第十二章层析技术

硅胶——
• 作吸附层析剂，还可作为其他层析剂的基质 • 在碱性水溶液中不稳定，应用的常规pH为2-8 • 活性硅胶为多孔的，吸附作用与本身含水量有关 • 硅胶的活化、再生 • 可分离氨基酸衍生物、甾体激素、皂苷类、类脂及色素等
氧化铝
• 常用的亲水性吸附剂，较高吸附容量，分离效果好，尤其 适用于亲脂性成分的分离
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2. Sephadex ＬＨ
➢G-25和G-50中分别引入羟丙基，形成烷基化葡聚糖凝胶 ➢主要型号为Sephadex LH-20和LH-60 ➢适用于以有机溶剂为流动相，分离脂溶性物质
3. Sephacryl S 系列
➢葡聚糖与甲叉双丙烯酰胺交联而成。 ➢分离范围远远大于Sephadex的范围。 ➢化学稳定性更高。 ➢机械性能较好，可以以较高的流速洗脱，比较耐压，分辨率也较高。
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四、凝胶柱层析的操作
➢ 层析剂选择和预处理 ➢ 装柱 ➢ 平衡 ➢ 上样 ➢ 洗脱 ➢ 检测 ➢ 收集 ➢ 层析剂再生和保存
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1、凝胶选择
根据样品确定分离范围，从而选择合适型号的凝胶——应将大分子完 全排阻而小分子完全渗透。 适当的颗粒度：
颗粒小，分辨率高，但相对流速慢，有时会造成扩散现象严重； 颗粒大，流速快，分辨率较低但条件得当也可以得到满意的结果。
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⑦ 死体积(Vm)：指不被层析柱层析剂滞留的惰性组分，从
开始洗脱到柱出口出现浓度最大值时流出的流动相体积。 其值等于外水体积加内水体积。
⑧ 死时间(tm)：指不被层析柱层析剂滞留的惰性组分，从
开始洗脱到柱出口出现浓度最大值所需的时间。其值等 于流动相流过层析柱所需的时间。
⑨ 调整保留时间(te –tm)： 保留时间扣除死时间的值。
Sephadex LH系列。
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1. Sephadex G 凝胶 葡聚糖与3-氯-1,2环氧丙烷（交联剂）相互交联而成。
•工作pH范围2-13；可以耐110℃（湿胶）消毒。 •含有少量羧基；离子强度〉0.02M，吸附已微弱。 •不耐压。
凝胶型号与交联度、吸水量的关系：
✓交联度：如Sephadex G25, G50, G100,数字越小，交联度越大， 凝胶网状结构越紧密。 ✓吸水量与数字关系：如G25，表示吸水量为1g干胶吸水2.5g.
交换反应：活性离子与溶液中其它的离子基团发生可逆的 阳离子交换剂—活性离子带正电的与带正电的离子基团发生交换 阴离子交换剂—活性离子带负电的与带负电的离子基团发生交换
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3. 峰高、峰面积和峰宽 ① 峰高(h):色谱峰顶点与峰底之间的垂直距离称为峰高。 ② 峰宽(W)和半峰宽(W1/2):峰宽是通过色谱峰的拐点作切线
在峰底部的截距。半峰宽是洗脱峰高一半时的宽度。 ③ 峰面积(A):峰与峰底之间的面积称为峰面积。
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4. 层析柱的分离度
分离度(R)又称分辨率，是相邻两个洗脱峰保留时间之差 的2倍与色谱峰峰基宽之和的比值，表示式为：
性质：
➢聚丙烯酰胺凝胶的分离范围、吸水率等性能基本近似于 Sephadex。 ➢pH为2~11之间比较稳定。 ➢非常亲水，基本不带电荷，吸附效应较小。 ➢不会象葡聚糖凝胶和琼脂糖凝胶那样可能生长微生物。
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三、表征凝胶性能的几个参数
1、排阻极限和渗入限(分级范围）： 分子量进入上限和下限
2、吸水量：指1g干的凝胶吸收水的体积或者重量 3、凝胶颗粒大小：一般较常用的是40－200μm 4、溶胀度：凝胶吸水后体积，也叫膨胀体积 5、pH范围 6、耐受压力范围 7、最高流速
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（三）大网格聚合物吸附剂（大孔树脂）
特点：孔隙大小、骨架结构、极性可按需要选取 分类：分为极性、非极性和中等极性三类 优点：选择性好、机械强度高、可反复使用 范围：使用范围广，特别适合有机物分离 厂家：美国Rohm and Haas公司生产的 Amberlite XAD系列；日本三菱公司的Diaion HP 系列
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（二）琼脂糖凝胶
由经过纯化的琼脂糖制备。主要包括：
Bio-Rad 公司的Bio-Gel A系列 Pharmacia 生产的Sepharose系列及其改性系列
1.Bio-Gel A系列
型号有0.5m、1.5m、5m、15m、50m、150m。其中的琼脂糖含量 为10%、8%、6%、4%、2%、1%。
固定相：多孔、颗粒状的固体吸附剂
吸附力: ✓物理吸附(范德华力)：吸附存在于整个自由界面； 可逆的；无严格选择性 ✓化学吸附：稳定；选择性强
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二、生物分离过程中常用的吸附剂 （一）无机吸附剂 硅胶、氧化铝、羟基磷灰石
➢极性吸附剂 ➢吸附时：从非极性溶剂中吸附极性溶质 ➢洗脱时：用极性溶剂洗脱
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Ve = Vo + Kd Vi
Ve:洗脱体积 Kd：分配系数
二、常用凝胶层析剂
—葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶，以及各凝 胶的改性物。 (一）葡聚糖系列
由天然高分子葡聚糖与其它交联剂交联而成的凝胶。国 外商品名为Sephadex。
主要由Pharmacia Biotech生产。常见的有三类： ——Sephadex G系列、Sephacryl S 系列和
2、凝胶的处理
估算用量：首先要根据选择的层析柱估算出凝胶的用量。 溶胀：在10倍以上的水中（或洗脱剂）充分溶胀倾泻法去 悬浮物小颗粒减压排气
3、层析柱的选择
层析柱的直径和长度比一般在1:25－1:100之间。
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4、装柱
① 将柱子洗涤干净 ② 安装柱并调垂直 ③ 关闭层析柱出水口，并加入少量洗脱液检漏及排气泡 ④ 将处理好的填料缓慢装入柱中，同时打开出水口，控制适当流速 ⑤ 使填料等均匀沉降，并不断加入填料溶液 ⑥ 使柱中填料表面平坦并在表面上留有2-3cm高的缓冲液，同时关
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五、凝胶层析的应用
1. 生物大分子的纯化 2. 分子量测定 3. 脱盐及去除小分子杂质
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第四节 离子交换层析技术
一、基本原理
依据各种离子或离子化合物与离子交换剂的结合力 不同而进行分离纯化。
离子交换剂——不溶于水的带有电荷基团的惰性高 分子聚合物。包括三部分：
➢高分子聚合物骨架 ➢电荷基团 ➢活性离子
二、层析技术分类
➢按分离机理不同分 吸附色谱 离子交换色谱 凝胶色谱 亲和层析 疏水层析
➢按流动相-固定相分 气-液色谱（GLC） 气-固色谱（GSC） 液-液色谱（LLC） 液-固色谱（LSC）
➢按固定相不同分 柱色谱 纸色谱 薄层色谱
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三、层析操作过程中一些基本概念和参数
1.色谱流出曲线( 色谱图)
的总和。
③ 内水体积（Vi）：溶胀后的层析剂颗粒网孔中的液
相体积的总和。
④ 基质体积（Vg）：干胶体积，是层析剂基质颗粒骨
架所占据的体积。
Vt = Vo十Vi＋Vg
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⑤ 洗脱体积(Ve)：从洗脱开始，某一成分从柱顶部到底 部的洗脱液中出现浓度达到最大值(洗脱峰最高点)时 的流动相体积。
⑥ 洗脱时间(或保留时间)(te)：从洗脱开始，某一成分 从柱顶部到底部的洗脱液中出现浓度达到最大值(洗 脱峰最高点)时的时间。
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第一节 概 述
一、基本原理
当含有被分离物质的料液流过层析柱时，由于层析剂 对各组分的阻滞力不同而使各组分分离开来（不同组分在 流动相和固定相分配不同）。
三通阀
泵
泵
流

料
动
液
相
层
D
析 柱
C
B
检测器
A
收集器
（a）层析系统基本组成
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流 AB C D
出 组 分 浓 度
时间（或流出体体积）
（b）分离出组分峰图
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第三节 凝胶层析技术
又称为凝胶排阻层析、分子筛层析、凝胶过滤法等 。
一、凝胶层析的基本原理
——根据分子大小进行分离纯化的方法
不同大小的分子流过多孔凝胶→→分子大的组分先流 出，分子小的组分后流出→→各组分便按分子从大到 小的顺序依次流出
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Vt = Vo + Vi + Vg
Vt: 凝胶柱床体积 Vi：内水体积 Vo：外水体积 Vg：干胶体积
流 AB C D
出 组 分 浓 度
时间（或流出液体积）
料液(各组分)→层析柱分离→随流动相依次流出→进入检测器→响应信号
色谱图的纵坐标为检测器的响应信号，横坐标为时间或 流动相流出体积。
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色谱图
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2. 体积、时间
① 总柱床体积（Vt）：层析剂经溶胀、装柱、沉降，
体积稳定后所占据层柱内的总体积。
② 外水体积（Vo）：柱中层析剂颗粒间隙的液相体积
经过二次交联制备的刚性琼脂糖凝胶 6. Superdex 系列
将葡聚糖共价交联到高度交联的琼脂糖珠体上制备的 刚性凝胶
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（三 ） 聚丙烯酰胺凝胶
丙烯酰胺与N,N’-亚甲基双丙烯酰胺交联而成。改变亚甲 基双丙烯酰胺的浓度，就可以得到不同交联度的产物。
聚丙烯酰胺凝胶主要由Bio-Rad 生产，商品名为 Bio-Gel P，主要型号有Bio-Gel P-2~ P-300等10种。后面 的数字乘以1000就基本代表它们的排阻极限。
6、加样
加样体积应低于5%的床体积。 加样时应缓慢小心地将样品溶液加到固定相表面，尽量避免冲击 基质，以保持基质表面平坦。
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6、洗脱
应注意洗脱时的速率和压力。
7、检测、 收集
检测器检测。 按时间、体积收集，或按检测曲线收集。
8、凝胶的保存
凝胶的保存一般是反复洗涤去除蛋白等杂质，然 后加入适当的抗菌剂，通常加入0.02％的叠氮化钠 （也可置于乙醇溶液中），4℃左右保存。
第十二章 层析技术
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层析技术（chromatography）又称色谱技 术、层离技术等，是一组相关技术的总称。
层析技术具有分离精度高、设备简单、操作方 便等优点，是当前获得高纯度产物最有效的分离 纯化技术。
根据使用目的不同，层析技术分为制备层析技 术和分析层析技术。
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主要内容
第一节 概述 第二节 吸附层析技术 第三节 凝胶层析技术 第四节 离子交换层析技术 第五节 亲和层析技术
2. Sepharose 系列
包括Sepharose2B、 4B、6B，数字代表琼脂糖浓度。
3.Separose CL
利用2，3- 二溴丙醇作交联剂得到Sepharose CL 2B、 4B、6B。稳 定性和机械强度都有所提高，能耐高温消毒。
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4. Sepharose Fast Flow 5. Superose系列
• 吸附活性与含水量相关
羟基磷灰石
• 吸附容量高，稳定性好，可制备及纯化蛋白质、酶、核酸、 病毒等
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（二）有机吸附剂：活性炭
非极性吸附剂 吸附时：从极性溶剂中吸附非极性溶质 洗脱时：用非极性溶剂洗脱 应用范围：脱色、去有机杂质、热源等 再生：水洗→5%NaOH洗→酸洗中和→水洗 →160℃加热干燥4-5h
N=5.54 (te/W1/2)2
H=L/N
理论塔板数越大或理论塔板高度越小，说明层析柱 分离效率越高。
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四、柱层析系统的基本组成及基本操作
1.柱层析系统的基本组成
层析柱+层析剂 上样洗脱系统 检测系统 收集系统
三通阀
泵
泵
流
料
动
液
相
层
D
析 柱
C
B
检测器
A
收集器
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2. 柱层析的基本操作
① 层析剂选择和预处理
闭出水口
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5、平衡
柱子装好后，要用所需洗脱液（有一定的pH和离子强度）平衡 柱子。用恒流泵在恒定压力下走柱子（平衡与洗脱时的压力尽可 能保持相同）。平衡液体积一般为3-5倍柱床体积，以保证平衡后 柱床体积稳定及基质充分平衡。
如果需要，可用兰色葡聚糖2000在恒压下走柱，如色带均匀下 降，则说明柱子是均匀的。
R=
2（te2﹣te1） （W1 + W2）
式中：
① te2 和te1—洗脱峰2和峰1的保留时间； ② W1 和W2 —洗脱峰1和峰2的峰宽。
R<1时，两峰部分重叠； R=1时，两峰有98%的分离； R=1.5时，两峰分离程度可达99.7%。
因此，一般用R=1.5作为两种组分完全分离的标志。
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5. 流速的表示法
流速有线性流速(cm/h)和体积流速(mL/min)。
它们之间的换算关系为： 体积流速（mL/mim）
= 线性流速（cm/h）×层析柱截面积（cm2）/60。
☼在放大过程中应保持线性流速不变；而增加体积流速将 随层析柱截面积的增大而增加。
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6. 柱效
柱效是表达层析柱性能的重要参数，可用理论塔板数N 和理论塔板高度H来衡量。
② 装柱 ③ 平衡 ④ 上样 ⑤ 洗脱
流 AB C D
出 组 分 浓 度
⑥ 检测 ⑦ 收集
时间（或流出体体积）
⑧ 层析剂再生和保存
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第二节 吸附层析技术
一、基本原理
➢以吸附剂为固定相，根据待分离组分与吸附剂之间的物 理或化学吸附力差别而达到分离目的的层析技术。
•优点：容易保持组分活性，操作简单 •缺点：吸附容量小，选择性差，无机吸附剂性能不稳定