高丛越桔内生真菌的分离及其优势种群的鉴定

高丛越桔内生真菌的分离及其优势种群的鉴定
作者：阮珍美陈火根
来源：《现代园艺·上半月综合版》 2010年第5期
阮珍美陈火根
（江西省樟树市五脑峰林场，樟树 3 3 1 200）
越桔又叫蓝莓，属杜鹃花科植物，为常绿或落叶灌木，喜生于微酸性土壤，有些为酸性土
壤指示植物。

广泛分布于北半球，从北极到热带高山地区均有分布，全世界约有400多种。

越
桔果实富含糖、有机酸、维生素C和B。

我国本属植物种质资源较为丰富，约有90多种[1]，
是很有开发利用前景的一类野生果实，如能得到合理利用，将产生较大经济效益[2]。

越桔果实是以花青甙为主的深蓝色，味酸甜，稍有黏性的果胶质，并有香味。

果实的药用
功能对眼睛的作用较显著[3]。

越桔含有的花色素具有较强的抗氧化剂作用，长期食用可协助清除视网膜内有毒化学质、自由基等，增加视网膜紫红素生成，提高夜视能力，帮助眼睛适应强
弱光的变化。

还可以强化毛细血管，改善血液循环，减弱血小板的粘滞性，防止血凝块的产生，增强心脑功能[1]。

越桔中的叶酸能预防子宫癌，并对孕期胎儿的发育大有益处，同时对体外肝癌细胞的培养具有显著的抑制率。

越桔还有抗衰老和缓解眼部疲劳等独特的医疗保健作用。

内生真菌是指一类生活在植物组织内，但不引起植物明显病害的真菌，是植物微生态系统
的重要组成部分[7]。

内生真菌长期生活在植物体内的特殊环境中，并与宿主协同进化，在演化过程中二者形成了互惠共生关系。

该菌可产生与宿主相同的抗癌什汹护物紫杉醇，通过微生物
发酵生产紫杉醇，可减少人类对紫杉资源的破坏，同时为今后大量生产紫杉醇满足患者的需求、造福人类开辟了一条新途径。

1 试验材料
1.1样本来源
北高丛越桔的健康叶片，采自南昌某大棚果蔬园，2009年5月末和7月末共采集2次。

1.2仪器与药品
YXQ-LS-50SⅡ立式高压蒸汽灭菌器、AL104电子天平、HG303-4K电热恒温培养箱、BCN-1360型生物洁净工作台、XS-213型显微镜、蔗糖、分析纯( AR)、琼脂、（卡拉胶条状）、95%乙醇、分析纯(AR)、次氯酸钠、分析纯( AR)。

1.3培养基
分离培养基：水琼脂培养基(WA)，纯化培养基：马铃薯蔗糖琼脂培养基(PDA)。

2 试验方法
2.1培养基的制备
2.1.1分离培养基的制备。

琼脂20g、水lOOOml、pH值自然，在水lOOOml中加入20g琼脂，煮至琼脂全部溶化。

2.1.2纯化培养基的制备。

马铃薯200g、蔗糖20g、琼脂20g、水lOOOml、pH值自然，马
铃薯洗净，去皮，切成小块，放入水中煮至用玻璃棒一触即碎，用6层纱布过滤，加入蔗糖和
琼脂，加水配制成lOOOml溶液，加热搅拌均匀即可。

2.1.3培养基的灭菌方法。

固体培养基在1.05kg/c㎡121℃高压蒸汽灭菌20min。

分装于
培养皿备用。

2.2内生真菌的分离
2.2.1样品消毒处理。

先取越桔健康叶片用自来水冲洗干净，晾干水分后，采用96%乙醇处理30秒、2.5%次氯酸钠处理60～180、96%乙醇处理30秒进行表面消毒。

2.2组织块印迹法。

植物样本经过表面消毒后，选取整片叶片放在WA培养基上，25℃恒温
培养1周，观察记录是否有真菌生长，有菌丝长出即可进行内生真菌的分离与纯化。

2.2.3内
生真菌的分离与纯化。

采用组织块分离法。

在无菌状态下，取处理后的越桔叶片切成
0.2cm×0.2cm的小片接种于WA培养基内，每个平皿内接种1 0块组织块，同时做3个平行。

将经过相同处理的叶片直接接种在一个WA平板培养基内作为印迹试验。

置(25±1)℃条件下避
光静止培养。

培养过程中，随时观察，待叶片边缘有菌丝长出，挑取菌丝前端于新的PDA平板
培养基上继续培养。

纯化后的菌株于4℃下保存。

2.2.4内生真菌分离率的计算。

分离率=叶片
组织块有菌丝生长的数量／叶片组织块接种数量×100%。

2.3内生真菌的鉴定
对分离获得的内生真菌进行形态学观察、显微结构鉴定。

分类检索参照文献[9，10]。

3
结果与分析3.1越桔内生真菌的分离，纯化及鉴定
根据组织块印迹法，对越桔的叶片进行分离，在培养过程中可以观察到有菌丝从叶片切口
边缘长出然后挑取菌丝生长边缘接种于PDA培养基中，可以观察到其菌落的形态特征。

根据其
菌落的不同的形态特征可以知道，从北高丛越桔健康叶中分离得到内生真菌40株，其优势种群占1 7株，在PDA上培养时，其菌落形态特征为菌落黑色，菌丝密集且厚，初无色，逐渐变为
绿色，成熟后变为黑色，不规则生长、边缘有裂口，基质无色。

其显微结构特征为菌丝细长，
有隔，淡褐色，隘缩明显，分生孢子圆球形、黑色，未成熟时无色或淡褐色；分生孢子梗短，粗，有泡囊。

根据真菌鉴定手册报道唑黑孢霉属( Ni—grospora)主要特征为：分生孢子梗短，分隔处隘缩，顶端细胞膨大，暗色、单生或分枝；分生孢子扁球形，顶生，黑色，单细胞，与孢子梗连
接处有无色的泡囊。

结合以上形态特征，初步筌定优势种群为黑孢霉属( Nigrospora)。

3.2越桔内生真菌的数量在不同时间的分布差异
从表2可以看出，在5月和7月不同时间采集的叶片里，分离的内生真菌的数量有很大的
差异。

7月份采集的叶片分离率明显要高于5月份采集的。

4 讨论
内生真菌的分布十分广泛，从高大的木本植物到矮小的禾本科植物都有内生菌的存在。

大
多数植物内生真菌属于子囊菌，包括核菌纲、盘菌纲和腔菌纲的许多种类以及他们的一些衍生
菌。

从分离率上来看，7月份采集的明显高于5月份的，原冈可能是：采集时间的不同对植物
内的内生真菌的数量有影响，5月是植物发芽的季节，它所生长的叶片是新叶，而7月份是植
物成熟的季节，叶片已经经过了近2个月的生长，所含有的内生真菌类群丰富。

在不同的采集
时间所分离出的内生真菌的类群中，拟盘多毛孢属普遍存在，且分离率较高，属优势种群之一。

5 结论
从越桔叶片中分离出内生真菌，共分离出40株内生真菌，并鉴定出其优势种群是：黑孢霉属。

在分离得到的40株内生真菌中，5月份分离出内生真菌7株，7月份分离出内生真菌3 3株。

参考文献
…刘淑兰，吕秀莲，王晓军，隋玉华．越橘的化学成分与药理
活性研究进展．中医药学报.2006，06.
[2]范宗忠，郑亦津，候贵传．我国越橘属植物资源利用的初步研究，中国野生植物资源，ChineseWild PlantResources，1990,01.
[3]李亚东．越橘果实中的活性成分其药用保及健机能．农产品加工．2007，12.
[4]杨桂霞，范海林，郑毅男，等．笃斯越橘果实中黄酮类化合物的分离鉴定[J]．吉林农
业大学学报，2005，27 (6)：643 -644 ,648.
[5]危英．张丽艳，杨玉琴．柱前衍生化（高效液相色谱法）测定江南越桔中游离氨基酸的含量，微量元素与健康，2004，21 (2)：20 - 21.（略）。