酶工程实验报告四(纤维素酶酶促反应初速度的测定)

酶浓度 mg/ml
0.4
0.6
0.2675 0.3405
0.5260 0.7290
0.5475
1.0010
0.6610
1.1370
0.7080
1.1560
0.8155
1.2930
0.9030
1.3620
0.8795
1.4235
0.9735
1.5230
1.0135
1.5955
1.0505
1.6245
表一
中（取两次，每次时间间隔相同），迅速振荡均匀。 （3）将两支试管沸水浴 5min，自来水冷却后，加蒸馏水 20mL。摇匀，在 540nm
处读取 OD 值。 （4）空白管：在 25mL 试管中依次加入 1mL 底物溶液、 3mLDNS、 1mL 对应浓
度的酶溶液。（注意：每次加入溶液时均需充分混合均匀） 注意：原酶液的稀释对于测定反应初速度进程曲线很关键，四种酶液稀释浓度的 OD
表一
不同酶浓度的反应初速度时间范围和反应初速度
酶浓度（mg/ml） 反应初速度时间范围（min）
线性关系
反应初速度（v）
0.2
3～30
y=0.0279x+0.4968
0.0279
0.4
3～12
y=0.0463x+0.1073
0.0463
0.6
3～12
y=0.0702x+0.3220
0.0702
0.8
7、实验小结：
①初步掌握纤维素酶酶促反应初速度的测定方法，了解酶促反应动力学曲线的意义。 ②由酶促反应的进程曲线获得初速度反应时间范围和酶反应速度表征初速度的动力学
涵义。 ③测酶活时严格控制影响到的因素，如反应温度、时间、pH 等。 ④量取固体酶液时精确，溶解稀释做到准确无误，减少实验操作误差，增加结果可信度。 ⑤对反应后的实验结果认真仔细观察做好记录。养成科学分析问题的习惯。
（3）、为什么酶活力应在进程曲线的初速度时间范围内进行？ 答：要进行酶活力测定，首先要确定酶反应时间，酶的反应时间并不是任意规定的，
应该在初速度时间范围内选择。可以通过进程曲线的制作而求出酶的初速度时间范围。 进程曲线是在酶反应的最适条件下采用每隔一定时间测产物生成量的方法，以酶反应时 间为横坐标，产物生成量为纵坐标绘制而成。从进程曲线可知，在曲线起始一段时间内 为直线，其斜率代表初速度。随反应时间延长，曲线趋于平坦，斜率变小，说明酶的反 应速度下降。反应速度随反应时间的延长而降低这一现象可能是由于底物浓度的降低和 产物浓度的增高致使逆反应加强等原因所致。因此，要真实反映出酶活力大小，就应在 初速度时间内测定。求出酶反应初速度的时间范围是酶动力学性质的一系列研究中的组 成部分和必要前提。
① 酶液用量与底物浓度的影响都遵循反应动力学原理。在底物浓度较低时，酶反应 速度与底物浓度的增加成正比关系；底物浓度过高时，由于高浓度底物的抑制作用，酶 反应速度反而会下降。
② 酶解反应时间的选择。由酶反应速度曲线可见，反应速度随着反应时间的延长， 酶反应速度下降。这主要是因为随着反应进行，底物浓度降低，产物浓度增加，从而加 速了逆反应的进行。因此，为准确地表示酶活力，需采用初速度来表示，试验结果证明 酶解时间为 30min 为宜。
6、 分析与讨论：
6.1 分析 酶促反应中反应初速度又称初速率(initial rate)，是酶促反应最初阶段的反应 速度。它是衡量整个酶促反应的速度，用产物生成量与时间的关系曲线称为酶反应的进 程曲线。曲线的斜率就是酶反应过程中的反应速度。此阶段特点：
(1)酶反应速度保持恒定不变； (2)底物浓度没有明显减少，通常指 5%的底物被利用； (3)产物浓度非常低； (4)逆反应可忽略不计。 通过酶反应的进程曲线，在一定时间内反应速度维持恒定，但随着时间的延续，反 应速度逐渐降低。这是由于：底物浓度的降低，产物浓度的增加加速了逆反应进行；产 物的抑制作用，产物的积累导致 pH 改变；酶会部分失活。我们可以得到酶在各个时间范 围内的反应速度，由曲线走势最为关键的是得到不同浓度下纤维素酶的反应初速度，来准
3、实验原理或装置示意图：
原理: 产物生成量与时间的关系曲线称为酶反应的进程曲线。曲线的斜率就是酶反 应过程中的反应速度。在一定时间内反应速度维持恒定，但随着时间的延续，反应速度 逐渐降低。这是由于：底物浓度的降低，产物浓度的增加加速了逆反应进行；产物的抑 制作用，产物的积累导致pH改变；酶会部分失活。因此，为了准确表示酶的反应速度就 必须采用初速度维持恒定的速度。在酶活力测定时，一般应先做进程曲线，然后再求出 代表初速度的反应时间范围。
总量的极少部分，不易准确检测，而产物则是从无到有，只要测定方法灵敏，就可准确 测定。因此一般以测定产物的增量来表示酶促反应速度较为合适. 测初速度的原因也是这 个，因为只有在初速度下，才能保证底物过量，酶被完全饱和，如果用反应中某一阶段 的速度的话，很难保证底物还是过量的，因为根本就不知道这种酶的反应速度到底有多 快。
3～ 9
y=0.0869x+0.4813
0.0869
综合上表可得出结论：反应速度随着反应时间的延长, 酶反应速度下降。这主要是因 为随着反应的进行, 底物浓度降低, 产物浓度增加, 从而加速了逆反应的进行。因此,为准 确地表示酶活力, 需采用初速度来表示, 试验结果证明四种不同纤维素酶浓度酶促反应 时间在为 30 min 内较好[1]。
5
图一
OD540
不同纤维素酶浓度反应动力学曲线
2
1.8
60
50
1.6
25 30
40 40
50
60
1.4
.2 1
9 12 15 20
30
40
12 15
6 9
15
20
25
12
25 30
40
50
60
0.8
9
20
0.6
3
6 6
12 15
3
9
0.4
3
6
3
0.2
0
0
10
20
30
40
50
4
5、实验结果与数据处理：
5.1 实验数据与结果：如表一
OD540 值
时间 (min) 3 6 9 12 15 20 25 30 40 50 60
0.2 0.3995 0.6560 0.8170 0.9380 1.0120 1.0970 1.1690 1.2370 1.2940 1.3580 1.4160
或者是酶的反映速率，横坐标可以是时间，温度，PH，酶的浓度或底物浓度，曲线就是 纵坐标随横坐标的变化而变化所绘制出来的，曲线的斜率就是酶反应过程中的反应速度。
（2）、 测定酶活力时为什么要测量反应的初速度，且常以测定产物增加量为宜? 答：在一般的酶促反应体系中，底物往往是过量的，测定初速度时，底物减少量占
0.8 0.7115 1.0640 1.2330 1.2730 1.2930 1.4340 1.5520 1.5620 1.6180 1.6860 1.7900
5.2 结果处理 以反应时间为横坐标，以相对反应速度（吸光度值）为纵坐标，做出四种酶
浓度的进程曲线，求出各种酶浓度下的初速度时间范围和反应初速度。 统计软件 SPSS 作图分析如图一 、图二： 纤维素酶反应的速度曲线
时间时，迅速取 2mL 反应液于装有 3mLDNS 试 剂 的 25mL 试管中（取两 次，每次时间间隔相 同），迅速振荡均匀。
流水冷却后，加蒸
馏水 20mL。
↓
空白管：在 25mL 试管中依次加入 1mL 底 物 溶 液 、 3mLDN、 1mL 对 应浓度的酶溶液。
G 作酶反应进程曲线 4.3 实验注意事项
中，在50 ℃水浴中保温10min。 （2）将保温后的酶液迅速倒入保温后的底物溶液中，振荡混匀，并立即用秒表计时，
在50 ℃水浴中继续保温。 3、测定步骤 （1）保温时间：3min、 6min、 9min、 12min、 15min、 20min、 25min、 30min、
40min、 50min、 60min。 （2）保温到不同的时间时，迅速取 2mL 反应液于装有 3mLDNS 试剂的 25mL 试管
改进：为使结果准确，可信尽可能减少操作人为的、系统的不必要误差做到： ①在小组做实验种形成操作标准化、进程车间化，分工明确，计时精确，终止液 DNS
8
加入迅速。 ②量取固体酶液、蒸馏水等精确无太大偏差，溶解稀释做到准确无误。
8、实验思考题：
（1）、 什么是酶反应进程曲线？ 答：产物生成量与时间的关系曲线称为酶反应的进程曲线：纵坐标一般是生成物量
释未达要求等操作失误，导致曲线最低，结果不可靠。
除次，在最适条件下随纤维素酶浓度升高反应初速度时间范围呈现降低趋势，反应初速度 不断升高。四种浓度纤维素酶的酶促反应时间在为 30 min 内较线性关系极好，因此反应 初速度表时间范围在 30 分钟内[3]。由测定结果可见，在一定的温度条件下，一定酶液用 量（浓度）和酶反应时间对测定结果的影响较大，其中
XX 小组合作
XX
XX
1、 实验目的
求出在一定条件下测定酶活力的初速度时间范围，并了解它的意义，了解浓度度对
曲线的影响。
2、 实验仪器、试剂和溶液：
2.1 仪器： 紫外分光光度计、比色皿（3个）、恒温水浴锅、试管架（1个）、l移液管、洗耳球、 标签（若干）、分析天平（感量0.01mg）等。
2 .2 试剂和溶液 2 .2.1 柠檬酸钠缓冲液，0.05mol/L，pH4.8 2 .2.2 10mg/ml的CMC-Na溶液（底物溶液） 2 .2.3 DNS试剂（CMCA-DNS） 2 .2.4 纤维素酶液
↓
E 不同时间保温
3min、6min、9min、12min、1保5m温in不、2同0m时in间、2：5min、30min、40min、50min、 60min。迅速取 2mL
反应液于装有 3mLDNS 试剂的 25mL 试管中（取两次，每次时间间隔相同），迅速振荡均匀
↓ F 测定
↙
↙
↘
↘
①反应终止→ ②沸水浴 5min → ③定容至 25ml→ ④测定 OD540 吸光值
① 反应温度准确，酶液准确稀释。不同 pH 所用酶液用对应 pH 缓冲液稀释 ②试管上编号：贴上用圆珠笔写上编号的胶布，以防止保温或沸水加热时脱落； ③移液管使用时量取精准，保证结果可靠准确。 ④精确记时：每一管加入酶液的时间要做记录，每管之间间隔的时间要合理； ⑤避免试管进水：煮沸和用流水冲洗时；
本科学生实验报告
学号 104120440 姓 名
孙永升
学院 生命科学学院 专业、班级 10 生物技术
实验课程名称
酶 工 程 <实验>
教师及职称
李俊俊 <讲师>
开课学期 2012 至 2013 学年 第二学期
填报时间 2013 年 5 月 8 日
云南师范大学教务处编印
1
实验名称
实验方式
小组成员
XX
实验四：纤维素酶酶促反应初速度的测定
值控制在 0—1 之间。 本实验在纤维素酶最适反应条件 50℃、pH 4.8 下测定不同浓度下纤维素酶反应初速
度值。
3
4.2 操作流程： A 制备不同浓度酶液
↓
B 预热
↙↘
50mL 的底物溶液
纤维素酶酶液于 250mL 三角瓶中
↓
C 50 ℃水浴中保温 10min
↓
D 保温后底物与酶液反应
将酶液迅速倒入底物溶液振荡混匀，立 即用秒表计时于 50 ℃水浴中继续保温
7
确表示酶的反应速度。 6.2 讨论 从实验结果表一可以看出不同酶浓度的反应初速度时间范围与反应初速
度差异极大，实验中用同一纤维素酶测定其不同浓度反应进程曲线，纤维素酶浓度 0.2 mg/ml，0.4 mg/ml，0.6mg/ml，0.8 mg/ml，实验中采用最适 pH、最适温度和足够高的底物浓 度，采用比色法求得还原糖的浓度, 生成的葡萄糖的含量与所测的吸光度成正比[2]。因此 随酶浓度增加曲线应该逐渐升高，0.4 mg/ml 测定时可能存在系统误差，如温度、酶液称取与稀
本实验采用最适 pH、最适温度和足够高的底物浓度，来测定不同酶浓度下反应速度
2
的时间范围。
4、实验方法步骤、操作流程及注意事项：
4 .1 实验方法与步骤： 1、 酶液制备 精确称取固体纤维素酶0.05g 、0.1g、 0.15g 、0.2g ，分别溶于100mL蒸馏水
中，制成浓度为0.5mg/mL、 1mg/mL、 1.5mg/mL、 2mg/mL的酶液。 2、预热 (1)分别取50mL的底物溶液和不同浓度的已制备好的纤维素酶酶液于250mL三角瓶
60
70
时间（min）
图二
0.2mg/ml 0.4mg/ml 0.6mg/ml 0.8mg/ml
6
由图一 、图二发现,同一种酶的不同浓度具有不同的斜率。所测纤维素四种酶浓度的动力 学曲线虽然是非直线,但在 3～25 min 呈线性关系。且各自线性关系不同。不同酶浓度的 反应初速度时间范围和反应初速度如下表一所示。