
【正文语种】中文
【中图分类】R961
糖尿病(diabetes mellitus)是一种由遗传和环境因素共同作用、以胰岛素分泌缺陷或/和胰岛素作用障碍导致的一组以慢性高血糖为特征的代谢性疾病。

近年来，随
着人们生活水平的提高，糖尿病的发病呈快速增长和低龄化的态势，到目前为止，全世界糖尿病的患病人数大概是4.2亿，推测到2040年，该数目将达到6.42亿[1]；我国糖尿病患者人数约占世界糖尿病人群总数的五分之一，患病率居世界第
二位，给家庭和社会带来极大的负担。

糖尿病主要危害全身大、小血管，心血管并发症已成为50%～80%糖尿病患者的主要死因[2]。

研究发现，其中糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)的危险因素占首位，可导致患者心力衰竭而死亡。

然而，DCM的发病机制非常复杂，目前尚未完全阐明。

1999年，Mollay等[3]在蛙的皮肤分泌物中发现了一种分子量为8kDa的蛋白质，将其命名为Bv8。

随后在哺乳类动物小鼠、大鼠、猴子以及人类中发现Bv8的同
源蛋白，分别命名为prokineticin l(PK l)和prokineticin 2(PK 2或Bv8)。

PK 2
最初因促进胃肠平滑肌的收缩而被大家所熟识，后来研究发现PK 2在中枢神经系统、生殖系统以及外周血细胞中高度表达，调节细胞的增殖和存活。

本研究通过高糖高脂刺激H9c2心肌细胞，同时给予不同浓度的PK 2进行干预治疗，探讨PK 2对高糖高脂诱导的心肌细胞损伤的保护作用，加深对DCM发生机制的认识，同时为DCM防治提供新靶点和新思路。

1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 细胞系
H9c2细胞购自武汉大学细胞典藏中心。

1.1.2 药品与试剂
DMEM培养基、胎牛血清购自美国Gibco公司，D-葡萄糖、棕榈酸(palmitic
acid，PA)购自Sigma公司。

1.1.3 主要仪器
超净工作台(苏州净化)；CO2培养箱(美国Thermo公司)；倒置相差显微镜(德国Leica)；多功能酶标仪(美国Bio-Tek公司)。

1.2 方法
1.2.1 细胞培养
H9c2细胞培养于DMEM低糖培养基中含有10%胎牛血清、2%抗生素(50 U/mL 青霉素+50 g/mL链霉素)，在37℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中静置培养。

细胞生长接近于70%～80%融合，给予0.25% EDTA胰酶消化、传代培养。

取对数生长期细胞进行实验。

1.2.2 实验分组
①PK 2对正常细胞作用分为：正常对照组(Control，使用含葡萄糖5.5 mmol/L
的DMEM低糖培养基)、0.1 nmol/L PK 2、1 nmol/L PK 2、10 nmol/L PK 2、100 nmol/L PK 2、1 μmol/L PK 2 (使用含葡萄糖5.5 mmol/L的DMEM低糖培养基加入不同浓度的PK 2刺激24 h)。

②PK 2对高糖高脂细胞作用分为：正常对照组(Control，使用含葡萄糖5.5 mmol/L的DMEM低糖培养基)、葡萄糖
+PA(Glucose+PA，使用含33 mmol/L的葡萄糖、150 μmol/L PA培养基培养)、葡萄糖+PA+0.1 nmol/L PK 2(Glucose+PA+0.1 nM PK 2)、葡萄糖
+PA+1nmol/L PK 2(Glucose+PA+1 nM PK 2)、葡萄糖+PA+10 nmol/L PK
2(Glucose+PA+10 nM PK 2)、葡萄糖+PA+100 nmol/L PK
2(Glucose+PA+100 nM PK 2)。

分别在33 mmol/L的葡萄糖、150 μmol/L PA 培养基中给予0.1 nmol/L、1 nmol/L、10 nmol/L、100 nmol/L PK 2培养刺激12、24、36、48 h。

1.2.3 细胞存活率检测
实验结束后弃上清液，每孔加入5 g/L MIT工作液30 μL，10%血清培养基270
μL，共同培养4 h，加入DMSO在490 nm波长下检测，酶标仪检测各孔的光密度(OD)值。

1.3 统计学分析
全部数据以表示，用SPSS 13.0统计学软件进行分析，组间均数比较用One-Way ANOVA检验，P<0.05为差异有显著性。

2 结果
2.1 PK 2对正常心肌细胞存活率影响
MTT测定结果表明，正常对照组细胞存活率以100%参照，不同浓度(0.1、1、10、100 nmol/L)的PK 2可致心肌细胞存活率增加，与正常对照组比较均有明显差异(P均<0.05)，然而进一步加大PK 2的浓度达到1μmol/L时其存活率变化不大，
与正常对照组比较无显著性差异(P>0.05)。

见图1。

与正常对照组比较，*P<0.05；n=10图1 不同浓度PK 2刺激对H9c2心肌细胞
存活率的影响
2.2 PK 2对高糖高脂损伤的心肌细胞存活率影响
MTT测定结果表明，正常对照组细胞存活率以100%参照，心肌细胞随着高糖高
脂刺激时间的延长存活率逐渐下降，尤其在刺激24、36以及48 h后与正常对照
组比较出现显著性差异(P<0.05)；然而，不同浓度(0.1、1、10 nmol/L)的PK 2
可使刺激24、36以及48 h的心肌细胞存活率逆转上升，与高糖高脂模型组比较
具有明显差异(P<0.05)。

见图2。

与正常对照组比较，*P<0.05；与Glucose+PA比较，#P<0.05；n=10图2 不
同浓度PK 2对高糖高脂刺激的H9c2心肌细胞存活率的影响
3 讨论
DCM是由糖尿病引起的一种心脏结构和功能障碍，独立于高血压、冠状动脉粥样
硬化性心脏病、心脏瓣膜病及其他已知心脏疾病[4]。

DCM早期表现为心肌顺应性降低和舒张期充盈受阻为主的舒张功能障碍，晚期以收缩功能不全为主，并最终发展为充血性心力衰竭，重症患者甚至发生猝死。

糖尿病使患者发生充血性心力衰竭的几率增加2～5倍[5]。

现有研究认为DCM与糖脂代谢紊乱、氧化应激、心肌纤维化、自噬以及细胞凋亡等多种因素有关[6]。

心肌细胞凋亡是糖尿病患者充血性
心力衰竭发生的重要原因。

已有文献报道高糖高脂可诱导H9c2心肌细胞损伤[7]。

本文通过33 mmol/L高糖联合150 μmol/L PA高脂刺激H9c2心肌细胞，心肌
细胞的存活率明显下降。

本研究在此基础上进一步探讨PK 2对高糖高脂诱导心肌的保护。

PK 2是一种分泌性蛋白，具有促进胃肠蠕动，调节昼夜节律和免疫反应，参与血
细胞生成、嗅觉和促性腺激素释放激素系统的发育等生物学作用[8-10]。

2007年，Urayama等[11]首次发现PK 2在C57BL/6J小鼠心脏组织、H9c2心肌细胞株以及H5V血管内皮细胞中表达，PK 2不仅可促进H5V血管内皮细胞的血管生成，
还可抑制H2O2所致的H9c2心肌细胞氧化损伤。

Urayama等[11]进一步对比了终末期充血性心力衰竭患者和正常人心脏，发现心衰患者心脏PK 2的表达明显下降。

本文在正常培养的H9c2心肌细胞上给予不同浓度的PK 2，发现其可使心肌
细胞的存活率高于正常对照组，表明其有一定的促细胞增殖作用。

随后，通过不同浓度的PK 2干预高糖联合高脂诱导的H9c2心肌细胞损伤，发现其可使心肌细胞的存活率明显上调，表明其对高糖高脂造成的心肌细胞具有一定的保护作用。

综上所述，高糖高脂可致H9c2心肌细胞损伤，PK 2可抑制高糖高脂所致的心肌
细胞损伤，这为临床上防治DCM开拓了新思路，然而其潜在的机制有待进一步的研究。

参考文献：
[1]OGURTSOVA K,DA R F J,HUANG Y,et al.IDF diabetes atlas:global
estimates for the prevalence of diabetes for 2015 and 2040[J].Diabetes Res Clin Pract,2017,128:40
[2]WAN Z V,HILL J A.Diabetic cardiomyopathy:catabolism driving metabolism[J].Circulation,2015,131(9):771
[3]MOLLAY C,WECHSELBERGER C,MIGNOGNA G,et al.Bv8,a small protein from frog skin and its homologue from snake venom induce hyperalgesia in rats[J].Eur J Pharmacol,1999,374(2):189
[4]RUBLER S,DLUGASH J,YUCEOGLU Y Z,et al.New type of cardiomyopathy associated with diabetic glomerulosclerosis[J].Am J Cardiol,1972,30(6):595 [5]KANNEL W B,MCGEE D L.Diabetes and cardiovascular disease:the framingham study[J].JAMA,1979,241:2035
[6]MIKI T,YUDA S,KOUZU H,et al.Diabetic cardiomyopathy: pathophysiology and clinical features[J].Heart Fail Rev,2013,18(2):149 [7]闫佳敏,王瑞玲,马琴,等.MAPK信号通路在高糖高脂诱导的心肌细胞肥大中的差异调节作用[J].中国医学创新，2017,14(10):5
[8]MELCHIORRI D,BRUNO V,BESONG G,et al.The mammalian homologue of the novel peptide Bv8 is expressed in the central nervous system and supports neuronal survival by activating the MAP kinase/PI-3-kinase pathways[J].Eur J Neurosci,2001,13(9):1694
[9]NG K L,LI J D,CHENG M Y,et al.Dependence of olfactory bulb neurogenesis on prokineticin 2 signaling[J].Science,2005,308(5730):1923 [10]LECOUTER J,LIN R,TEJADA M,et al.The endocrine-gland-derived VEGF homo-logue Bv8 promotes angiogenesis in the testis:Localization of Bv8 receptors to endo-thelial cells[J].PNAS,2003,100(5):2685
[11]URAYAMA K,GUILINI C,MESSADDEQ N,et al.The prokineticin receptor-1 (GPR73) promotes cardiomyocyte survival and angiogenesis[J].FASEB J,2007,21(11):2980。