糖皮质激素受体基因多态性与肾病综合征患儿激素耐药相关性分析

世界最新医学信息文摘 2016年 第16卷 第64期1
·论著·糖皮质激素受体基因多态性与肾病综合征
患儿激素耐药相关性分析
周燕，蒋红雨（通讯作者）
（贵州医科大学附属医院儿科，贵州 贵阳 550001）
摘　要：目的探讨糖皮质激素受体基因多态性与肾病综合征患儿激素耐药相关性。

方法对研究对象进行基因组DNA的提取，后进行引物的设计和合成，进行PCR扩增，在高温和稳定状态下合成杂合双链，再应用变性高效液相
色谱进行分析，进行DNA直接测序。

结果琼脂糖凝胶中进行电泳的结果为，研究对象的外显子PCR产物可形成单
一的区带，其序列与已知序列相一致，可见清晰明亮的均一条带。

在136份基因样本中，经变性高效液相色谱分析出
11种多态性，经DNA图谱测序证实。

其中3组多态性呈紧密连锁的单倍型，并且为首次报道，其在激素耐药型肾病
综合征的基因型频率高于敏感型肾病综合征组，其他的多态性出现的频率较低。

结论在糖皮质激素受体基因多态性
中筛选出11处多态性，并且发现其中2种为多为点紧密连接的单倍型，有可能与肾病综合征患儿发生糖皮质激素耐药
性有关。

关键词：糖皮质激素；受体；多态性；肾病综合征；耐药性
中图分类号：R69 文献标识码：A DOI：10.3969/j.issn.1671-3141.2016.64.001
Correlation analysis of polymorphism of glucocorticoid receptor gene
with steroid resistance of nephrotic syndrome children
Zhou Yan， Jiang Hong-yu
（Department of Pediatrics, The Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, Guizhou 550001）
ABSTRACT：Objective to investigate correlation of polymorphism of glucocorticoid receptor gene with steroid resistance of nephrotic syndrome children. Methods carry on genomic DNA extraction for study objects, and then design and synthesis of extraction, and PCR amplification, to receive heterozygous double chain uner high temperature and steady state, analyze it with denaturing high performance liquid chromatography for direct DNA sequencing. Results electrophoresis results in agarose gel showed exon PCR products of study objects may be lined in a single clear and bright belt, the sequence is consistent with the known. Among 136 gene samples, 11 polymorphisms were analyzed by denaturing high performance liquid chromatography, and the results were confirmed by DNA sequencing. Among which, polymorphism of 3 groups showed close and linked haplotype with first report, its genotype frequency
for steroid resistant nephrotic comprehensive syndrome was higher than sensitive nephrotic syndrome group, and other polymorphism frequency was lower. Conclusion 11 polymorphism was screened from glucocorticoid receptor gene, and and two of them was close and linked haplotype, which may be correlated with glucocorticoid resistance of nephrotic syndrome children.
KEY WORDS：Glucocorticoid；Receptor；Polymorphism；Nephrotic syndrome；Drug resistance
0　引言
原发性肾病综合征是临床中较为常见的肾小球疾病，期临床特征为患者出现大量蛋白尿、低白蛋白血症、水肿和高脂血症为主[1]。

治疗原发性肾病综合征的主要方法为给予糖皮质激素，但是有25%的患者会发生激素耐药情况。

糖皮质激素受体是介导糖皮质激素生物效应的重要分子，糖皮质激素受体异常直接导致激素耐药的发生[2]。

最新研究表明，基因变异是导致糖皮质激素受体异常的直接原因，本次研究糖皮质激素受体基因结构的多态性和肾病综合征患儿激素耐药相关性的关系，现进行报道。

1　资料和方法
1.1　临床资料。

本次研究对象为我院2010年9月至2015年9月期间收治的136例原发性肾病综合征患儿，其中男性77例，女性59例，年龄8月~13岁，平均年龄7.5岁。

在136例患者中激素敏感型患儿96例，激素耐药型患儿40例，根据中华医学会儿科学会分会肾脏病学组制定的标准对患儿的激素反应性进行糖皮质激素耐药性评价。

1.2　仪器与方法。

1.2.1　实验仪器。

观察指标，对每位研究对象行24小时尿蛋白定量、尿微量蛋白检查；血胱抑素C检查，部分激素耐药患儿行肾穿刺检查。

具体设备及型号：高效液相色谱分析仪，尿微量蛋白 仪器BECKMAN COULTER 型号 IMMAGE 800；胱抑素C 仪器SIEMENS 型号ADVIA 2400；24小时尿蛋白定量 仪器 分光光度计 型号 722上海清华。

1.2.2　实验方法。

先提取研究对象的DNA基因组[3]，取外周血10ml，用草酸钾进行抗凝处理，用标准盐析法提取DNA，后进行引物设计并合成引物，进行PCR扩增，在琼脂糖凝胶中进行电泳，用溴化乙锭进行染色鉴定，将PCR产物经过高温变性缓慢复性后形成杂合双链，用高效液相色谱进行分析，筛选出糖皮质激素受体基因多态性，再进行变性高效液相色谱检测，从而筛选出纯合变异。

2　结果
琼脂糖凝胶中进行电泳的结果为，研究对象的外显子PCR 产物可形成单一的区带，其序列与已知序列相一致，可见清晰明亮的均一条带。

两种单倍型的基因分型，可进行较高的基因频率，在肾病综合征患者中的基因组进行单倍型3和单倍型5的基因分型。

存在多态位点时，可对两个位点进行下一步的检测，证实其具有完整的单倍型。

在136份基因样本中，经变性高效
作者简介：周燕，湖南省益阳市，女，主治医师，硕士研究生，主要研究方向：儿科肾脏。

蒋红雨，贵州省贵阳市，女，主任医师，本科，主要研究方向：儿科肾脏。

World Latest Medicne Information (Electronic Version) 2016 Vo1.16 No.64 2
液相色谱分析出11种多态性，经DNA图谱测序证实。

根据不同人群的分布和趋势可见单倍型3和单倍型5的人群中基因频率较高，耐药型肾病可高于敏感型肾病，其余基因型的出现频率较低。

在所有患者的基因检测中，单倍型3和单倍型5的激素耐受型肾病综合征的频率分别为10.3%和15.4%，明显高于敏感型肾病综合征的频率1.5%和0.7%。

其中3组多态性呈紧密连锁的单倍型，并且为首次报道，其在激素耐药型肾病综合征的基因型频率高于敏感型肾病综合征组，其他的多态性出现的频率较低。

3　讨论
肾病综合征患儿激素耐药性是临床治疗的难点，其最终可发展为终末期肾病，并且激素耐药的机制相对较复杂，主要与糖皮质激素受体的亚型表达有关，亚型表达降低导致糖皮质激素受体无法有效的和糖皮质激素结合，对糖皮质激素产生不敏感表达，表现为激素耐药[4]。

糖皮质激素受体是一种内源性的转录因子，其可存在于各种类型细胞的细胞浆液中，在与糖皮质激素结合后可被激活，激活后的受体复合物向细胞核内进行转移，以二聚体的形式与染色体结合，作用于应答基因上控制糖皮质激素的反应，从而抑制或激活靶基因的转绿功能，形成蛋白质的结合，从而发挥免疫调节和代谢的功能。

糖皮质激素受体基因多态性的改变可导致糖皮质激素受体结构和功能的改变，从而发生糖皮质激素耐药性的发生。

现在学术界对于糖皮质激素受体基因多态性和糖皮质激素受体之间的关系越来越引起关注，但是目前还没有系统的导致糖皮质激素耐药性的相关研究报道[5]。

糖皮质激素受体结构区免疫去在本研究未与NH2端，其功能具有特异性抗原，位于糖皮质激素受体ID的突变并不会是糖皮质激素的敏感性降低，有必要完成糖皮质激素受体基因序列进行分析，单链构象多态性分析可应用于较大样本的突变基因筛选，已经被广泛应用于基础研究和临床研究中，随着基因产物的扩大其敏感性也相对降低。

本次研究，对研究对象进行基因组DNA的提取，后进行引物的设计和合成，进行PCR扩增，在高温和稳定状态下合成杂合双链，再应用变性高效液相色谱进行分析，进行DNA直接测序。

结果显示，琼脂糖凝胶中进行电泳的结果为，研究对象的外显子PCR产物可形成单一的区带，其序列与已知序列相一致，可见清晰明亮的均一条带。

在136份基因样本中，经变性高效液相色谱分析出11种多态性，经DNA图谱测序证实。

其中3组多态性呈紧密连锁的单倍型，并且为首次报道，其在激素耐药型肾病综合征的基因型频率高于敏感型肾病综合征组，其他的多态性出现的频率较低。

随着目前分子生物学的快速发展，单核甘酸多态性的功能也有新的看法。

有研究证实，单核甘酸多态性可直接影响RNA 的结构，为SNP变异提供解释的机制。

基因编码区的突变除了对氨基酸的编码发生改变外，还可直接影响到RNA的剪切，可影响RNA剪切的效率和准确率，本次研究结果发现单倍型和糖皮质激素受体功能可直接影响和功能，还需进一步的功能。

综上，在糖皮质激素受体基因多态性中筛选出11处多态性，并且发现其中2种为多为点紧密连接的单倍型，有可能与肾病综合征患儿发生糖皮质激素耐药性有关。

参考文献
[1]　张秀敏，李宇宁，糖皮质激素受体与儿童激素耐药型肾病综合征研
究进展[J]，中国小儿急救医学，2013,20（6）：647-648.
[2]　叶建伟，丁洁，黄健萍，糖皮质激素受体基因多态性与肾病综合征
患儿激素耐药相关性探讨[J]，中华儿科杂志，2013,41（9）：661-
662.
[3]　彭华保，易著文，何庆南，等，儿童原发性肾病综合征激素抵抗与糖
皮质激素受体基因多态性的相关性[J]，中国当代儿科杂志，2014,6（4）：274-275.
[4]　赵露，黄威，杨淑珍，等，肾上腺糖皮质激素水平与肾病综合征相
关性的临床研究[J]，北华大学学报（自然科学版），2014，12（5）：562-563.
[5]　何小解，易著文，党西强，等，GRB在原发性肾病综合征患儿糖皮质
激素耐药中的作用[J]，中华儿科榨汁，2015,43（2）：109-110.
（上接第3页）
义，P>0.05，随访1年后，研究组早产儿的神经系统发育评分明显高于一般组早产儿，P<0.05，具体研究数据见表2所示。

3　讨论
上个世纪90年代糖皮质激素类药物即已被我国临床用于预防早产儿BPD，其中以地塞米松应用最为广泛，但随着应用时间的延长，该种药物的应用局限性也逐渐凸显，主要表现在药物不良反应方面，之后临床开始减少糖皮质激素在预防早产儿BPD中的应用[3]。

然而步入21世纪以来，早产儿BPD的发病率呈现出不断增长的趋势，严重影响早产儿的健康成长，促使我国临床不得不再次考虑应用糖皮质激素类药物预防早产儿BPD[4]。

研究证实炎性反应在早产儿发生BPD的过程中发挥着积极的促进作用，炎性因子表达水平升高是导致早产儿发生BPD的独立风险因素，故在选择用于预防早产儿BPD的糖皮质激素类药物时，应选择具有良好抗炎功效的药物。

布地奈德混悬液是我国临床治疗支气管哮喘的常用药物，抗炎效果强，雾化吸入使用，药物利用率高，药效发挥更为充分，现阶段已被广泛应用于婴幼儿疾病的治疗。

我院本次对布地奈德混悬液预防早产儿BPD的远期效果进行研究发现，研究组早产儿的BPD发生率、再入院率均较一般组早产儿低，神经系统发育状况优于一般组早产儿。

综上所述，我院认为雾化吸入布地奈德混悬液预防早产儿BPD，效果确切，具有临床推广应用价值。

参考文献
[1]　林云,贾雁平,石霖，等.早产儿支气管肺发育不良防治研究[J].
中国妇幼保健,2015,30(35):6246-6248.
[2]　胡剑,俞敏,唐云，等.小剂量糖皮质激素预防早产儿支气管肺发
育不良效果观察[J].山东医药,2014,8(48):48-49.
[3]　李春杰,肖志辉.极低体质量早产儿支气管肺发育不良的发生率及
其影响因素研究[J].中国全科医学,2015,3(10):1165-1167,1171.
[4]　黄上明,陈丽芝,肖万祥，等.早产儿支气管肺发育不良的
早期诊断和治疗(附3例报告)[J].中国煤炭工业医学杂志,2013,16(11):1896-1898.
表2　2组早产儿随访前后的神经系统发育状况比较（χ—±s）组别随访前随访后
研究组23.6±4.236.7±3.3
一般组24.1±3.930.8±3.5
t0.390 5.485
P0.7000.000。