专题2.2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数讲-2016-20

一、筛选菌株
【知识点讲解】
1.实验室微生物的筛选原理
人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、pH等），同时抑制或阻止其他微生物生长。

2.土壤中分解尿素的细菌的分离原理
土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶，这种物质在把尿素分解成无机物的过程中起到催化作用。

①选择培养基的成分：尿素作为唯一的氮源
②鉴定方法：在培养基中加入酚红指示剂，若指示剂变红，pH升高，说明细菌能分解尿素
3.选择培养基
允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称做选择培养基。

加入青霉素的培养基：细菌不生长，酵母菌、霉菌等真菌能生长。

不加含碳有机物的无碳培养基：分离自养型微生物。

【典型例题】
选择培养基是根据某一种或某一类微生物的特殊营养要求或对一些物理、化学抗性而设计的培养基。

利用这种培养基可以将所需要的微生物从混杂的微生物中分离出来。

为选择酵母菌和硝化细菌，应选用的培养基分别为()
A.伊红美蓝培养基、含青霉素培养基
B.含青霉素培养基、含氨的无机培养基
C.含氨的无机培养基、含青霉素培养基
D.含青霉素培养基、伊红美蓝培养基
【答案】B
【方法点拨】选择培养基的制作方法
(1)在培养基全部营养成分具备的前提下，加入物质：依据某些微生物对某些物质的抗性，在培养基中加入某些物质，以抑制不需要的微生物，促进所需要的微生物生长，如培养基中
加入高浓度食盐时可抑制多种细菌的生长，但不影响金黄色葡萄球菌的生长，从而可将该菌分离出来；而在培养基中加入青霉素时可抑制细菌、放线菌的生长，从而分离得到酵母菌和霉菌。

(2)通过改变培养基的营养成分达到分离微生物的目的：培养基中缺乏氮源时，可分离自生固氮微生物，非自生固氮微生物因缺乏氮源而无法生存；培养基中若缺乏有机碳源则异养微生物无法生存，而自养微生物可利用空气中的CO2制造有机物生存。

(3)利用培养基的特定化学成分分离特定微生物：如当石油是唯一碳源时，可抑制不能利用石油的微生物的生长，使能够利用石油的微生物生存，从而分离出能消除石油污染的微生物。

(4)通过某些特殊环境分离微生物：如在高盐环境中可分离耐盐菌，其他菌在盐浓度高时易失水而不能生存；在高温环境中可分离得到耐高温的微生物，其他微生物在高温环境中因酶失活而无法生存。

【变式训练】
苯酚是工业生产排放的有毒污染物质，自然界中存在着降解苯酚的微生物。

某工厂产生的废水中含有苯酚，为了降解废水中的苯酚，研究人员从土壤中筛选获得了只能降解利用苯酚的细菌菌株，筛选的主要步骤如图所示，①为土壤样品。

请回答下列问题：
(1)②中培养目的菌株的选择培养基中应加入________作为碳源，②中不同浓度碳源的培养基________(A.影响；B.不影响)细菌的数量，如果要测定②中活细菌数量，常采用________ ____________法。

(2)④为对照，微生物在④中不生长，在⑤中生长，④与⑤培养基的主要区别在于
________________________________________________________________________；
使用______________________________法可以在⑥上获得单菌落。

采用固体平板培养细菌时进行倒置培养的原因是__________________________________________________________ ______________________________________________________________________________。

(3)实验过程中如何防止其他微生物的污染？
________________________________________________________________________。

【答案】(1)苯酚 A
稀释涂布平板(2)④的培养基没有加入苯酚作为碳源，⑤的培养基加入了苯酚作为碳源
稀释涂布平板法或平板划线
防止冷凝后形成的水珠滴落在培养基上污染培养基(3)培养基灭菌，接种环境灭菌，接种过程进行无菌操作
二、统计菌落数目的方法
【知识点讲解】
（1）显微镜直接计数法：
①原理：利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量。

②方法：用计数板计数。

③缺点：不能区分死菌与活菌。

（2）间接计数法(活菌计数法)：
①原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。

②计算公式：每克样品中的菌株数＝(C÷V)×M，其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)，M代表稀释倍数。

③操作：设置重复组，增强实验的说服力与准确性。

同时为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数。

【典型例题】
某同学在稀释倍数为106的培养基上测得平板上的菌落数的平均值为234，那么每毫升样品中菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1 mL）（）
A.2.34×108
B.2.34×109
C.234
D.23.4
【答案】B
【变式训练】
两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。

从对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。

1、甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230。

2、乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。

你认为这两位同学的作法正确吗？如果有问题，错在哪？
甲：没有重复实验（至少涂布3个平板）。

乙：A组结果误差过大，不应用于计算平均值。

【方法点拨】稀释涂布平板法计算注意事项
①为了保证结果准确，一般选择菌落数在30——300的平板上进行计数。

②为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或三个以上的平皿中，经涂布，培养计算出菌落平均数。

③统计的菌落往往比活菌的实际数目低。

④涂布平板法所选择的稀释度很重要，一般以三个稀释度中的第二个稀释度所出现的平均菌落数在50个左右为最好。

三、实验设计
【知识点讲解】
1.土壤取样
从肥沃、湿润的土壤中取样。

先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。

2.制备培养基
牛肉膏蛋白胨培养基作为对照，判断选择培养基是否起到选择作用。

3.样品稀释、取样涂布
因为土壤中各类微生物的数量是不同的，为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。

注意：由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此选择了一个较为宽泛的范围：稀释倍数为103～107。

4.微生物的培养、观察并记录结果
将涂布好的培养皿放在30℃下培养。

比较牛肉膏培养基和选择培养基中菌落的数量、形态等，并做好记录。

不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间
5.细菌的计数
当菌落数目稳定时，选取菌落数在30~300的平板进行计数。

在同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。

【典型例题】
下列关于“检测土壤中细菌总数”实验操作的叙述中，不正确的是()
A.用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基，经高压蒸汽灭菌后倒平板
B.取104、105、106倍的土壤稀释液和无菌水各0.1 mL涂布到不同平板上培养
C.将实验组和对照组平板倒置，37 ℃恒温培养24～48小时
D.确定对照组无菌后，选择菌落数在300以上的平板进行计数【答案】D。