吸附实验初稿

大孔吸附树脂是以苯乙烯和丙酸酯为单体,加入乙烯苯为交联剂,甲苯、二甲苯为致孔剂,它们相互交联聚合形成了多孔骨架结构。

树脂一般为白色的球状颗粒,粒度为20～60 目,是一类含离子交换集团的交联聚合物,它的理化性质稳定,不溶于酸、碱及有机溶剂,不受无机盐类及强离子低分子化合物的影响。

树脂吸附作用是依靠它和被吸附的分子(吸附质) 之间的范德华引力,通过它巨大的比表面进行物理吸附而工作,使有机化合物根据有吸附力及其分子量大小可以经一定溶剂洗脱分开而达到分离、纯化、除杂、浓缩等不同目的。

第二章大孔吸附树脂对巴戟天多糖提取液脱色的静态吸附实验
曲线的制作和最大吸收波长的确定
（1）脱色效果及最大吸收波长的确定
巴戟天多糖样品溶液（50mg/mL）的配制：准确称取巴戟天多糖粗品5.0111g，置于100mL容量瓶中，用纯净水溶解，超声助溶。

待完全溶解后定容，摇匀备用。

湿法装柱：将大孔弱碱性丙烯酸系阴离子交换树脂D941用少量乙醇置于烧杯中浸泡，随后装入直径约1cm的层析柱（柱体积BV=30mL），再用80%~90%乙醇洗至流出液至无色，后用纯水洗至无醇味。

过柱：取约30mL上述样品液缓慢倒入层析柱中，弃除前30mL流出液（水），收集剩下的多糖流出液。

全波长扫描：将流出液与样品液在200nm~800nm波长下进行全波长扫描，比较脱色前后紫外吸收图谱的变化，确定最大吸收波长[23]。

（2）标准葡萄糖标准曲线的制备[24]
干燥葡萄糖：取标准葡萄糖，于真空干燥器中干燥约4h后，储存与棕色试剂瓶中，置于干燥皿中备用。

标准曲线的制备：准确称取干燥后的分析纯葡萄糖48mg，置于100mL容量瓶中，用蒸馏水定容，配置成0.48mg/mL的标准葡萄糖溶液。

从此标准葡萄糖溶液分别吸取1.0mL于2mL、5mL、10mL、20mL、25mL、50mL和100mL容量瓶中，用蒸馏水定容。

分别从定容后的葡萄糖溶液和原标准葡萄糖溶液中吸取1.0mL溶液于具塞试管中，依次加入0.5mL5%苯酚溶液，摇匀，再加入2.0mL浓硫
酸，迅速摇匀，置于恒温90℃水浴中加热10min，冷却至室温，于490nm测定吸光度。

以蒸馏水同法操作加等量5%苯酚和浓硫酸做空白。

以葡萄糖溶液的糖含量（mg/mL）为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线。

（3）牛血清蛋白标准曲线的制备[27]
准确称取牛血清蛋白（BSA）20.3mg，置于100mL容量瓶中，用蒸馏水定容，配置成0.203mg/mL的BSA溶液。

从此标准BSA 溶液分别吸取1.0mL于2mL、5mL、10mL、20mL、25mL、50mL和100mL容量瓶中，用蒸馏水定容。

分别从定容后的BSA溶液和原标准BSA溶液中吸取1.0mL溶液于具塞试管中，依次加入5.0mL考马斯亮蓝储备液，摇匀，常温下放置5min后，于590nm测定吸光度。

以蒸馏水同法操作加等量考马斯亮蓝液做空白。

后以BSA溶液浓度（mg/mL）为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线。

（4）糖醛酸标准曲线的制备（采用间羟联苯法）
溶液配制：精密称取半乳糖醛酸对照品，加蒸馏水制成浓度为1.0 mg/ mL的溶液，即得对照品储备溶液。

量取1、2、4、6、
10 mL对照品储备溶液定容至100mL，配制对照品系列浓度溶液。

称取巴戟多糖适量至250mL容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀，即得供试品溶液。

以新鲜配制的0.5％氢氧化钠溶液，配制0.15％间羟联苯溶液。

用浓硫酸配制0.0125 mol/L四硼酸钠-硫酸溶液。

检测波长：取对照品溶液与供试品溶液各1 mL，置于冰水浴中，分别加入四硼酸钠-硫酸溶液5 mL，摇匀，取出，沸水浴
5 min，冰水浴冷却，加入间羟联苯溶液100 μL，摇匀，室温静置30 min。

以蒸馏水同法制备空白对照溶液。

用紫外可见分光光度计在200～600 nm处扫描，观察最大吸收峰。

结果在520 nm处有最大吸收。

标准曲线：取系列对照品溶液，按（2）项下操作显色，并以蒸馏水作空白对照，在520 nm下测定吸收度值。

以浓度（mg/mL）
为横坐标，以吸收度值为纵坐标，制作标准曲线。

一、不同树脂种类对脱色效果的影响
实验仪器与材料
1.主要试剂
巴戟天多糖提取物，95%乙醇，葡萄糖标准品（AR），苯酚（AR），浓硫酸（AR，）
2.主要仪器
调速多用振荡器，双光束紫外可见分光光度计，水浴锅
3.树脂
DM130，D101，D152，D941 ，AB-8
表2-1 4种树脂的物理参数
Tab.2-1 Physical parameters of 4 resins
比表面积（m²/g）树脂型号树脂类型外观极性粒径（mm）/
粒度%（mm）
DM130 大孔吸附树脂乳白色弱极性0.3-1.25 ≥330
D101 大孔吸附树脂乳白色非极性0.3-1.25 ≥400
D152 离子交换树脂乳白色0.3-1.25
D941 离子交换树脂乳黄色0.3-1.25
实验方法
1.树脂的预处理
分别取适量DM130、D101、D152、D941装柱，用95%乙醇洗脱至流出液无色澄清。

取经上步经处理的树脂于蒸发皿中，于40℃水浴中蒸干乙醇，备用。

2.不同大孔树脂的饱和吸附
准确称取经除表面水分的4种大孔树脂0.5g分别置于25mL锥形瓶中，加入10mL 4.9685mg/mL巴戟天多糖溶液，用玻璃纸封口，将锥形瓶置于摇床振摇（110r/min，25℃），10h树脂饱和吸附后取出，过滤[29]。

3.显色与检测
（1）脱色率的测定
取适量巴戟天多糖溶液和上述经四种树脂吸附的多糖溶液，以蒸馏水为空白，于390nm波长下测定吸光度，计算树脂脱色率[30]。

其中，检测波长为390nm；A脱色前：巴戟天多糖溶液（4.9685mg/mL）吸光度；A脱色后：多糖溶液经树脂脱色后的吸光度。

（2）多糖保留率的测定
分别准确量取1.0mL葡萄糖标准品溶液（0.048mg/mL）、巴戟天多糖溶液（4.9685mg/mL）、四种树脂脱色后的多糖溶液于具塞试管中，加入0.5mL5%苯酚溶液，摇匀，再加入2.0mL浓硫酸，迅速摇匀，置于恒温90℃水浴中加热10min，冷却至室温，于490nm测定吸光度。

以蒸馏水同法操作加等量5%苯酚和浓硫酸做空白。

计算多糖损失率。

多糖保留率（%） = 1 - 多糖损失率（%） 其中，检测波长为490nm ；c ：多糖液浓度（mg/mL ）；A ：吸光度。

.
（3）脱蛋白率
分别准确吸取经不同树脂多糖流出液、标准牛血清蛋白溶液（0.0406mg/mL ）1.0mL 于具塞试管中，加入5.0mL 考马斯亮蓝 储备液，摇匀，常温下放置5min 后，于590nm 测定吸光度。

以蒸馏水同法操作加等量考马斯亮蓝液做空白。

计算脱蛋白率。

其中，吸光度A 值均在波长590nm 下测定；A 脱色前：多糖溶液经考马斯亮蓝显色前的吸光度值；A 脱色后：多糖溶液经树脂脱
色后经考马斯亮蓝显色的吸光度值。

（4）糖醛酸保留率的测定（采用间羟联苯法）
分别取适量脱色前已知含量供试品溶液、经不同树脂脱色后的巴戟天多糖溶液，，520 nm 处测定
吸收度值，计算加样回收率。

A A %1100%
A -=-
⨯脱色前脱色后
脱色前糖醛酸保留率（）（）
（5）成品得率
真空干燥后，计算脱色脱蛋白前后的干物，计算得率
%100%
m m m -=⨯前后
前成品得率（）
二、 树脂不同用量对脱色效果的影响
实验仪器与材料 主要试剂：巴戟天多糖提取物，葡萄糖标准品（AR ），苯酚（AR ），浓硫酸（AR ，） 树脂（根据上一步确定的最佳树脂）
主要仪器：调速多用振荡器，紫外可见分光光度计，水浴锅 实验方法
1. 不同用量的树脂的饱和吸附[35]
准确称取经除表面水分的D941离子交换树脂0.50g 、1.00g 、2.00 g 、3.00 g 、4.00 g 、5.00 g 、6.00 g 、7.00 g 分别置于25mL 锥形瓶 中，加入20mL 2.5mg/mL 巴戟天多糖溶液，用玻璃纸封口，将锥形瓶置于摇床振摇（110r/min ，25℃），10h 树脂饱和吸附后取出， 过滤。

2. 显色与检测 （1）脱色率
取适量巴戟天多糖溶液和上述经8种不同用量树脂吸附的多糖溶液，以蒸馏水为空白，于390nm 波长下测定吸光度，计算脱色 率，
绘制曲线。

其中，检测波长为390nm；A脱色前：巴戟天多糖溶液（2.5mg/mL）吸光度；A脱色后：多糖溶液经树脂脱色后的吸光度。

（2）多糖保留率
分别准确量取1.0mL葡萄糖标准品溶液（0.048mg/mL）、巴戟天多糖溶液（2.5mg/mL）、不同用量树脂脱色后的多糖溶液于具塞试管中，加入0.5mL5%苯酚溶液，摇匀，再加入2.0mL浓硫酸，迅速摇匀，置于恒温90℃水浴中加热10min，冷却至室温，于490nm 测定吸光度。

以蒸馏水同法操作加等量5%苯酚和浓硫酸做空白。

计算多糖损失率，绘制曲线。

多糖保留率（%）= 1 - 多糖损失率（%）
其中，检测波长为490nm；c：多糖液浓度（mg/mL）；A：吸光度。

（3）脱蛋白率
分别准确吸取不同量树脂吸附后的多糖流出液、标准牛血清蛋白溶液（0.0406mg/mL）1.0mL于具塞试管中，加入5.0mL考马斯亮蓝储备液，摇匀，常温下放置5min后，于590nm测定吸光度。

以蒸馏水同法操作加等量考马斯亮蓝液做空白。

计算脱蛋白率。

其中，吸光度A值均在波长590nm下测定；A脱色前：多糖溶液经考马斯亮蓝显色前的吸光度值；A脱色后：多糖溶液经树脂脱
色后经考马斯亮蓝显色的吸光度值。

（4）糖醛酸保留率的测定（采用间羟联苯法）
分别准确量取1.0mL 巴戟天多糖溶液（2.5mg/mL ）、不同用量树脂脱色后的多糖溶液，520 nm 处测定
吸收度值，计算加样回收率。

A A %1100%
A -=-⨯脱色前脱色后
脱色前糖醛酸保留率（）（）
（5）成品得率
真空干燥后，计算脱色脱蛋白前后的干物，计算得率
%100%
m m m -=⨯前后
前成品得率（）233
三、 不同温度对脱色效果的影响
（一） 实验仪器与材料 主要试剂：巴戟天多糖提取物，葡萄糖标准品（AR ），苯酚（AR ），浓硫酸（AR ）
主要仪器：可见分光光度计，水浴锅
树脂：(经以上实验确定的最佳树脂）
（二）实验方法
1.不同温度下树脂的饱和吸附[36]
准确称取8份经除表面水分的D941离子交换树脂5.00 g分别置于25mL锥形瓶中，加入20mL 2.5mg/mL巴戟天多糖溶液，用玻璃纸封口，将锥形瓶分别置于25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃和60℃，10h树脂饱和吸附后取出，过滤。

2.显色与检测
（1）脱色率
取适量巴戟天多糖溶液和上述8种经不同温度下吸附的多糖溶液，以蒸馏水为空白，于390nm波长下测定吸光度，计算脱色率，绘制曲线
其中，检测波长为390nm；A脱色前：巴戟天多糖溶液（2.5mg/mL）吸光度；A脱色后：多糖溶液经树脂脱色后的吸光度。

（2）多糖保留率
分别准确量取1.0mL葡萄糖标准品溶液（0.05mg/mL）、巴戟天多糖溶液（2.5mg/mL）、不同温度下吸附的多糖溶液于具塞试管中，加入0.5mL5%苯酚溶液，摇匀，再加入2.0mL浓硫酸，迅速摇匀，置于恒温90℃水浴中加热10min，冷却至室温，于490nm测
定吸光度。

以蒸馏水同法操作加等量5%苯酚和浓硫酸做空白。

计算多糖损失率，绘制曲线。

多糖保留率（%）= 1 - 多糖损失率（%）
其中，检测波长为490nm ；c ：多糖液浓度（mg/mL ）；A ：吸光度。

（3）脱蛋白率
准确吸取多糖流出液、标准牛血清蛋白溶液（0.0406mg/mL ）1.0mL 于具塞试管中，加入5.0mL 考马斯亮蓝储备液，摇匀，
常温下放置5min 后，于590nm 测定吸光度。

以蒸馏水同法操作加等量考马斯亮蓝液做空白。

计算脱蛋白率。

其中，吸光度A 值均在波长590nm 下测定；A 脱色前：多糖溶液经考马斯亮蓝显色前的吸光度值；A 脱色后：多糖溶液经树脂脱
色后经考马斯亮蓝显色的吸光度值。

（4）糖醛酸保留率的测定（采用间羟联苯法）
分别准确量取1.0mL 巴戟天多糖溶液（2.5mg/mL ）、不同温度下吸附后的多糖溶液，520 nm 处测定
吸收度值，计算加样回收率。

A A %1100%
A -=-⨯脱色前脱色后
脱色前糖醛酸保留率（）（）
1（5）成品得率
真空干燥后，计算脱色脱蛋白前后的干物，计算得率
%100%
m m m -=⨯前后
前成品得率（）
第三章 树脂（经以上实验确定的最佳树脂）对巴戟天多糖提取液脱色的动态工艺研究
根据上述的实验结果，后续实验均装柱50g D941离子交换树脂（柱体积1BV=30mL ），上样量为150mL 2.5mg/mL 巴戟天多糖溶液；树脂(经以上实验确定的最佳树脂）均经过乙醇和水洗脱或再生后烘干。

湿法搅拌下装入层析柱，树脂沉降后将水放出，用乙醇通过树脂层，洗至流出液呈透明为止，在用蒸馏水洗尽至中性并无醇味。

一、不同流速对动态吸附效果的影响 （一）实验仪器与材料 主要试剂：巴戟天多糖提取物，葡萄糖标准品（AR ），苯酚（AR ），浓硫酸（AR ，）
主要仪器：紫外可见分光光度计，水浴锅
树脂：(经以上实验确定的最佳树脂） （一） 实验方法
平行取树脂(经以上实验确定的最佳树脂）50g 五份按常规湿法装柱，上2.5mg/mL 巴戟天多糖溶液150mL ，分别调节流速为1 BV/h 、2 BV/h 、3 BV/h 、4 BV/h 、5BV/h ，收集1BV 以后的流出液。

按静态吸附实验的检测方法，测定吸光度，计算脱色率和多糖损失率，绘出曲线，确定最佳流速： 显色与检测
（1）脱色率
取适量巴戟天多糖溶液和上述5种经不同流速下吸附后的多糖溶液，以蒸馏水为空白，于390nm 波长下测定吸光度，计算脱色
率，
绘制曲线
其中，检测波长为390nm；A脱色前：巴戟天多糖溶液（2.5mg/mL）吸光度；A脱色后：多糖溶液经树脂脱色后的吸光度。

（2）多糖保留率
分别准确量取1.0mL葡萄糖标准品溶液（0.05mg/mL）、巴戟天多糖溶液（2.5mg/mL）、不同流速下吸附的多糖溶液于具塞试管中，加入0.5mL5%苯酚溶液，摇匀，再加入2.0mL浓硫酸，迅速摇匀，置于恒温90℃水浴中加热10min，冷却至室温，于490nm测定吸光度。

以蒸馏水同法操作加等量5%苯酚和浓硫酸做空白。

计算多糖损失率，绘制曲线。

多糖保留率（%）= 1 - 多糖损失率（%）
其中，检测波长为490nm；c：多糖液浓度（mg/mL）；A：吸光度。

（3）脱蛋白率
准确吸取经不同流速吸附后多糖流出液、标准牛血清蛋白溶液（0.0406mg/mL）1.0mL于具塞试管中，加入5.0mL考马斯亮蓝储备液，摇匀，常温下放置5min后，于590nm测定吸光度。

以蒸馏水同法操作加等量考马斯亮蓝液做空白。

计算脱蛋白率。

其中，吸光度A 值均在波长590nm 下测定；A 脱色前：多糖溶液经考马斯亮蓝显色前的吸光度值；A 脱色后：多糖溶液经树脂脱
色后经考马斯亮蓝显色的吸光度值。

（4）糖醛酸含量的测定（采用间羟联苯法）
分别准确量取1.0mL 巴戟天多糖溶液（2.5mg/mL ）、不同流速下吸附后的多糖溶液，520 nm 处测定
吸收度值，计算加样回收率。

A A %1100%
A -=-⨯脱色前脱色后
脱色前糖醛酸保留率（）（）
（5）成品得率
真空干燥后，计算脱色脱蛋白前后的干物，计算得率
%100%
m m m -=⨯前后
前成品得率（）
二、不同浓度对动态吸附效果的影响
实验仪器与材料
主要试剂：巴戟天多糖提取物，葡萄糖标准品（AR），苯酚（AR），浓硫酸（AR），
树脂：(经以上实验确定的最佳树脂）
主要仪器：紫外可见分光光度计，水浴锅，
实验方法
取*、*、*、*、*ml的巴戟天多糖溶液，分别加入5个的**ml容量瓶中,平行取离子交换树脂(经以上实验确定的最佳树脂）50g五份按常规湿法装柱，分别上上述不同浓度多糖溶液150mL，流速为2 BV/h，收集1BV以后的流出液。

按静态吸附实验的检测方法，测定吸光度，计算脱色率和多糖损失率，绘出曲线，确定最佳流速。

显色与检测
（1）脱色率
分别取适量的不同浓度的巴戟天多糖溶液和树脂吸附后的多糖溶液，以蒸馏水为空白，于390nm波长下测定吸光度，计算脱色率，绘制曲线
其中，检测波长为390nm；A脱色前：巴戟天多糖溶液（2.5mg/mL）吸光度；A脱色后：多糖溶液经树脂脱色后的吸光度。

（2）多糖保留率
分别准确量取1.0mL葡萄糖标准品溶液（0.05mg/mL）、不同浓度巴戟天多糖溶液（2.5mg/mL）、吸附后的多糖溶液于具塞试管中，加入0.5mL5%苯酚溶液，摇匀，再加入2.0mL浓硫酸，迅速摇匀，置于恒温90℃水浴中加热10min，冷却至室温，于490nm测定吸光度。

以蒸馏水同法操作加等量5%苯酚和浓硫酸做空白。

计算多糖损失率，绘制曲线。

多糖保留率（%） = 1 - 多糖损失率（%）
其中，检测波长为490nm ；c ：多糖液浓度（mg/mL ）；A ：吸光度。

（3）脱蛋白率
准确吸取不同浓度吸附前后的多糖流出液、标准牛血清蛋白溶液（0.0406mg/mL ）1.0mL 于具塞试管中，加入5.0mL 考马斯 亮蓝储备液，摇匀， 常温下放置5min 后，于590nm 测定吸光度。

以蒸馏水同法操作加等量考马斯亮蓝液做空白。

计算脱 蛋白率。

其中，吸光度A 值均在波长590nm 下测定；A 脱色前：多糖溶液经考马斯亮蓝显色前的吸光度值；A 脱色后：多糖溶液经树脂脱
色后经考马斯亮蓝显色的吸光度值。

（4）糖醛酸含量的测定（采用间羟联苯法）
分别准确量取1.0mL 不同浓度的巴戟天多糖溶液（2.5mg/mL ）和吸附后的多糖溶液，520 nm 处测定
吸收度值，计算加样回收率。

A A %1100%
A -=-⨯脱色前脱色后
脱色前糖醛酸保留率（）（）
（5）成品得率
真空干燥后，计算脱色脱蛋白前后的干物，计算得率
%100%
m m m -=⨯前后
前成品得率（）
第四章 与其他的脱色脱蛋白工艺的效果比较
一、根据以上实验确定的最佳树脂脱色脱蛋白工艺
原理：吸附树脂具有很好的吸附性能，它理化性质稳定，不溶于酸、碱及有机溶剂。

对有机物选择性好，不受无机盐类及强离子低分子化合物存在的影响。

可以通过物理吸附从水溶液中有选择地吸附有机物质。

糖类化合物分子是一类有机大分子，可由范德华力与大孔树脂产生吸附作用。

操作：取50g 离子交换树脂D941，按常规湿法装柱，上巴戟天多糖溶液150mL （2.5mg/mL ），不调节pH 值，流速为2 BV/h ，收集1BV 以后的流出液，备用。

根据各种方法处理后测定特定波长下的吸光度，计算相应的脱色率，脱蛋白率，多糖保留率，糖醛酸保留率，成品得率。

二、活性炭脱色脱蛋白工艺
原理：活性炭是黑色细微多孔性物质, 具有芳香环式的结构, 它靠范德华力将色素吸附到自身表面, 从而使有色物质脱色。

根据文献，（1）活性碳一般使用温度是75℃左右比较好；（2）活性炭脱色效果在水中最强，在强极溶剂中使用效果也不错，在非极性溶剂中效果较差；（3）一般情况下，在pH3-6条件下使用较好；（4）脱色时间一般为45min 。

操作：取5.0g 活性碳于150mL 锥形瓶中，加入100mL 巴戟天多糖溶液（2.5mg/mL ），于60℃水浴加热30min ，趁热抽滤，滤色备用。

根据各种方法处理后测定特定波长下的吸光度，计算相应的脱色率，脱蛋白率，多糖保留率，糖醛酸保留率，成品得率，并与树脂比较。

三、双氧水脱色脱蛋白工艺
原理：过氧化氢带有过氧键,容易因过氧键断裂生成过氧自由基，该自由基夺电子能力强，有强氧化性。

当过氧化氢等强氧化剂与色素作用时，有色物质的分子被氧化从而失去原有的颜色。

当强氧化剂作漂白剂时，漂白效果是永久的。

根据文献，过氧化氢在脱色
时间为3h，温度在55℃，PH=7以及质量分数为7%时，脱色效果最佳，可以有效脱去糖中的色素。

操作：取粗多糖30ml，调节PH=7，取3ml于10ml容量瓶中，55℃下加入30%双氧水0.3ml，该条件下反应3h，冷却至室温，根据各种方法处理后测定特定波长下的吸光度，计算脱色率，脱蛋白率，多糖保留率，糖醛酸保留率，成品得率，并与树脂比较。

四、三氯乙酸脱色脱蛋白工艺
原理：多糖溶液与三氯乙酸溶液混合，低温下搅拌，蛋白质在三氯乙酸的作用下形成胶状析出，离心，去除沉淀物即可达到脱蛋白的目的。

操作：配制浓度为4 mol/L的三氯乙酸溶液。

平行取五份巴戟天总多糖溶液，分别加入1、2、3、4、6%（V/V）的三氯乙酸溶液，混匀，静置12 h，离心，收集上清液，低温浓缩，定容，测定多糖及蛋白质含量。

考察脱蛋白效果及三氯乙酸的最佳加入量。

据各种方法处理后测定特定波长下的吸光度，测三氯乙酸最佳加入量时的脱色率，脱蛋白率，多糖保留率，糖醛酸保留率，成品得率。

五、Sevage试剂法脱色脱蛋白工艺
原理：蛋白质在Sevage试剂中变性，分布在水层及氯仿层交界处，通过离心或者分层萃取得以除去。

Sevag法是经典的脱蛋白方法，条件较温和，在脱除蛋白的时候不会对多糖的结构和活性产生影响，但需反复多次操作。

具体操作：巴戟天总多糖用去离子水溶解，按照1：1的体积比，加入Sevage试剂进行充分振摇，蛋白质变性成胶状，静置1 h。

通过分液去除变性蛋白。

设计5份同样的巴戟天总多糖溶液，分别脱蛋白1、2、3、4、5次，收集脱蛋白后总多糖液，低温浓缩，定容，测定多糖及蛋白质含量。

考察多次脱蛋白操作后，脱蛋白的效果，确定最佳的脱蛋白操作次数。

据各种方法处理后测定特定波长下的吸光度，测Sevage试剂最佳的脱蛋白操作次数时的脱色率，脱蛋白率，多糖保留率，糖醛酸保留率，成品得率。

六、数据的处理
（1）脱色率的测定
取适量巴戟天多糖溶液，以蒸馏水为空白，于390nm波长下测定吸光度，计算双氧水脱色率[30]。

其中，检测波长为390nm；A脱色前：巴戟天多糖溶液（4.9685mg/mL）吸光度；A脱色后：经过脱色后的多糖溶液吸光度。

.（2）脱蛋白率
分别准确吸取经双氧水脱色后的多糖流出液、标准牛血清蛋白溶液（0.0406mg/mL）1.0mL于具塞试管中，加入5.0mL考马斯亮蓝
储备液，摇匀，常温下放置5min后，于590nm测定吸光度。

以蒸馏水同法操作加等量考马斯亮蓝液做空白。

计算脱蛋白率。

其中，吸光度A值均在波长590nm下测定；A脱色前：多糖溶液经考马斯亮蓝显色前的吸光度值；A脱色后：多糖溶液经脱色后经考马斯亮蓝显色的吸光度值。

（3）多糖保留率的测定
分别准确量取1.0mL葡萄糖标准品溶液（0.048mg/mL）、巴戟天多糖溶液（4.9685mg/mL）、双氧水脱色后的多糖溶液于具塞试管中，加入0.5mL5%苯酚溶液，摇匀，再加入2.0mL浓硫酸，迅速摇匀，置于恒温90℃水浴中加热10min，冷却至室温，于490nm 测定吸光度。

以蒸馏水同法操作加等量5%苯酚和浓硫酸做空白。

计算多糖损失率。

多糖保留率（%）= 1 - 多糖损失率（%）
其中，检测波长为490nm；c：多糖液浓度（mg/mL）；A：吸光度。

（4）糖醛酸保留率的测定（采用间羟联苯法）
分别取适量脱色前已知含量供试品溶液、经双氧水脱色后的巴戟天多糖溶液，在520 nm 处测定 吸收度值，计算加样回收率。

A A %1100%
A -=-⨯脱色前脱色后
脱色前糖醛酸保留率（）（）
（5）成品得率：真空干燥后，计算脱色脱蛋白前后的干物，计算得率
%100%
m m m -=⨯前后
前成品得率（）
脱色脱蛋白方法 脱色率（%） 脱蛋白率（%） 多糖保留率
（%）
糖醛酸保留率
（%）
成品得率 （%）
树脂
活性炭 双氧水 三氯乙酸 Sevage 试剂。