2株番茄早疫病拮抗菌的分离筛选与拮抗作用研究

新疆农业科学2017,54(8) :1496 -1504
Xinjiang Agricultural Sciences
doi：10.6048/j.issn.1001 -4330.2017.08.016
2株番茄早疫病拮抗菌的分离筛选
与拮抗作用研究
杨蓉\杨文琦\张崢2,詹发强\侯敏\侯新强\
包慧芳\王宁\龙宣杞1
(1.新疆农业科学院微生物应用研究所，乌鲁木齐830091 ;2.新疆大学生命科学与技术学院，乌鲁木齐830046)
摘要：【目的】从新疆昌吉、焉耆、喀什、乌苏、吉木萨尔五地多年种植番茄的农田土壤样品，进行拮抗菌的筛 选，选取对番前早疫病菌(■s oZarai)有具有较强抑菌活性的菌株。

【方法】采用平板分离培养法从加工 番茄的根际土壤中分离拮抗菌，平板对峙培养实验进行初筛和复筛，根据培养特征、菌体形态及16S rDNA系统发育分析进行初步鉴定，显微观察法观察拮抗菌对病原菌菌丝生长的拮抗作用，盆栽法测定相对防效。

【结果】共分离得到90株细菌菌株，初筛得到对番茄早疫病菌有明显拮抗作用的细菌，复筛选取2株抑制作 用显著的细菌(J2 -2、J2 -4)，并初步鉴定为芽孢杆菌属（S ad Z h)的萎缩芽孢杆菌Wrop/mem)和枯 草芽孢杆菌(S a c a h的近似种;显微镜下观察到2株拮抗菌的发酵液对番茄早疫病菌丝有明显的致畸作用;在盆栽试验中，拮抗菌发酵液对番茄早疫病菌的相对防效可达到35%以上。

【结论】筛选到的2株拮 抗菌对番茄早疫病菌表现出较好的拮抗作用，对番茄早期病害的生物防治具有一定的应用价值。

关键词:番茄早疫病;分离;筛选;鉴定
中图分类号:S188 文献标识码:A文章编号=1001 -4330(2017)08 -1496 -09
〇引言
【研究意义】番茄种植过程中常见的真菌性病害番茄早疫病、晚疫病、番茄灰霉病、叶霉病、番 煎枯萎病等，其中番煎早疫病[Wteraaria •s o/ara；(Ellis et Martin)Jones et Grout .](也称为轮纹
病），较为常见，在番茄的苗期和成株期发病，危 害较大，严重影响到番茄光合产物的积累以及果实的形成，给人们的生产和健康造成危害。

番茄 早疫病的防治措施一般以化学农药为主，对土壤生态结构造成破坏，存在环境污染和农药残留问题，而生物防治具有无毒、高效、成本低等优点，成 为防治番茄早疫病的新途径和研究热点。

研究从 根际土壤中筛选拮抗菌，为番茄早疫病的生物防治提供材料，以期减少农药的使用量，提高番茄品 质。

【前人研究进展】番茄早疫病的病原菌为茄链格抱菌[I EllMartin).sorauer],属半知菌亚门链格孢属真菌，能引起多种作物病害，如 马铃薯早疫病、甘蓝黑斑病、苹果斑点落叶病、梨 黑斑病、梨黑斑病烟草赤星病等。

有关采用拮抗菌来进行各种植物病害的生物防治比较常见，王 杏芽[1]等针对甜瓜细菌性斑点病和甜瓜角斑病筛选到对有明显拮抗作用的拮抗菌;刘淑芳[2]等 筛选到两株的诘抗菌表现出较好的对苹果炭疽病 原菌的诘抗作用;李伟杰等[3]分离筛选得到的拮抗细菌对番茄青枯病有拮抗作用；张洪涛等[4]筛 选出高抗棉花黄萎病的细菌。

研究表明，利用拮 抗菌进行植物病害的生物防治的机理主要是通过
收稿日期（R e c e i v e d):2017 -04 -08
基金项目：新疆维吾尔自治区科技成果转化专项资金项目“设施农业多价复合菌剂的示范推广”（201554113);新疆农业科学院青年基金项目“新疆加工番茄早疫病拮抗菌的分离与筛选”（x j n k q -2015027)
作者简介:杨蓉（1981 -)，女，新疆人，助理研究员，硕士，研究方向为土壤微生物，（E - m a i l)L i n g x u a n2519@ 126. c o m
通讯作者:龙宣杞（1969 -)，女，四川人，研究员，硕士生导师，研究方向为土壤微生物与微生态学，（E - m a i l) l o n g x q_x j@ sina. c o m
杨蓉等:2株番恭早疫病拮抗菌的分离筛选与拮抗作用研究1497 8期
竞争、拮抗，交叉保护、寄生或捕食和诱导植物产 生抗性等途径[5]。

不同的微生物对病原菌的拮 抗机制有所不同，即使是同一种微生物，其作用机 制也可能同时有很多种。

如芽孢杆菌就有竞争位 点、拮抗病原菌和诱导植物抗性等抑菌机制[6]，同时有些微生物还能够促进植物生长或者提高营 养利用率。

【本研究切入点】新疆土壤类型多样，光热资源丰富，是世界上适宜种植番茄的地区之 一。

因此，利用资源优势，新疆番茄加工业迅速发 展，加工番茄种植面积逐年扩大，成为中国番茄加 工业主要的生产地区，总产量占到世界产量的 9.6%,番茄酱也成为新疆重要的出口创汇产品[7]，中国成为仅次于美国、意大利的世界上第 三个番茄酱生产及出口大国[8]。

但随着加工番 茄连年种植，多种土传性病害对作物的危害曰益 加重[9]，其中番茄早疫病引起落花、落叶、落果和 断枝，对加工番茄的产量影响很大，严重时甚至减 产50%以上[1°]，而且病果内含有的毒素能够导 致人患血液病，危及健康[11]。

研究筛选对番茄早 疫病菌具有较强抑菌特性菌株。

【拟解决的关键 问题】研究对采自新疆昌吉、焉耆、喀什、乌苏、吉 木萨尔五个地方多年种植番茄的农田土壤样品，进行诘抗菌的筛选，选取具有较强抑菌活性的菌 株，并采用形态特征及16S rDNA序列测定及系 统发育分析方法对筛选得到的菌株进行初步鉴 定;分析诘抗菌发酵液对番煎早疫病菌的诘抗作 用，为进一步的应用研究奠定基础，为番煎早疫病 的生物防治提供新的选择。

1材料与方法
1. 1材料
1.1.1 病原菌
由中国农业微生物菌种保藏中心（ACCC)提 供的番煎早疫病菌(Meraaria •s o/araO。

1.1.2采集根际土样
2016年6月，在昌吉、焉耆、喀什、乌苏、吉木 萨尔的加工番茄种植地中（C、J、Y、W、K分别代 表昌吉、吉木萨尔、焉耆、乌苏、喀什土样），采集 幼苗根系和根际土，牛皮纸袋保存后，带回试验 室，用无菌剪刀剪取番茄幼苗根部，放入盛有100 mL无菌水的500 mL三角瓶中，室温下以180 r/
min的转速震荡30 min,制成均匀的土壤悬液。

1.1.3筛选培养基[12]
马铃薯葡萄糖培养基（PDA),细菌培养基 (LB)；
1.1.4仪器与试剂
MSSPX- 250 型培养箱，SW - CJ - IF B 型
双人单面净化工作台，MLS -3020高压蒸汽灭菌 锅，E360K离心机，HWY - 100恒温振荡培养仪。

Bio- Rad Mode200/2. 0 型电泳仪，Eppendorf No: 5345型PCR仪，United - Bio型凝胶成像仪，TaKaRa Biotechnology的PCR预混液，其余试剂选 用分析纯试剂。

1.2方法
1.2.1拮抗菌的分离和筛选
1.2.1.1 梯度稀释分离法
先采用梯度稀释分离法获得根际土壤悬液的
稀释液:将番茄根际土样10 g放入90 mL灭菌水 的三角瓶中，振荡20 m in后静置20 ~ 30 s，即为 10稀释液，然后通过梯度法分别稀释成10到 1CT6的稀释液。

再采用平板涂布法进行分离培养: 各取 0.1 mL 的稀释液（1〇-3、1〇-4、1〇-5、1〇-6)分别涂布于PDA和LB培养基上，分别于32和37°C 培养，待培养基上长出分离物，对长出的菌落分离 纯化进行划线，最后划线斜面保存备用。

1.2.1.2 平板对峙法[13]筛选拮抗菌
采用平板对峙法进行筛选:番茄早疫病菌经 PDA培养基斜面活化后备用。

将分离出的拮抗
菌株用LB液体培养基振荡培养后，制成菌悬液，于PDA培养基周围4点接种4 ，32°C下继续培养1d,待四周菌落长至1cm左右,在平板盖上加 入三氯甲烷1mL,将平板放置4°C冰箱过夜。

次 曰取出平板，用打孔器制备番煎早疫病菌的菌饼，置于上述的PDA培养基平板中央，并撤换平板 盖。

放入28°C培养5 d。

根据有无抑菌圈及抑菌 带的大小，判断其拮抗效果，初选得到拮抗菌株，并对其进行二次对峙实验，从中筛选出拮抗能力 较强的菌株以备后续实验。

1.2.2拮抗菌的形态学观察
将菌株在LB固体培养基平板上培养2 d,进 行形态学观察。

1.2.2.1形态学观察
菌落形状、颜色、透明度、边缘形状、生长培养 形状等特征。

1498新疆农业科学54卷
1.2.2. 2 镜检
准备干净的载玻片，滴一滴无菌水，将平板上 的单菌落挑少量涂在载玻片上，使其完全涂开，然 后从火焰上干燥固定，用结晶紫染液染1mm,水 洗2 ~3次，晾干。

显微镜油镜下观察菌体的形 态、是否有芽孢。

1.2.3 优势PGPR菌的16S rDNA序列扩增与分 析
选择LB平板上培养2 d的少量单菌落，挑入 盛有25 +L无菌水的离心管中，100°C下8 ~10 min,迅速置冰浴中5 min, 10 000 r/m in离心处理
5 mm,4°C保存，上清液备用[14]〇
根据细菌的16S rDNA序列设计PCR扩增引 物，正向弓丨物为:5〃-TCCTCCGCT TATTGATATGC -3)M31t^:5tCA A A CTTG GTCATTA GAG-G A-3；
PCR扩增反应体系为50 #，组分如下：24 pL premix Taq,引物各1+L,模板2 +L,无菌水 22 pL。

扩增条件为：94°C 4〇^;94丈 30 S，55°C 90 s,72°C 30 s,循环为 30 个;72°C 7 min。

得到 的PCR扩增产物（约1 500 b P)经琼脂糖凝胶 (1%)电泳分离，然后直接进行双向测序，测序由 上海生物工程技术服务有限公司合成。

将测序得到的16S rDNA序列与GenBank数 据库中的核苷酸序列进行BLAST分析，获取相近 的16S rDNA序列，采用ClustalX软件和MEGA 4. 1中的Neighbor- joining法来构建诘抗菌的系 统进化树。

1.2.4拮抗菌发酵液对番恭早疫病菌的抑制作用[15]部，然后放入早疫病菌悬液中30 min,移栽到盆 中，再灌根加入20 mL供试拮抗菌的发酵液。

每 个处理设10个重复，空白对照为清水灌根处理。

在25°C下保湿培养48 h后，观察发病情况，7 d 后调查发病率和病情，计算病情指数和相对防效。

病情调查中采用十字测量法测量每个病斑直
径，以病斑大小作为病害分级标准。

病害分级标
准如下：
〇级:叶片上无病斑；
1级:病斑面积占叶片的1/4以下；
2级:病斑面积占叶片的1/4 -1/2;
3级:病斑面积占叶片的1/2 -3/4,近一半 小叶枯死；
4级:病斑面积占叶片的3/4以上，一半以上
或全部小叶枯死；
病情指数=[E(各级病株数X对应发病级 数)/调查总株数x最高调查发病级数]x100。

相对防效（％)=[(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数]x100%。

2结果与分析
2.1拮抗菌的分离
经平皿培养，得到可分离细菌。

根据菌株的
分离来源对菌株进行编号，从中得到细菌90株: Cl -1,C1 -2,C1 -3,Cl -4,Cl -5,Cl -6,Cl - 7,Cl -8,C2 -1,C2 -2,C2 -3,C2 -4,C2 -5,C2 -6、C2-7、C2-8、J1 -1、J1 -2、J1 -3、J1 -4、J1 -5、J1 -6、J1 -7、J1 -8、J2 -1、J2 -2、J2 -3、J2 -4、J2-5、J2-6、J2-7、J2-8、Y1 -1、Y1 -2、Y1 -3、Y1 -4、Y1 -5、Y1 -6、Y1 -7、Y1 -8、Y2 -1、
1.2.4.1 对病菌菌丝抑制作用的显微观察
将番茄早疫病菌点接在PDA平板中央，培养 2 d,在平皿四周等距离(2. 5 cm)处放置含有拮抗 菌株发酵液的滤纸片，28°C恒温培养6 d,镊取早 疫病菌菌落边缘的菌丝于在载玻片上，在显微镜 下观察其菌丝的形态变化并拍照。

1.2.4. 2 盆栽试验测定防效
对于经过初筛和复筛得到的1 -2株高效的 拮抗菌，采用盆栽试验法测定其拮抗菌株发酵液 对番煎早疫病的防治作用。

在装土的营养钵中播 种加工番茄种子（市售），当幼苗长至4 ~5片真叶时，取生长一致的植株，用无菌剪刀损伤幼苗根Y2 -2,Y2 -3,Y2 -4,Y2 -5,Y2 -6,Y2 -7,Y2 -8、Y3 -1、Y3 -2、Y3 -3、Y3 -4、Y3 -5、Y3 -6、Y3 -7、Y3 -8、W1 - 1、W1 -2、W1 -3、W1 -4、
W1 -5,W1 -6,W1 -7,W1 -8,W2 -1,W2 -2, W2 -3、W2 -4、W2 -5、W2 -6、W2 -7、W2 -8、K1 -1、K1 -2、K1 -3、K1 -4、K1 -5、K1 -6、K1 -7、K1 -8、K2 -1、K2 -2、K2 -3、K2 -4、K2 -5、K2 -6JC2 -7 JC2 -8〇
2.2拮抗细菌筛选
2.2.1 拮抗细菌初筛
从番茄根际土样中共分离出90株细菌，采用 平板对峙法，根据有无抑菌圈判断其是否具有拮
杨蓉等:2株番恭早疫病拮抗菌的分离筛选与拮抗作用研究
1499
8期抗作用，初步筛选出对番茄早疫病菌具有一定诘 抗能力的菌株。

图1
图1平板对峙试验初筛
Fig . 1 Paired culture for preliminary screening
2.2.2
拮抗细菌复筛
对具有诘抗作用的菌株进行二次对峙实验， 筛选出诘抗能力较强的菌株以备后续实验。

复筛 选取2株具有良好诘抗番茄早疫病菌作用的细菌 分离物，分别为J 2 - 2和J 2 - 4，培养5d
其能够明
显地抑制番茄早疫病菌菌丝的生长，经多次实验 验证两株菌的抑菌效果较为稳定。

图2 2.3菌落形态特征
复筛得到的诘抗菌菌株的菌落形态特征。

表 1，图3
图2平板对峙试验复筛
Fig . 2 Paired culture for second screening
表1拮抗菌的培养特征及细胞形态
Table 1 Morphology of the colony and cell of antagonistic bacteria
菌株
菌落特性及细胞形态
菌落中小型，呈不规则圆形，边缘不整齐，折皱，表面干燥不光滑，白色菌落，菌落直径1 - 3
m m
，菌体杆状，大量芽孢，芽
孢中生。

菌体中小型，圆形，边缘矫正器，有环状凸起，中间凹陷，表面平滑，乳白色，菌落直径0.5 ~3 m
m
，菌体杆状，有芽孢，芽
孢中生。

1500新疆农业科学54卷
图3显微镜下的菌体形态
Fig. 3 Morphology of bacteria cell under microscope
2.4 PCR扩增及系统发育分析
菌株J2 - 2和J2 - 4 16S rDNA PCR研究表明，扩增条带片段大小约为1 600 bp，与预计大小 相当，扩增的样品整齐度较高…目标条带清晰;无杂带。

对所筛选的菌株J2 - 2和J2 - 4进行lf)S rD-NA基因序列分析;结果显示同属于芽孢杆菌属
_(Saci&M)在EZbiwjloud中进行检索，利用MEGA5. 0软件对菌株16S i'DNA序列跟同源性较
_.的几株:菌株的核酸序列:进行Neighbor- joining 法构建进化树（图5 )。

结果表明，J2 - 2和J2 - 4 菌株与芽孢杆菌属（Ri—)的序列同源性达到 99.9%。

因此，将J2 -2和J2 -4初步鉴定为萎 華，芽抱杆賀(afrop/iaews)和栋亭蔡抱杆菌(Bacillus subtilis)。

麗 4
2.5拮抗菌发酵液对番茄早疫病菌的抑制作
用[IS]
从拮抗细歯与早疫病病菌对峙的平板中抑菌 圈边缘挑取病菌菌丝，观察发现挑出的菌丝，发现 其在形态I发生了明显的变化，菌丝多处都出现 了溢缩，破裂的现象，有的部位还发生了畸变。

扭 曲变形、变粗、菌丝严重交联并产生卵形或近圆形 的厚垣饱子等现象,说明拮抗菌发酵液中具有抗 菌活性成分，对病菌的菌丝有致畸作用s对照组没有变化。

图6
通过盆栽试验，测定出拮抗菌发酵液对病情 的相对防效达到35%以上s表2,图7
图4 菌落16s rDNA PCR结果
(l：J2-2,2：J2-4)
Fig. 4 The result of 16S rDNA PCR of colony
(1：J2-2, 2：J2-4)
J2-2
Bacillus atrophaeus sub sp.
1 Bacillus subtilis sub sp.
—i—0.0015
—I—
O.CO lO
—I—
05
—I
0.0000
图5 J2 -2和J2 -4 16SrDNA基因序列进化树Fig. 5 16S rDNA cladogram of J2 -2
and J2 -4
图6拮抗菌发酵液对番茄早疫病菌菌丝的影响
Fig.6 The effect of fermentation broth of antagonistic bacteria on A.solani mycelium
表2拮抗菌发酵液对番茄早疫病的防效作用（盆栽试验）
Table2 The control effect of fermentation broth of antagonistic bacteria on A.solani ______________________________(pot incubation test)______________________________
处理病情指数防治效果/%
Treated Disease indexes Efficacy
J2-2 5. 17235.4
J2-4 4. 82839.65
J2-4C K J2-2C K
图7盆栽试验
Fig.7 Pot incubation test
3 讨论
3.1在我国的新疆、宁夏和内蒙古等加工番茄 主产区，加工番茄早疫病普遍发生，该病在番茄上 的发病率达到30%，严重时可以达到50%以上，造成很严重的经济损失[1°]。

而且病果内含有的 毒素能够导致人患血液病，危及健康[11]。

番茄早 疫病的危害十分严重，迫切需要高效和安全的防 治措施，特别是生物防治措施，如利用诘抗菌来进 行防治。

3.2诘抗菌中芽孢杆菌在植物病害生物防治方 面的应用十分广泛，因产生内生芽孢[16]，易于繁 殖，与别的诘抗菌相比，芽孢杆菌抗逆性强，在土 壤中的定殖能力强，适应环境能力强，对于诘抗菌制剂的实际生产有重要意义，具有很大的开发利 用价值。

马平[17]等分离得到的枯草芽孢杆菌NCD- 2，在温室和田间中对番茄早疫病的防治效
果显著，田间防效达70%以上。

研究对从新疆不 同区域的土样中分离90株细菌，经过初筛和复 筛，得到2株诘抗能力强的菌株，经过初步鉴定为 萎缩芽抱杆菌(■SacZ M w.s afrop/iaew-s)和枯草芽抱杆 菌（），在盆栽试验中，对番茄早疫 病其发酵液表现出了较好的防效，其价值期待进 一步深人研究。

研究从本地生境中分离得到的诘 抗菌，适应本地的生长环境及气候特点，对于防治 本地的番茄早期病害、提高作物产量、同时减少农 药使用量以及构建良好的生态环境具有积极的作
用。

1502新疆农业科学54卷
3.3研究中的芽孢杆菌发酵液对于番茄早疫病 的抑菌效果较好，但模拟对峙实验只针对植物体 外，拮抗菌在自然环境下的拮抗能力能否持续? 能否在土壤中定植？尚需要开展进一步的应用研 究。

4 结论
4.1实验中分离得到对番茄早疫病的拮抗作用 的细菌90株，经过复筛，获得拮抗能力较高的菌 株2株，初步鉴定为萎缩芽孢杆菌（BaciWus afro-_p/iaewj)和枯草芽抱杆菌似/^化）。

4.2对拮抗菌发酵液的抑菌作用进行了观察和 测定。

显微观察发现，拮抗菌和病原菌在平板上 共培养时，病菌的菌丝从形态上发生了明显的变 化，菌丝多处都出现了溢缩，破裂的现象，有的部 位还发生了畸变，如变粗、扭曲变形、菌丝严重交 联并产生卵形或近圆形的厚垣孢子等现象，说明 拮抗菌发酵液中具有抗菌活性成分，对病菌的菌 丝有致畸作用。

盆栽试验表明，对于早疫病菌胁 迫下的番茄幼苗，拮抗菌发酵液的相对防效达到 35%以上。

4.3拮抗菌发酵液在盆栽试验防治效果比较好，但其在田间生产中的实际表现还需要做进一 步的验证试验和应用研究。

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1504新疆农业科学54卷Isolation and Screening for 2 Stains of Antagonistic Bacteria against Alternaria solani of Tomato and Study on Antagonistic Effect
YANG Rong1, YANG Wen - qi1, ZHANG Zheng2 ,ZHAN Fa - qiang1 ,HOU Min1 ,HOUXin - qiang1,
BAOHui - fang1, WANG - Ning1, LONG Xuan - qi1
(1. Institute of Microorganism Application, Xinjiang Academy of Agricultural Sciences , Urumqi 830091 ,
China；2. College of Life Sciences & Technology y Xinjiang University, Urumqi 名3QQ46，China)
Abstract:【Objective】Screening for bacteria against4以eniaha so/anio tomato from rhizosphere of pro­cessing tomato.【Method】Isolating antagonistic bacteriafrom rhizosphere of processing tomatoby culture on me­dium plate, preliminary screening and second screening are carried on by paired culture, preliminary identifi­cation is based on morphological characteristic, phylogenetic analysis of 16S rDNA, antagonistic effect of fer­mentation broth against mycelium ofA. solani is observed under microscope, relative control effect of fermenta­tion brothof antagonistic bacteria is observed by pot incubation test.【Result]90trains of antagonisticbacteria have been isolated,from them, 3 strainsofbacteriahave been screened by preliminary screening while 2 strains by second screening with obvious antagonistic effect (J2 - 2, J2 -4) , and then the two stains were prelimina­ry identified as allied species oiBacillus atrophaeus andBacillus subtilis, teratogenic effect of fermentation brothagainst pathogenic mycelium has been observed under microscope, the relative control effect of fermenta­tion broth has been determined above 35% in pot incubation test. [Conclusion]The result shows that the two isolates with significant antagonistic effect \oA. solani could provide potential solution for biological control of early blighttomato.
Key words：Alternaria solani (tomato) ; isolation；screening；identification
S u p p o r t e d b y：S p e c i a l f u n d s for the t ran sformation of scientific a n d t e c h nological a c h i e v e m e n t s of Xi n j i a n g(201554113)；D e m o n s t r a t i o n a n d E x­tensio n o n M u l t i p l e B a c t e r i a Pre p a r a t i o n in Facility A g r i c u l t u r e； A c a d e m y of Agricultural S c i e n c e s F u n d for Y o n g Scientists F u n d( x j n k q-2015027),Isolation a n d S c r e e n i n g of A nta g o n i s t i c Bacteri aa ga in st Alternariasolani of P r o c e s s i n g T o m a t o in Xinjiang.
C o r r e s p o n d i n g a u t h o r：L O N G X u a n - qi( 1969 - ) , , ( E - m a i l)l o n g x q_x j@ sina. c o m。