利用RP-HPLC法同时快速检测苯乳酸和4-羟基苯乳酸含量的方法[发明专利]

(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201911133150.9
(22)申请日 2019.11.19
(71)申请人 浙江树人学院（浙江树人大学）
地址 312028 浙江省绍兴市柯桥区杨汛桥
镇江夏路2016号
(72)发明人 刘彩琴　陆胤　谢广发　王石磊　
王楠　金建昌　饶桂维　鲍小丽　
(74)专利代理机构 北京轻创知识产权代理有限
公司 11212
代理人 孟鹏超
(51)Int.Cl.
G01N 30/02(2006.01)
G01N 30/86(2006.01)
(54)发明名称
利用RP-HPLC法同时快速检测苯乳酸和4-羟
基苯乳酸含量的方法
(57)摘要
本发明涉及一种利用反相高效液相色谱
(RP -HPLC)法同时快速检测苯乳酸和4-羟基苯乳
酸含量的方法，包括以下步骤：步骤a：配置流动
相；步骤b：配制不同稀释倍数的苯乳酸和4-羟基
苯乳酸标准溶液，采用高效液相色谱仪对苯乳酸
和4-羟基苯乳酸标准溶液进行高效液相色谱分
析，制作标准曲线，绘制苯乳酸含量-峰面积标准
曲线和4-羟基苯乳酸含量-峰面积标准曲线，得
出标准曲线回归方程；步骤c：将含有苯乳酸和4-
羟基苯乳酸的样品溶液适度稀释，8000～
10000r/min离心2～4min，离心后经过0.22μm微
滤，采用与步骤b中标准溶液完全相同的色谱条
件进行高效液相色谱分析，根据峰面积，按照步
骤b的标准曲线回归方程，利用内标法计算出苯
乳酸和4-
羟基苯乳酸的含量。

权利要求书1页 说明书6页 附图2页CN 110658286 A 2020.01.07
C N 110658286
A
1.利用RP -HPLC法同时快速检测苯乳酸和4-羟基苯乳酸含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤a：配置流动相，过滤，脱气，调节仪器，平衡色谱柱；
步骤b：配制不同稀释倍数的苯乳酸和4-羟基苯乳酸标准溶液，采用高效液相色谱仪对苯乳酸和4-羟基苯乳酸标准溶液进行高效液相色谱分析，利用离线数据处理软件进行数据处理，确定出峰时间，采用内标法，以苯乳酸和4-羟基苯乳酸浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，制作标准曲线，绘制苯乳酸含量-峰面积标准曲线和4-羟基苯乳酸含量-峰面积标准曲线，得出标准曲线回归方程；
步骤c：将含有苯乳酸和4-羟基苯乳酸的样品溶液适度稀释，8000～10000r/min离心2～4min，离心后经过0.22μm微滤，采用与步骤b中标准溶液完全相同的色谱条件进行高效液相色谱分析，根据峰面积，按照步骤b的标准曲线回归方程，利用内标法计算出苯乳酸和4-羟基苯乳酸的含量。

2.根据权利要求1利用RP -HPLC法同时快速检测苯乳酸和4-羟基苯乳酸含量的方法，其特征在于，步骤b中，所述色谱柱为规格为4.6×250mm，5μm的C18色谱柱，色谱条件如下：
流动相：流动相A为质量分数0.1％甲酸/水溶液，流动相B为乙腈，且所述流动相A和B的体积比为80：20；
流动相流速：0.5mL/min；
检测波长：210nm；
色谱柱温：20～30℃；进样量：10μL。

权　利　要　求　书1/1页CN 110658286 A
利用RP-HPLC法同时快速检测苯乳酸和4-羟基苯乳酸含量的
方法
技术领域
[0001]本发明属于高效液相色谱分析技术领域，涉及食品和发酵液中苯乳酸和4-羟基苯乳酸含量的快速检测，具体涉及一种利用反相高效液相色谱(RP-HPLC)法同时快速检测苯乳酸和4-羟基苯乳酸含量的方法。

背景技术
[0002]苯乳酸和4-羟基苯乳酸是近年来微生物源生物防腐剂研究的热点之一，可以有效抑制革兰氏阴性、阳性细菌和真菌的生长，不仅用于控制食源性致病菌和腐败菌的生长，而且在调节肠道菌群方面有巨大的潜力；同时它们溶解性好，对酸碱和温度的稳定性高，故在食品行业和健康保健等领域的应用前景被人们广泛看好。

[0003]目前，苯乳酸和4-羟基苯乳酸的检测主要有薄层层析法和高效液相检测法，相关报道均以单个物质的测定较多。

高效液相色谱法测定苯乳酸代表性的方法是以0.05％的三氟乙酸/甲醇(A)和0.05％的三氟乙酸/水(B)的混合液为流动相，梯度洗脱程序为：0～20min由10％A线性变化至100％，20～23min保持100％A，23～25min100％A线性变化至10％；流速1mL/min，检测波长210nm，柱温30℃。

4-羟基苯乳酸的检测的方法为：0.05％三氟乙酸/水(A)和0.05％三氟乙酸/甲醇溶液(B)为流动相；梯度洗脱程序为：0～20min为10％～100％B，20～23min保持100％B；流速:1mL/min；检测波长:210nm；柱温:30℃。

这两种方法中均要求梯度洗脱，对仪器配制要求高，流动相比例发生变化时，基线易发生漂移，对结果产生影响。

同时流动相中三氟乙酸酸性强，对柱子的损伤大，柱子寿命严重缩短。

发明内容
[0004]针对目前苯乳酸和4-羟基苯乳酸检测时对仪器要求高、柱子损伤大、不能同时检测中两种物质等问题，本发明的目的在于提供一种利用反相高效液相色谱(RP-HPLC)法同时快速检测苯乳酸和4-羟基苯乳酸含量的方法，本发明的方法对柱子损伤小、准确度高，稳定性好，操作简单，节约成本，缩短生产过程中的检测时间，且检测结果准确可靠。

[0005]本发明解决上述技术问题采用的技术方案如下：
[0006]利用反相高效液相色谱(RP-HPLC)法同时快速检测苯乳酸和4-羟基苯乳酸含量的方法，包括以下步骤：
[0007]步骤a：配置流动相，过滤，脱气，调节仪器，平衡色谱柱；
[0008]步骤b：配制不同稀释倍数的苯乳酸和4-羟基苯乳酸标准溶液，采用高效液相色谱仪对苯乳酸和4-羟基苯乳酸标准溶液进行高效液相色谱分析，利用依利特离线数据处理软件进行数据处理，确定出峰时间，采用内标法，以苯乳酸和4-羟基苯乳酸浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，制作标准曲线，绘制苯乳酸含量-峰面积标准曲线和4-羟基苯乳酸含量-峰面积标准曲线，得出标准曲线回归方程；
[0009]步骤c：将含有苯乳酸和4-羟基苯乳酸的样品溶液适度稀释，8000～10000r/min离
心2～4min，离心后经过0.22μm微滤，采用与步骤b中标准溶液完全相同的色谱条件进行高效液相色谱分析，根据峰面积，按照步骤b的标准曲线回归方程，利用内标法计算出苯乳酸和4-羟基苯乳酸的含量。

[0010]其中，步骤b中，所述色谱柱为C18(4.6×250mm，5μm)色谱柱，色谱条件包括：[0011]流动相：流动相A为质量分数0.1％甲酸/水溶液，流动相B为乙腈，且所述流动相A 和B的体积比为80：20；
[0012]流动相流速：0.5mL/min；
[0013]检测波长：210nm；
[0014]色谱柱温：20～30℃；
[0015]进样量：10μL。

[0016]本发明流动相的选择，利用质量分数0.1％的甲酸/水溶液来改善分离物质的吸附性能，C18色谱柱是亲水性色谱柱，亲水性强的先被分离出来，乙腈洗脱能力强，可使低波长下有吸收的杂质被检测，由于不使用梯度洗脱，检测结果稳定，基线不会发生漂移。

两者结合使检测结果更准确，且保留能力强，对苯乳酸和4-羟基苯乳酸两个水溶性的物质分离效果好，出峰时间合适。

[0017]与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
[0018]1、本发明流动相和流速不发生变化，压力稳定，2个水溶性物质同时被检出，操作简单，结果准确可靠，能够大规模检测样品中苯乳酸和4-羟基本速算的含量。

[0019]2、本发明利用质量分数0.1％甲酸/水溶液和乙腈为流动相，相较三氟乙酸为流动相时对柱子的损伤小。

[0020]3、本发明利用反相高效液相色谱法快速检测苯乳酸和4-羟基苯乳酸含量，准确度高，稳定性好，操作简单，且检测结果准确可靠，检测样品和杂质之间分离较好，有利于食品样品和乳酸菌发酵液中的苯乳酸和4-羟基苯乳酸的定量检测。

附图说明
[0021]图1是本发明实施例1提供的苯乳酸标准溶液的液相色谱图(0.8mg/mL)；[0022]图2是本发明实施例1提供的4-羟基苯乳酸标准溶液的液相色谱图(400ug/mL)；[0023]图3是本发明实施例提供的含有苯乳酸和4-羟基苯乳酸混标的液相色谱图(1为4-羟基苯乳酸，2为苯乳酸)；
[0024]图4是本发明实施例1提供的含有苯乳酸和4-羟基苯乳酸的乳酸菌发酵液的液相色谱图(1为4-羟基苯乳酸，2为苯乳酸)。

具体实施方式
[0025]下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案进一步说明。

[0026]以下实施例中采用的高效液相色谱仪为依利特P230ll，色谱柱为POSITISIL C18 (3)(4.6×250mm，5μm)色谱柱色谱柱。

其中，色谱条件为：
[0027]流动相：流动相A为质量分数0.1％甲酸/水溶液，流动相B为乙腈，且所述流动相A 和B的体积比为80：20；
[0028]流动相流速：0.5mL/min；
[0029]检测波长：210nm；
[0030]色谱柱温：20～30℃；
[0031]进样量：10μL。

[0032]实施例1
[0033]利用反相高效液相色谱法同时快速检测苯乳酸和4-羟基苯乳酸含量的方法，具体步骤为：
[0034]步骤a、配置流动相，过滤，脱气，调节仪器，平衡色谱柱；
[0035]步骤b、采用Aldrich纯度大于98％色谱纯苯乳酸标准品配制苯乳酸标准溶液，依次稀释得到浓度为0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.6mg/mL、0.8mg/mL、1.0mg/mL的标准溶液，采用高效液相色谱仪对苯乳酸标准溶液进行高效液相分析，每个浓度的标准溶液分别进样三次，利用依利特离线数据处理软件进行数据处理，色谱图如图1所示，图中保留时间为30.5800min处为苯乳酸的峰，其余为杂质峰，峰面积如表1所示，并采用内标法绘制苯乳酸含量-峰面积的标准曲线，得出标准曲线回归方程：y＝33969x+2525.4，R2＝0.9976；[0036]步骤c、采用Aldrich的纯度大于97％的色谱纯4-羟基苯乳酸标准品配制4-羟基苯乳酸标准溶液，依次稀释得到浓度为0.15mg/mL、0.20mg/mL、0.25mg/mL、0.30mg/mL、0.35mg/mL和0.40mg/mL的标准溶液，采用高效液相色谱仪对4-羟基苯乳酸标准溶液进行高效液相分析，每个浓度的标准溶液分别进样三次，利用依利特离线数据处理软件进行数据处理，色谱图如图2所示，图中保留时间为10.0475min处为4-羟基苯乳酸的峰，其余为杂质峰，峰面积如表2所示，并采用内标法绘制苯乳酸含量-峰面积的标准曲线，得出标准曲线回归方程：y＝30623x+384.2，R2＝0.9986；
[0037]步骤d、将含有苯乳酸和4-羟基苯乳酸的乳酸菌发酵液样品进行前处理，8000r/ min离心4min，0.22μm微滤，利用高效液相色谱仪分析，采用与上述标准溶液完全相同的色谱条件，记录峰面积，利用大连依利特离线数据处理软件计算峰面积，代入标准曲线，得到样品中苯乳酸和4-羟基苯乳酸含量。

从图3可以看出，保留时间9.7983min为4-羟基苯乳酸的峰，保留时间30.7658min为苯乳酸的峰，其余的为杂峰，2个主峰的出峰时间适宜，且与杂峰分离度良好。

[0038]表1苯乳酸标准溶液浓度与峰面积数值记录表
[0039]
[0041]表2 4-羟基苯乳酸标准溶液浓度与峰面积数值记录表
[0042]
[0044]实施例2
[0045]为验证上述实施例1的可行性和准确性，进行回收率试验，取已知含0.25ug/mL的
4-羟基苯乳酸浓度的发酵液样品5份，分别添加4-羟基苯乳酸标准品溶液试验，进行样品处
理和色谱分离检测，测定加样回收率。

测定结果显示表3所示。

[0046]表3 4-羟基苯乳酸加样回收率实验数据
[0047]
[0048]实施例3
[0049]为验证上述实施例1的可行性和准确性，进行回收率试验，取已知含0.42mg/mL的苯乳酸浓度的发酵液样品5份，分别添加苯乳酸标准品溶液试验，进行样品处理和色谱分离检测，测定加样回收率。

测定结果显示表4所示。

[0050]表4苯乳酸加样回收率实验数据
[0051]
[0052]以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

图1
图2
图3
图4。