满天星异荭草苷对大鼠酒精性肝纤维化保护作用的实验研究

满天星异荭草苷对大鼠酒精性肝纤维化保护作用的实验研究
目的：研究满天星异荭草苷对乙醇诱导形成的大鼠肝纤维化的干预作用及其机制。

方法：90只雄性大鼠随机分为6组，分别为正常对照组、模型对照组、秋水仙碱组（灌胃给予秋水仙碱1、0 mg·kg-1·d-1）、异荭草苷低、中、高剂量组（灌胃给予异荭草苷25，50，100 mg·kg-1·d-1）。

实验过程中，模型组大鼠仅灌胃给予白酒，治疗组在给白酒的同时灌胃相应的药物，正常组则只灌胃等量的生理盐水。

给药24周后，各组大鼠眼球取血、取肝脏，并测定血浆白细胞介素-6（IL-6），人肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和血清谷丙氨酸氨基转移酶（ALT）、门冬氨酸氨基转移酶（AST）、透明质酸（HA），层粘连蛋白（LN），Ⅲ型胶原（PCIII）和羟基脯氨酸（Hyp）的含量，检测肝组织髓过氧化物酶（MPO）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活力，Western blot 检测α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和转化生长因子-β1（TGF-β1）的表达，以及肝组织病理检查。

结果：异荭草苷能够保护受损的肝组织，降低ALT，AST，IL-6，TNF-α，MDA，MPO，HA，LN，PCIII和Hyp的含量（P＜0、05），增强SOD，GSH-Px活性（P＜0、05），显著下调α-SMA，TGF-β1的表达（P＜0、05），且中、高剂量组效果更为显著。

结论：异荭草苷对酒精性肝纤维化大鼠具有保护作用。

标签：满天星；异荭草苷；乙醇；肝纤维化
1 材料
1、1 动物雄性Wistar大鼠，SPF级，体重（200±20）g，由广西医科大学实验动物中心提供，实验动物生产许可证号SCXK（桂）2009-0003。

1、2 药物和试剂满天星采自广西南宁市邕宁县，经广西中医药大学第一附属医院药学部黄权芳副主任中药师鉴定；秋水仙碱（厦门星隆达化学试剂有限公司，批号110403）。

满天星异荭草苷的提取及结构鉴定参考张凤梅等[1]的方法，由本实验室自行提取与鉴定。

谷丙氨酸氨基转移酶（ALT）、门冬氨酸氨基转移酶（AST）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、羟基脯氨酸（Hyp）试剂盒（南京建成生物工程研究所）；白细胞介素-6（IL-6）、人肿瘤坏死因子-α（TNF-α）试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）；透明质酸（HA），层粘连蛋白（LN），Ⅲ型胶原（PCIII）试剂盒（北京福瑞生物工程研究公司）；鼠单克隆抗体（美国Santa Cruz Biotechnology）；山羊抗小鼠-IgG抗体（美国Calbiochem Company）；Western blot检测试剂盒（美国Amersham）；TGF-β1一抗、羊抗兔-IgG抗体（武汉博士德生物工程有限公司）。

2 方法
2、1 动物造模及分组给药90只雄性大鼠适应性饲养1周后，随机分为6
组，每组15只，分别为正常对照组、模型对照组、秋水仙碱（阳性对照）组、异荭草苷低、中、高剂量组。

除正常对照组外，其余5组均灌胃给予乙醇以造成酒精性肝纤维化模型，给予的浓度和剂量采用逐渐递增的方法[2]：1～4周，5、0 g·kg-1·d-1；5～8周，7、0 g·kg-1·d-1；9～12周，9、0 g·kg-1·d-1；13～24周，9、5 g·kg-1·d-1。

在造模过程中，秋水仙碱组每天灌胃给予秋水仙碱1、0 mg·kg-1，异荭草苷低、中、高剂量组每天分别灌胃给予异荭草苷25，50，100 mg·kg-1。

对照组和模型组则灌胃给予生理盐水。

连续给药24周后，所有动物均从眼球取血，处死，快速分离肝组织，立即用冰冷生理盐水清洗以除去过多的血，一部分于-80 ℃保存，其余立即放入10%福尔马林溶液中固定。

2、2 肝组织病理检查肝组织分离后，取一部分马上放入10%的福尔马林溶液中固定，常规脱水、石蜡包埋，组织切片，H&E染色，做病理切片检测。

2、3 血清中ALT，AST活性测定血清中ALT，AST的活性采用试剂盒进行检测。

2、4 血浆中IL-6，TNF-α和肝组织MPO活性测定血浆中IL-6和TNF-α采用夹心酶联免疫吸附试验法（ELISA法），严格按照试剂盒说明书进行操作。

肝组织髓过氧化物酶（MPO）活性参考Ersahin M [3]的方法进行检测。

2、5 肝脏抗氧化酶和脂质过氧化作用测定肝组织中SOD，GSH-Px含量用于抗氧化剂的测定，其活性采用黄嘌呤氧化酶法测定；MDA含量用于测定脂质过氧化反应，其活性采用硫代巴比妥酸法测定[4]，具体步骤均按照各试剂盒说明书操作。

血清中HA，LN，PCIII的含量采用放射免疫测定法（RIA）检测。

肝组织中Hyp的含量测定严格按照试剂盒的说明书进行操作。

2、6 Western blot检测肝组织中α-SMA表达水平用总蛋白提取试剂盒提取各组肝组织的总蛋白，Bradford法对蛋白样品进行定量。

取出30 μg蛋白样品至EP管中，加入4×SDS上样缓冲液至终浓度为1×SDS，95 ℃煮10 min进行蛋白质变性，再进行100 g·L-1的SDS-PAGE凝胶电泳，然后将蛋白质转至硝酸纤维膜上，用50 g·L-1的脱脂牛奶于4 ℃封闭过夜后，分别用α-SMA抗体（1∶200），β-actin （1∶1 000）4 ℃孵育过夜，然后加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠-IgG抗体（1∶1万）室温2 h。

最后加ECL发光剂于暗室充分反应后用胶片曝光。

将每个样本所测得的α-SMA蛋白灰度值，分别与对应的β-actin蛋白的灰度值相比，计算二者灰度比值。

2、7 肝组织中TGF-β1的检测分别取各组50 mg肝组织，加1 mL蛋白裂解液（裂解液组成：50 mmol·L-1 Tris，150 mmol·L-1 NaCl，5 mmol·L-1 EDTA，0、1% SDS，1% NP-40，1 mg·L-1Aprotinin，1 mg·L-1Leupeptin，1 mg·L-1Pepstatin，2 mmol·L-1PMSF），裂解30 min，4 ℃，12 000 r·min-1离心10 min，取上清，BCA法蛋白定量。

加入上清缓冲液，100 ℃加热5 min。

每孔上样20 μL总蛋白，12% SDS-PAGE进行电泳，在转移缓冲液中，以100 mA的电流转移到PVDF膜上。

PVDF膜用含5%牛奶的TBST液封闭2 h，加入大鼠抗TGF-β1单抗，4 ℃孵育过夜。

继以相匹配的辣根过氧化物酶结合的二抗室温孵育2 h，ECL 试剂盒
显色，β-actin为内参，用图像处理系统进行分析。

2、8 统计分析实验数据以SPSS 16、0统计软件进行统计学处理，以±s表示，用t检验进行组间比较，检验水准以P＜0、05为有显著性。

3 结果
3、1 肝组织病理检查情况实验结束时，除了对照组外，其余各组均有动物死亡，其中，模型组死亡7只，秋水仙碱组死亡3只，异荭草苷低、中、高剂量组分别死亡4，3，1只。

H&E染色病理检查结果显示，正常组大鼠肝小叶结构清晰，肝板以中央静脉为中心向周围呈放射状排列，肝血窦与肝板之间界限清楚，肝细胞核大而圆，位于细胞的中央。

模型组大鼠肝细胞出现肿胀、气球样变，胞浆染色不均，出现Malorry小体，或胞浆内出现大量大小不等的脂防空泡，或肝局灶性坏死和淋巴细胞浸润现象。

给药后，秋水仙碱组、异荭草苷中、高剂量组可观察到肝组织病理损伤有明显减轻，见图1。

3、2 血清ALT和AST的活性与对照组比较，模型组大鼠血清中ALT和AST有明显升高（P＜0、05）。

与模型组比较，秋水仙碱组，异荭草苷中、高剂量组ALT和AST活性明显下降（P＜0、05），见表1。

3、3 血浆中IL-6，TNF-α和肝组织MPO活性模型组大鼠血浆中IL-6，TNF-α和肝组织MPO活性明显高于对照组；与模型组比较，秋水仙碱组、异荭草苷中、高剂量组的以上3个指标的含量则有显著降低（P＜0、05），见表2。

A、对照组；
B、模型组；
C、秋水仙碱组；
D、异荭草苷低剂量组；
E、异荭草苷中剂量组；
F、异荭草苷高剂量组。

图1 肝组织病理学改变（HE，×200）
Fig、1 Histopathological changes of liver（HE，×200）
表1 异荭草苷对大鼠血清ALT和AST活性的影响（±s）
Table 1 Effects of isoorientin on serum ALT and AST of rats （±s）
组别剂量/mg·kg-1nAST/U·L-1ALT/U·L-1对照-1598、6±30、183、9±10、6模型-8302、8±71、51）172、8±43、21）秋水仙碱1、012189、5±52、42）120、5±36、72）异荭草苷2510251、8±66、9154、3±40、55012220、6±58、42）113、2±32、82）10014198、5±50、82）97、8±30、92）注：与对照组比较1）P＜0、05；与模型组比较2）P＜0、05（表2～5同）。

3、4 肝脏抗氧化酶和脂质过氧化作用与对照组比较，肝纤维化大鼠的肝脏SOD和GSH-Px活性均明显降低，而MDA活性明显增高。

给药后，异荭草苷各给药组肝SOD和GSH-Px活性显著增强（P＜0、05），而MDA活性明显下降（P
＜0、05），见表3。

3、5 血清中HA，LN，PCⅢ和Hyp含量血清中HA，LN，PCIII和Hyp 含量是衡量肝纤维化发生的重要指标，本实验中，模型组血清中HA，LN，PCIII 和Hyp的含量均明显升高，异荭草苷则能明显降低
3、6 肝组织中α-SMA和TGF-β1的表达水平与对照组比较，模型组中肝组织α-SMA和TGF-β1表达明显增强，而秋水仙碱中、高剂量异荭草苷干预后能显著抑制肝组织α-SMA和TGF-β1的表达（P＜0、05），见表5。

4 讨论
肝纤维化（hepatic fibrosis）是继发于各种形式慢性肝损伤之后组织修复过程中的代偿反应，是“慢性肝炎-肝纤维化-肝硬化”发展过程的枢纽环节，形成原因涉及到致病机体反应、细胞因子、反应靶细胞、抑制因子等多种因素的作用。

酒精性肝纤维化是肝脏在乙醇及其初级代谢产物乙醛的慢性持续损伤作用下，肝脏纤维增生和降解失衡，造成肝脏细胞外基质（ECM）的过度沉积与异常分布的结果。

酒精性肝纤维化是发展为酒精性肝硬化的必经病理过程，由于其具有可逆性，因此对其及时治疗具有重要意义。

本实验采用乙醇灌胃的方法制备大鼠肝纤维化动物模型。

实验结果表明，酒精性肝纤维化初期为不同程度的肝细胞脂肪变性。

随着造模时间延长、乙醇摄入量的增多及动物体内多种有害因素协同作用，肝细胞出现脂代谢、糖代谢紊乱，细胞外基质（ECM）大量合成并在肝窦周围、胆管周围、汇管区、中央静脉周围等处沉积下来，形成肝纤维化。

在酒精性肝纤维化形成过程中还同时伴随着肝功能标志物的改变及血清纤维化标志物的变化[5]。

上述病理变化与酒精性肝病的临床表现基本符合。

长期饮酒会导致机体内促氧化物质明显增多、抗氧化物质减少，促生氧化应激，最终造成肝细胞坏死或凋亡[6]，激发肝组织的炎症反应，从而引起酒精性肝纤维化。

肝细胞发生损伤时，肝细胞通透性增加，酶从肝细胞内外溢进入血液，使血液中ALT，AST浓度急剧升高。

肝内胶原纤维的不断增加，也会促使肝纤维化的发生和发展，而胶原的沉积和降解受多种细胞因子调控，其中IL-6及TNF-α调控尤为重要[7-9]。

IL-6及TNF-α在肝硬化的发生发展中参与肝脏的损伤-修复循环，引起大量ECM的合成和沉积[10]。

本实验中，满天星异荭草苷能显著降低肝纤维化大鼠中ALT，AST，HA，LN，PCIII，Hyp，MDA，IL-6，TNF-α及MPO的含量，提高SOD，GSH-Px的活性，表明了满天星异荭草苷能显著清除体内氧自由基，抑制促炎介质释放，降低胶原纤维的堆积，对脂质过氧化反应具有明显的抑制作用。

肝星状细胞（HSC）是肝纤维化ECM的主要来源细胞，HSC的活化、增殖是肝纤维化发生的中心环节。

HSC被激活后，通过自分泌及旁分泌细胞因子促进未转化的HSC向肌成纤维转化，并表达α-SMA，产生大量的ECM[11]，因此，α-SMA常作为HSC活化的标志；TGF-β1被认为是促纤维化作用最强的因子之一，促进ECM的合成，加速肝纤维化进程[12-14]。

有研究表明[15]，调控TGF-β表达可逆转肝纤维化。

因此，抑制HSC增殖、诱导HSC凋亡是治疗肝纤维化的
重要策略。

本实验证实，满天星异荭草苷能显著下调肝组织α-SMA和TGF-β1的表达，提示满天星异荭草苷诱导肝细胞凋亡的机制可能与抑制α-SMA和TGF-β1的表达有关。

本次实验研究表明，满天星异荭草苷能有效的抑制脂质过氧化反应、减轻肝组织病理损伤、促进肝星状细胞凋亡等，提示满天星异荭草苷对乙醇引起的肝纤维化具有明显抑制作用，是治疗酒精性肝纤维化的一种非常有潜在价值的新药，值得进一步研究。

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Protective effect of isoorientin on alcohol-induced hepatic fibrosis in rats
CHEN Yong-xin1，HUANG Quan-fang2，LIN Xing1，WEI Jin-bin1*
（1、Guangxi Medical University，Nanning 530021，China；
2、The First Affiliated Hospital of Guangxi Traditional Chinese Medicine University，Nanning 530023，China）
[Abstract] Objective：To observe the effect and mechanism of isoorientin from Gypsophila elegans on alcohol-induced hepatic fibrosis in rats、Method：ninety healthy male Wistar rats were randomly divided into six groups：the normal control group，the model control group，the colchicines group （positive control，1、0 mg·kg-1·d-1），the high，middle and low-dose isoorientin groups （20，50，100 mg·kg-1·d-1）、The normal control group received normal saline，while other groups received alcohol to cause hepatic fibrosis、After 24-weeks treatment，the alanine aminotransferase （ALT），aspartate aminotransferase （AST），Interleukin 6 （IL-6），tumor necrosis factor-α （TNF-α），hyaluronic acid （HA），laminin （LN），type III precollagen （PCIII），hydroxyproline （Hyp），Myeloperoxidase （MPO），malondialdehyde （MDA），superoxide dismutase （SOD），glutathione peroxidase （GSH-Px）were assayed according to the manufacturer′s instructions，the α-SMA and TGF-β1 were detected by wester n blotting，and the histopathological changes was observed by H&E staining、Result：Isoorientin could improve the liver function by decreasing the activity of ALT，AST，IL-6，TNF-α，MDA，MPO，HA，LN，PCIII and Hyp （P＜0、05），increasing the activity of SOD and GSH-Px （P＜0、05），and reducing the expression of α-SMA and TGF-β1 （P＜0、05）、In addition，the high and middle-dose isoorientin groups showed more remarkable effect、Conclusion：Isoorientin from G、elegans can protect hepatic fibrosis
induced by alcohol、
[Key words] Gypsophila elegans；isoorientin；alcohol；hepatic fibrosis doi：10.4268/cjcmm20132124。