Sp1调控FoxM1在卵巢癌中的表达

Sp1调控FoxM1在卵巢癌中的表达
赵静;吴娟;杨丽娜;李郁;张芳琳;杨红
【摘要】探讨Sp1调控转录因子FoxM1在卵巢癌中的表达.免疫组织化学染色验证FoxM1在卵巢癌组织中高表达,Spearman'rho秩相关分析Sp1与FoxM1在卵巢癌组织中的表达相关性;双荧光素酶报告系统检测Sp1对FoxM1的调控作用;Real-time quantitative RT-PCR和蛋白免疫印迹技术验证Sp1对FoxM1的调控作用.FoxM1在大于60％的卵巢癌组织中呈阳性表达(阳性率33/42≈79％),并且与Sp1的表达显著相关(r=0.809,P＜0.01);Sp1可以结合并激活Foxm1启动子(P＜0.05);上调Sp1表达可以激活FoxM1在卵巢癌中的表达(P＜0.05),而干扰Sp1后可以下调FoxM1的表达(P＜0.05).Sp1参与调控增殖相关转录因子FoxM1在卵巢癌中的表达.
【期刊名称】《科学技术与工程》
【年(卷),期】2014(014)028
【总页数】5页(P183-187)
【关键词】Sp1;FoxM1;卵巢癌;调控
【作者】赵静;吴娟;杨丽娜;李郁;张芳琳;杨红
【作者单位】第四军医大学西京医院妇产科,西安710032;第四军医大学基础部微生物学教研室,西安710032;第四军医大学基础部微生物学教研室,西安710032;第四军医大学基础部细胞生物学教研室,西安710032;第四军医大学基础部细胞生物学教研室,西安710032;第四军医大学西京医院妇产科,西安710032
【正文语种】中文
【中图分类】R737.31
卵巢癌发病率在女性生殖系统肿瘤中列居第三，但致死率却占各类妇科肿瘤的首位，对妇女的生命健康造成严重威胁。

美国癌症学会最新报道称，2013年大约有22 240 新发病例被诊断为卵巢癌，同年14 030 名患者死于该疾病［1］。

卵巢癌易
复发、转移，是导致该疾病棘手的重要原因之一。

叉头框蛋白M1(FoxM1)是一种典型的增殖相关转录因子，可以刺激细胞增殖并推进细胞周期进程(促使细胞周期进入S 期和M 期)。

研究发现FoxM1 在多种肿瘤
细胞中表达上调［2—4］，并且可以促进肿瘤细胞的增殖，侵袭和转移［2，5］。

它有一个称为叉头框的DNA 结合结构域［6，7］，并因此得名。

转录因子调控基因表达是许多生物过程和癌变进行的重要因素之一［8］。

第一个被发现的哺乳动物细胞转录因子Sp1，是锌指结构特殊蛋白家族(包括Kruppel 样因子家族)中的成员之一。

Sp1 广泛表达于哺乳动物细胞，参与调控多种基因的表达，尤其是许多管家基因及某些能够促进细胞增殖的因子，例如VEGF、MMP［9，10］等。

该研究在卵巢癌细胞中发现Sp1 参与调控FoxM1 的表达，这也是首次在卵巢癌
细胞中揭示Sp1 对于上调FoxM1 的表达具有重要意义。

1 材料与方法
1.1 主要试剂
鼠抗人FoxM1 单抗、鼠抗人Tubulin 单抗、兔抗人Sp1 单抗、Sp1 真核表达载体、Foxm1 启动子真核表达载体、Sp1-si320(以上均由第四军医大学细胞工程中心馈赠)，RPMI-1640 培养基(赛默飞世尔生物化学制品有限公司)，新生胎牛血清
(杭州四季青)，RNA 提取试剂盒(AxyGen Bioscience)，prime-Script RT reagent Kit Perfect Real Time(大连TaKa-Ra)，SYBR@Premix Ex Taq
Ⅱ(Perfect Real Time)(大连TaKaRa)，RIPA 蛋白裂解液(西安沃尔森生物技术有
限公司)，羊抗鼠、兔IgG 红外二抗及PVDF 膜(第四军医大学微生物实验室馈赠)，引物合成(上海桑尼)
1.2 方法
1.2.1 卵巢癌组织的收集
选自2010～2013年第四军医大学西京医院及陕西省中医学院附属第二医院行手
术切除并经病理证实后有上皮性卵巢癌组织及正常卵巢组织所制标本蜡块各42 例。

所有卵巢癌病例均为原发性卵巢上皮性肿瘤，42 例正常卵巢组织来自卵巢活检病
例和因子宫肌瘤、功能性子宫出血或子宫脱垂行全子宫切除同时行卵巢切除病例，病理证实卵巢组织无异常。

1.2.2 免疫组织化学染色
采用SP 法进行免疫组化染色，DAB 显色后FoxM1、Sp1 的表达产物均主要定位于胞核，呈现黄色或棕褐色者为阳性细胞。

镜下随机选10 个高倍视野(×400)结果判定:按细胞显色有无及深浅计分:0分为无色，1分为浅黄色，2分为棕黄色，3分为棕褐色;按显色细胞所占比例计分:0分＜1%，1分1%～10%，2分11%～25%，3分26%～50%，4分51%～75%，5分＞75%。

两者乘积即为该切片积分，在
0 到15 之间，大于5 认为是阳性染色。

由两位资深病理学专家单独评定，并达成一致意见。

1.2.3 细胞来源及培养
该实验所采用细胞系为人卵巢癌细胞株HO-8910(第四军医大学细胞工程中心馈赠)，HEK-293T(第四军医大学微生物实验室馈赠，该细胞用于细胞转染及荧光素
酶报告基因检测)。

所用卵巢癌细胞均按37 ℃5% CO2培养于含10% 胎牛血清的
RPMI-1640 培养基中。

HEK-293T 所用培养基为含10% 胎牛血清的DMEM 高
糖培养基，培养条件同上。

1.2.4 质粒转染及荧光素酶报告基因分析
将FoxM1 启动子真核表达载体pGL3-Basic-FoxM1p(+1～+160)转染HEK-293 细胞，同时共转染不同剂量的Sp1 真核表达载体((0、0.5、1.0、2.0)μg)，PRL-
TK 为内对照。

另一组在收细胞检测荧光素前10 h 添加光辉霉素(Mithramycin A)(Sp1 特异性抑制剂)((0、0.5、1.0、2.5)μM)，转染48 h 后进行荧光素酶报告
基因分析。

1.2.5 RNA 干涉及Real-time quantitative RT-PCR所用Sp1分子特异性siRNA 序列
Sp1-si320 5'-AAUGAGAACAGCAACAACUtt-3'
5'-AGUUGUUGCUGUUCUCAUUtt-3'。

阴性对照siRNA 为购自Ambion 公司的negative control siRNA(SNA)。

将8
μL(20 μM)siRNA，8 μL lip2000分别溶于200 μL 双无RPMI1640 培养基中，
室温孵育5 min，轻柔混合后，室温孵育20 min;吸除细胞培养液，以1×PBS 轻
洗细胞2 次，每孔加入培养液2 mL，将孵育后的混合物加入相应6 孔板内，
37 ℃，5%CO2培养6 h，更换血清培养液，继续培养48 h。

提取HO-8910 细
胞RNA，反转录后以cDNA为模板，利用荧光定量PCR 仪扩增目的基因，检测Sp1、Foxm1 的表达。

反应条件:94℃5 min，94 ℃30 s，60 ℃30 s，72 ℃30 s，30 个循环;72 ℃10 min;4 ℃保存。

所用引物序列:
FoxM1 上游5'-AGGGTGGTCCGTGTAAAT-3'，
下游5'-ACCTCAGCCTGGAAGAAA-3';
Sp1 上游5'-TGTGAATGCTGCTCAACTCTCC-3'，
下游5'-CATGTATTCCATCACCACCAG-3';
GAPDH 上游5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'，
下游5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'。

1.2.6 质粒转染及蛋白免疫印迹分析
在HO-8910 细胞中分别转染Sp1/pcDNA3.1(+)、Sp1-si320，其中空细胞组为
阴性对照组。

RIPA 裂解细胞提取总蛋白。

BCA 法测定各样本浓度，根据需要配胶。

取蛋白样品20 μL(约5 μg)上样，稳压80 V 电泳30 min;稳压100V 电泳1
h;100 V湿转50 min;5%BSA 室温摇床上封闭1 h;一抗孵育(鼠抗Foxm1 稀释比
例为1∶100，兔抗Sp1 稀释比例为1∶200，鼠抗Tubulin 稀释比例为1∶100)，4 ℃摇床过夜。

TBST 漂洗，10 min×3 次;二抗孵育，室温1 h;双色红外激光扫描成像系统扫描成像。

1.3 统计学分析
每个实验至少重复两次，其中将具有代表性的实验结果列出。

所有的统计都经由SPSS19.0 统计软件完成，均为双侧检验，P＜0.05 具有统计学意义。

Spearman's rho 秩相关分析Foxm1 与Sp1 的表达相关性。

2 结果
2.1 FoxM1 高表达于卵巢癌组织
FoxM1 在上皮性卵巢癌组织中的阳性表达率(33/42≈79%)明显高于正常卵巢组织(6/42≈14%)，差异具有统计学意义(P＜0.05)，如图1 所示。

图1 FoxM1 在正常卵巢和卵巢癌组织中的免疫组化染色结果Fig.1 The expression of FoxM1 was detected by immunohistochemical staining analysis in normal ovarian and ovarian cancer tissues
2.2 Sp1 与FoxM1 在卵巢癌组织中的表达呈显著相关
Sp1 在卵巢癌组织中的阳性表达率(30/42≈71%)高于正常卵巢组织(10/42≈24%)，
差异具有统计学意义(P＜0.05)，如图2 所示。

Sp1、FoxM1在上皮性卵巢癌中的表达呈显著相关(r=0.809，P＜0.01)，如图3 所示。

图2 Sp1 在正常卵巢和卵巢癌组织中的免疫组化染色结果Fig.2 The expression of Sp1 was detected by immunohistochemical staining analysis in normal ovarian and ovarian cancer tissues
2.3 Sp1 激活FoxM1 启动子
双荧光素酶报告分析显示随着Sp1 质粒用量的增加，FoxM1 启动子区的活性逐渐增强，如图4(a)所示。

在添加了光辉霉素后，随着剂量的增加FoxM1 的转录活性不断下降，存在剂量依存关系，如图4(b)所示。

2.4 Sp1 参与调节Foxm1 的表达
Real-time quantitative RT-PCR和蛋白免疫印迹结果提示在HO-8910 细胞系中转染Sp1 真核载体质粒后，FoxM1 的mRNA(图5)和蛋白(图6)表达明显增加，而在转染Sp1 的siRNA 后FoxM1 的mRNA(图5)和蛋白(图6)表达明显下降。

图3 Sp1 与FoxM1 在卵巢癌组织中的表达相关性曲线Fig.3 Correlation between Sp1 expression and FoxM1 expression in ovarian cancer
图4 双荧光素酶报告系统检测Sp1 对FoxM1基因的转录激活作用Fig.4 Dual-luciferase reporter assay system was used to detect Sp1 active the promoter of FoxM1 gene*P＜0.05
3 讨论
图5 上调或干扰Sp1 表达对FoxM1 在卵巢癌HO-8910 细胞中mRNA 表达水平的影响Fig.5 Real-time PCR was used to detect the Sp1 and FoxM1 mRNA expression level*P＜0.05
FoxM1 具有增殖特异表达模式，它的表达受到众多增殖和抗增殖信号以及原癌基因和抑癌基因的影响。

由于这些因素在癌症中往往是过表达，突变或丢失，受它们
影响的FoxM1 表达管制的解除为FoxM1 在肿瘤中提供了表达基础。

因此，FoxM1 在多种癌症中呈过度表达［11—13］，这一点在该研究卵巢癌免疫组织化学染色的结果中也得到证实。

FoxM1 促进癌变并参与肿瘤的发生发展，包括肿瘤血管生成，迁移，侵袭，上皮
间质转化，转移，肿瘤相关巨噬细胞的招募及化疗耐药等，并且有研究发现在膀胱癌中FoxM1 的高表达与预后不良密切相关［12］。

Kambach 等［14］在肺癌中发现ErB2 基因对FoxM1 具有调控作用，Jiang 等［15］在卵巢癌中发现紫花牡
荆素(Casticin，CAS)激活FOXO3a 后导致FoxM1 的表达下降从而促进卵巢癌细胞的凋亡。

关于FoxM1 的表达与调控机制的正确解读对于肿瘤治疗的研究具有重要意义，已经成为癌症研究的热点之一。

图6 Western-Blot 检测上调或干扰Sp1 表达对FoxM1 蛋白表达的影响Fig.6 Western blot analysis was used to detect the Sp1 and FoxM1 protein expression levels
该研究第一次在卵巢癌细胞系中验证了Sp1 上调FoxM1 转录因子的表达［16］。

双荧光素酶报告系统检测证实Sp1 可以结合并激活FoxM1 启动子，提示Sp1 在FoxM1 的表达过程中扮演重要角色。

该研究利用Real-time quantitative RT-PCR和Westernblot 技术证实Sp1 在卵巢癌细胞株HO-8910 中上调FoxM1 的表达。

FoxM1 作为癌增殖相关转录因子提示Sp1 过表达导致的FoxM1 高表达在卵巢癌的转移侵袭过程中发挥着重要作用。

免疫组织化学染色结果也显示在卵巢癌组织中Sp1 与FoxM1 的表达呈显著相关。

该研究首次在卵巢癌细胞和组织中发现了Sp1与FoxM1 的表达具有显著相关性。

Sp1 调控FoxM1分子机制的研究对于我们制定新型靶向个体化诊疗方案抑制卵巢癌的发生发展具有重要意义。

参考文献
【相关文献】
1 Siegel R，Naishadham D，Jemal A.Cancer statistics，2013.CA Cancer J Clin，
2013;63(1):11—30
2 Raychaudhuri P，Park H J.FoxM1:a master regulator of tumor metastasis.Cancer Res，2011;71(13):4329—4333
3 Wang Z，Ahmad A，Li Y，et al.Forkhead box M1 transcription factor:a novel target for cancer therapy.Cancer Treat Rev，2010;36(2):151—156
4 Wierstra I，Alves J.FOXM1，a typical proliferation-associated transcription factor.Biol Chem，2007;388(12):1257—1274
5 Koo C Y，Muir K W，Lam E W.FOXM1:from cancer initiation to progression and treatment.Biochim Biophys Acta，2012;1819(1):28—37
6 Hannenhalli S，Kaestner K H.The evolution of Fox genes and their role in development and disease.Nat Rev Genet，2009;10(4):233—240
7 Korver W，Roose J，Clevers H.The winged-helix transcription factor trident is expressed in cycling cells.Nucleic Acids Res，1997;25(9):1715—1719
8 Dynan W S，Tjian R.Isolation of transcription factors that discriminate between different promoters recognized by RNA polymerase II.Cell，1983;32(3):669—680
9 Pang L，Zhang Y，Yu Y，et al.Resistin promotes the expression of vascular endothelial growth factor in ovary carcinoma cells.Int J Mol Sci，2013;14(5):9751—9766
10 Guan H，Cai J，Zhang N，et al.Sp1 is upregulated in human glioma，promotes MMP-2-mediated cell invasion and predicts poor clinical outcome.Int J Cancer，
2012;130(3):593—601
11 Xu N，Jia D，Chen W，et al.FoxM1 is associated with poor prognosis of non-small cell lung cancer patients through promoting tumormetastasis.PLoS One，2013;8(3):e59412 12 Feng Y，Wang L，Zeng J，et al.FoxM1 is overexpressed in Helicobacter pylori-induced gastric carcinogenesis and is negatively regulated by miR-370.Mol Cancer Res，
2013;11(8):834—844
13 Li X，Qi W，Yao R，et al.Overexpressed transcription factor FOXM1 is a potential diagnostic and adverse prognostic factor in postoperational gastric cancer patients.Clin Transl Oncol，2014;16(3):307—314
14 Kambach D M，Sodi V L，Lelkes P I，et al.ErbB2，FoxM1 and 14-3-3zeta prime breast cancer cells for invasion in response to ionizing radiation.Oncogene，2014;33(5):589—598
15 Jiang L，Cao X C，Cao J G，et al.Casticin induces ovarian cancer cell apoptosis by repressing FoxM1 through the activation of FOXO3a.Oncol Lett，2013;5(5):1605—1610 16 Kong X，Li L，Li Z，et al.Dysregulated expression of FOXM1 isoforms drives progression of pancreatic cancer.Cancer Res，2013;73(13):3987—3996。