麻风病流行区水、土壤中麻风杆菌的检测初步分析

麻风病流行区水、土壤中麻风杆菌的检测初步分析
摘要：目的：探讨通过自麻风病流行区收集的水、土壤样本进行检测，对麻风
杆菌检出情况。

方法：自麻风病一般流行区采集标本49份，自高流行区采集标
本31份，自较高流行区采集标本57份。

从73个不同地域对119份水样采集，
约500ml，从15个不同地域对23份土样采集，约50g，对麻风杆菌行PCR检测。

结果：本次从不同流行程度的麻风病地区采集的水、土壤样品共137份中，PCR
阳性共70份，经测序操作，含麻风菌共40份，达57.1%确认率。

较高流行区样
品57份中，PCR阳性29份，经测序，含麻风菌13份；高流行区样品31份，PCR阳性17份，经测序，含麻风菌13份；一般流行区样品49份，PCR阳性23份，经测序，含麻风菌14份。

较高流行区共用水源无麻风杆菌DNA检出；高流
行区和其它一般流行区部分水源水中有麻风杆菌DNA检出。

结论：通过对麻风病流行区所收集的水、土壤检测显示，均有麻风杆菌检出，表明可能是引发麻风病
的重要传染源，故需加大对水、土壤的管控力度，以改善高发状况。

关键词：水、土壤检测；麻风病流行区；麻风杆菌
近年来，随着我国在传染性疾病控制力度上的加强，麻风病呈低流行态势，
但偶有新发病例，特别是在麻风病流行区，如何防范仍为相关部分研究重点。

多
项研究显示，通过对自麻风病流行的区收集的水、土壤展开检测，有麻风菌检出，并认为，此种水、土壤在一定程度上可能为麻风杆菌病原库，加强检测，对改善
整体健康状况意义显著［1-2］。

本次研究就此展开探讨，现回顾结果如下。

1 材料与方法
1.1 采集样品自麻风病一般流行区采集标本49份，自高流行区采集标本31份，自较高流行区采集标本57份。

从73个不同地域对119份水样采集，约
500ml。

包括共用饮用水源水，健康人家和麻风病患者家中水田水、饮用水、池
糖水。

从15个不同地域对23份土样采集，为麻风病患者水田瘀泥、房发周围的
土样等，约50g。

于4°C条件下冷藏。

1.2 处理样品
1.2.1 处理水样方法于装有0.22μm滤膜的过滤装置中加入所采集的500ml水样，浓缩为50ml，设置离心条件为8000×g，行30min的离心操作，对沉淀予以
留取。

取Tris-HCL 1ml加入沉淀，最大程度混匀。

将牛血清白蛋白在少量混悬液
中加入，涂片，完成抗酸染色操作。

于13000r/min离心条件下，对其余混悬液行20min离心操作，将上清液弃除，所获沉淀对DNA予以提取。

1.2.2 处理土样方法取无菌纯水在土样中加入，并做充分的涡旋处理，适当
静置后，对上层混悬液提取；重复多次，对混悬液50ml收集。

取Tween20
0.05ml在混悬液加入，于600×g条件下，行15min离心操作，对上层液收集。

在800×g条件下，对上层液行30min离心操作，将上清液弃除，对沉淀物留取。

其
它操作同水样。

1.2.3 提取DNA 取90μl的0.1mol/L Tris-HCL作混悬沉淀操作，于-70°C环境中，90°C环境中，作3次反复冻融处理，取10L蛋白酶K于离心管中放置，在56°C
环境下，孵育2h。

对蛋白酶K做灭活处理。

于13 000r/min条件下，行3min离
心操作，将上清液于-20°C环境中保存。

1.2.4 麻风杆菌PCR检测阳性对照为NHDP63麻风菌株DNA。

PCR反应条件
为试剂盒推荐，在95°C环境中，行15min的预变性操作，后完成循环40个。

单
个循环设置：94°C环境中，行30s变性处理，60°C环境中，行90s退火，72°C环
境中，行90s延伸，72°C环境中，行10min延伸。

应用2%琼脂糖凝胶做电泳处理，于实验用凝胶成像仪下，对检测结果进行精准观察，若样品序列同NCBI数
据库中所呈现的麻风菌序列有≧92%的同源性，可对此样品有麻风菌存在予以确认。

2 结果
本次从不同流行程度的麻风病地区采集的水、土壤样品共137份中，PCR阳
性共70份，经测序操作，含麻风菌共40份，达57.1%确认率。

较高流行区样品
57份中，PCR阳性29份，经测序，含麻风菌13份；高流行区样品31份，PCR
阳性17份，经测序，含麻风菌13份；一般流行区样品49份，PCR阳性23份，
经测序，含麻风菌14份。

较高流行区共用水源无麻风杆菌DNA检出；高流行区
和其它一般流行区部分水源水中有麻风杆菌DNA检出。

另外，不管一般流行或较高流行区，与日常生活关联性较强的池塘水、池塘边淤泥中，均有麻风杆菌DNA
检出。

而患者家门口土壤及水缸水中，也有较高的麻风杆菌DNA检出比例，为68.4％（26/38），且经测序，有麻风杆菌检出占69.2%（18/26）。

3 讨论
本次研究应用PCR-直接测序法，对水、土壤中含有的麻风菌DNA进行检验，为对分枝杆菌进行鉴定的金标准。

本次所采集的水样本、土壤样本均为环境样品，故DNA具混合DNA性质［3-4］。

虽引物具麻风菌特殊性，但因模板过于复杂，
会对PCR扩增的效率和特异性产生影响，诱导非特异性产物生成，故对PCR反应
参数予以优化，采取测序的方式，对样品中有无含麻风菌进行确认，具十分必要性。

本次研究在开展PCR扩增前，对水、土壤部分样品做抗酸染色处理，应用特
异性引物，对DNA扩增提取，得出现场环境中有分枝杆菌检出［5-6］。

而患者
家门口土壤及水缸水中，也有较高的麻风杆菌DNA检出比例，为68.4％
（26/38），且经测序，有麻风杆菌检出占69.2%（18/26）。

提示麻风病可经被
污染的水传播。

有研究示，土壤中含有的麻风菌与患者打喷嚏、咳嗽排出可能相关，同时，也有麻菌菌在人以外的环境中独立存在的可能，需加大研究力度，以
对麻风病的流行予以控制。

综上，通过对麻风病流行区所收集的水、土壤检测显示，均有麻风杆菌检出，表明可能是引发麻风病的重要传染源，故需加大对水、土壤的管控力度，以改善
高发状况。

参考文献：
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