楸树SSR标记在滇楸中的可转移性与应用

第４７卷第２期东㊀北㊀林㊀业㊀大㊀学㊀学㊀报
Ｖｏｌ.４７Ｎｏ.２２０１９年２月ＪＯＵＲＮＡＬＯＦＮＯＲＴＨＥＡＳＴＦＯＲＥＳＴＲＹＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹＦｅｂ.２０１９
１)湖北省技术创新专项重大项目(２０１６ＡＢＡ１１１)ꎮ
第一作者简介:彭婵ꎬ女ꎬ１９８３年６月生ꎬ湖北省林业科学研究院ꎬ助理研究员ꎮＥ－ｍａｉｌ:ｃｈａｎｐｅｎｇ２００５＠１２６.ｃｏｍꎮ
通信作者:张新叶ꎬ湖北省林业科学研究院ꎬ研究员ꎮＥ－ｍａｉｌ:ｙｄｙｘｙ７３＠ａｌｉｙｕｎ.ｃｏｍꎮ
收稿日期:２０１８年７月８日ꎮ责任编辑:潘㊀华ꎮ
楸树ＳＳＲ标记在滇楸中的可转移性与应用
１)
㊀㊀㊀
彭婵㊀陈慧玲㊀张新叶㊀㊀㊀
樊孝萍㊀㊀㊀㊀㊀㊀
麻文俊
㊀㊀(湖北省林业科学研究院ꎬ武汉ꎬ４３００７５)㊀㊀(湖北省林科院石首杨树研究所)㊀㊀㊀(中国林业科学研究院林业研究所)
㊀㊀摘㊀要㊀利用开发的１３对楸树ＳＳＲ引物ꎬ对其在近缘物种滇楸中的可转移性与应用进行研究ꎮ将１３对楸树ＳＳＲ引物对７５份滇楸无性系进行ＰＣＲ扩增ꎬ所使用的引物对滇楸的扩增成功率与引物多态性比例均为１００％ꎬ表明楸树ＳＳＲ标记对近缘种滇楸具有较高的可转移性和多态性ꎮ共检测到７６个多态位点ꎬ平均有效等位基因数(Ｎｅ)为２.３６４４个ꎬ平均期望杂合度(Ｈｅ)为０.５５０２ꎬＮｅｉ ｓ基因多样性指数(Ｈ)为０.０１３２~０.８３３５ꎬ平均值０.４４６８ꎬ结果显示滇楸无性系中遗传差异处于中间水平ꎬ各无性系之间亲缘关系较近ꎮＵＰＧＭＡ聚类将７５个无性系划分为５个类群ꎬ类群中地域性聚集不明显㊁亚群地域性聚集较明显ꎮ
关键词㊀滇楸ꎻＳＳＲ标记ꎻ可转移性ꎻ遗传多样性分类号㊀Ｓ７９２.９９
ＴｒａｎｓｆｅｒａｂｉｌｉｔｙｏｆｔｈｅＣａｔａｌｐａｂｕｎｇｅｉＳＳＲｓｉｎＣａｔａｌｐａｆａｒｇｅｓｉｉｆ.ｄｕｃｌｏｕｘｉｉａｎｄＩｔｓＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ//ＰｅｎｇＣｈａｎꎬＣｈｅｎＨｕｉｌｉｎｇꎬＺｈａｎｇＸｉｎｙｅ(ＨｕｂｅｉＡｃａｄｅｍｙｏｆＦｏｒｅｓｔｒｙꎬＨｕｂｅｉ４３００７５ꎬＰ.Ｒ.Ｃｈｉｎａ)ꎻＦａｎＸｉａｏｐｉｎｇ(ＳｈｉｓｈｏｕＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉ￣ｔｕｔｅｏｆＰｏｐｌａｒ)ꎻＭａＷｅｎｊｕｎ(ＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＦｏｒｅｓｔｒｙꎬＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＦｏｒｅｓｔｒｙ)//ＪｏｕｒｎａｌｏｆＮｏｒｔｈｅａｓｔＦｏｒｅｓｔｒｙＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ２０１９ꎬ４７(２):５０－５５.
ＴｈｉｒｔｅｅｎｐａｉｒｓｏｆＣａｔａｌｐａｂｕｎｇｅｉＳＳＲｓｐｒｉｍｅｒｗｅｒｅｕｓｅｄｔｏｉｄｅｎｔｉｆｙｔｈｅｔｒａｎｓｆｅｒａｂｉｌｉｔｙａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｉｎＣａｔａｌｐａｆａｒｇｅ￣ｓｉｉｆ.ｄｕｃｌｏｕｘｉｉ.ＵｓｉｎｇＳＳＲｍａｒｋｅｒｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓꎬｔｈｅ１３ｐａｉｒｓｏｆｐｒｉｍｅｒｆｏｒＣ.ｂｕｎｇｅｉＳＳＲｓｓｈｏｗｅｄ１００％ｔｒａｎｓｆｅｒａｂｉｌｉｔｙａｎｄ１００％ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｉｎ７５Ｃ.ｆａｒｇｅｓｉｉｆ.ｄｕｃｌｏｕｘｉｉｃｌｏｎｅｓ.Ｃ.ｂｕｎｇｅｉＳＳＲｓｍａｒｋｅｒｓｗｅｒｅｈｉｇｈｌｙｔｒａｎｓｆｅｒａｂｌｅａｎｄｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃｔｏＣ.ｆａｒｇｅｓｉｉｆ.ｄｕｃｌｏｕｘｉｉ.Ｔｈｅ７６ａｌｌｅｌｅｓｗｅｒｅａｍｐｌｉｆｉｅｄａｎｄｔｈｅａｖｅｒａｇｅｎｕｍｂｅｒｏｆａｌｌｅｌｅｓｐｅｒｌｏｃｕｓ(Ｎｅ)ｗａｓ２.３６４４.Ｔｈｅａｖｅｒａｇｅｅｘｐｅｃｔｅｄｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙ(Ｈｅ)ｗａｓ０.５５０２.ＴｈｅＮｅｉ Ｓｇｅｎｅｔｉｃｄｉｖｅｒｓｉｔｙ(Ｈ)ｏｆｅａｃｈｐｒｉｍｅｒｖａｒｉｅｄｆｒｏｍ０.０１３２ｔｏ０.８３３５ｗｉｔｈａｎａｖｅｒａｇｅｏｆ０.４４６８.ＴｈｅｒｅｗａｓａｍｉｄｄｌｅｌｅｖｅｌｏｆｇｅｎｅｔｉｃｄｉｖｅｒｓｉｔｙｉｎＣ.ｆａｒｇｅｓｉｉｆ.ｄｕｃｌｏｕｘｉｉ.ＲｅｓｕｌｔｓｏｆＵＰＧ￣ＭＡｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇｓｈｏｗｅｄｔｈａｔ７５ｃｌｏｎｅｓｗｅｒｅｄｉｖｉｄｅｄｉｎｔｏ５ｇｒｏｕｐｓ.Ｔｈｅｒｅｗａｓｌｏｗｅｒｃｏｎｓｉｓｔｅｎｃｙｂｅｔｗｅｅｎｇｅｎｅｔｉｃｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓａｎｄｒｅｇｉｏｎｓｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｇｒｏｕｐｓꎬｂｕｔｃｏｎｔｒａｒｙｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｕｂｇｒｏｕｐｓ.
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ㊀Ｃａｔａｌｐａｆａｒｇｅｓｉｉｆ.ｄｕｃｌｏｕｘｉｉꎻＳＳＲｍａｒｋｅｒｓꎻＴｒａｎｓｆｅｒａｂｉｌｉｔｙꎻＧｅｎｅｔｉｃｄｉｖｅｒｓｉｔｙ
㊀㊀滇楸(Ｃａｔａｌｐａｆａｒｇｅｓｉｉｆ.ｄｕｃｌｏｕｘｉｉ(Ｄｏｄｅ)Ｇｉｌ￣
ｍｏｕｒ)属紫葳科梓树属ꎬ原产我国ꎬ主要分布于云省㊁四川㊁贵州㊁湖北㊁湖南㊁广西等省区起源于北极白垩纪ꎬ其适应性强㊁生长速度快ꎬ在我国已有２６００多年的栽培历史[１－３]ꎮ滇楸木材干直节少㊁木质坚硬㊁纹理通直㊁耐水耐腐ꎬ是优质的珍贵木材ꎬ兼具良好的生态㊁经济与社会效益[１－２ꎬ４]ꎮ尽管滇楸具有悠久的栽培历史和重要的经济价值ꎬ但目前有关滇楸研究主要集中在引种栽培[１ꎬ５－６]㊁生理生化[７－９]㊁逆境胁迫[３ꎬ１０－１１]等方面ꎬ就其分子遗传学方面的研究则报道较少[１２－１３]ꎬ特别是利用分子标记手段ꎮ我国滇楸虽然分布范围广但野生种群较少ꎬ因其多为 自花不育 ꎬ即使结实种子也活力低下难以发芽ꎬ常规繁殖方法是茎段扦插或者埋根ꎬ由于受不同地域复杂生态条件的影响ꎬ以及不断的自然选择和人工选育ꎬ滇楸群体可能因基因交流或突变已经产生许多
新变异类型ꎬ加之不同地区种源调拨与频繁交换ꎬ导致种质资源遗传背景不清ꎬ给滇楸生产引种㊁品种改良㊁培育与推广带来不便ꎬ一定程度上制约了滇楸产业发展ꎬ所以开展滇楸遗传多样性研究对滇楸资源的科学开发和有效利用尤为重要ꎮ
微卫星(ＳＳＲ)分子标记因具有高特异性和稳定性㊁数量多㊁共显性㊁易于操作和基因组覆盖性强等优点ꎬ明显优于其他类型标记[１４－１５]ꎬ被广泛应用于植物遗传多样性分析[１６]㊁品种鉴别㊁辅助选择育种㊁
亲缘关系和系统发育学等研究ꎬ但对于一些遗传背景研究薄弱的物种ꎬ既无基因组序列又无ＥＳＴ信息ꎬ传统的ＳＳＲ标记开发方法程序复杂而且成本较高ꎬ近年来ꎬ不断有研究表明ＳＳＲ标记在植物近缘种间具有可转移性[１７－１９]ꎬ这为一些尚未开发ＳＳＲ位点的物种提供了挖掘新位点的便捷途径ꎮ滇楸和楸树作为我国重要的庭园观赏树和商业用材树种ꎬ均为紫葳科梓树属的乔木植物ꎬ亲缘关系较近ꎬ２０１６年ＷＡＮＧｅｔａｌ.[１３]采用ＮＧＳ高通量测序的方法从楸树中开发出的微卫星标记在楸树及其近缘种滇楸㊁灰楸和梓树中也能成功扩增ꎬ鉴于此ꎬ本研究利用南京林业大学与中国林科院林业所联合开发出的１３对楸树ＳＳＲ标记[２０]ꎬ对滇楸展开ＳＳＲ标记位点的
探索ꎬ评价楸树ＳＳＲ标记的种间可转移性ꎬ发掘可转移的分子标记ꎬ并应用可转移标记进行滇楸遗传多样性分析ꎬ研究结果能有效提高已有标记利用效率ꎬ降低新标记的开发成本ꎬ并为滇楸的遗传学研究㊁分子标记辅助育种提供科学依据ꎮ
１㊀材料与方法
试验材料取自湖北省石首林科所的滇楸资源圃ꎬ为贵州㊁云南㊁河南㊁襄阳等地引种的无性系材料ꎮ资源圃地处江汉平原平坦地势ꎬ生长环境条件一致ꎬ２０１６年４ ５月间每系号采集单株嫩叶一份ꎬ放于保温盒中冰袋保鲜或置于干燥剂中干燥保存ꎬ带回实验室置于冰箱－８０ħ中冻存(表１)ꎮ
ＣＴＡＢ法提取滇楸基因组ＤＮＡꎮ根据南京林业大学与中国林科院林业所开发的１３个楸树ＳＳＲ位点信息[２０](表２)ꎬ由上北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司合成荧光引物(表２)ꎻＳＳＲ－ＰＣＲ扩增的最适反应体系为２５μＬ体系ꎬ１２.５μＬ２ˑＴａｑＰＣＲｍｉｘ(由北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司生产)㊁０.５μＬ正反引物(１０μｍｏｌ/Ｌ)㊁和１μＬ模板ＤＮＡꎬ无菌去离子水(ｄｄＨ２Ｏ)补齐ꎮ扩增反应程序为:９４ħ预变性５ｍｉｎꎻ９４ħ变性３０ｓꎬ５５ħ退火３０ｓꎬ７２ħ延伸３０ｓꎬ共３５个循环ꎻ７２ħ完全延伸５ｍｉｎꎬ４ħ保存ꎮＳＳＲ－ＰＣＲ扩增产物经由ＡＢＩ３７３０全自动测序仪毛细管电泳检测鉴别ꎬ利用ＧｅｎｅＭａｐｐｅｒ软件读取结果ꎬ记录每个位点的分子质量大小ꎮ
表１㊀试验材料
来源地样本数量/个编㊀㊀号
贵州(ＧＺ)４８ＧＺ－１㊁２㊁３㊁５㊁６㊁８㊁１１㊁１３㊁１７㊁１９㊁２１㊁２２㊁２３㊁２４㊁２６㊁２７㊁２８㊁２９㊁３０㊁３３㊁３４㊁３５㊁３６㊁３７㊁３８㊁３９㊁４１㊁４３㊁４４㊁４５㊁４６㊁４８㊁４９㊁５０㊁５１㊁５４㊁５５㊁５６㊁５７㊁５８㊁５９㊁６１㊁６２㊁６３㊁６４㊁６７㊁６８㊁７０
襄阳(ＸＹ)１５ＸＹ－２㊁３㊁４㊁５㊁８㊁１６㊁１７㊁２０㊁２２㊁２４㊁２６㊁３３㊁３９㊁４０㊁４２
河南(ＨＮ)４ＨＮ－３㊁１６㊁１８㊁１９
云南(ＹＮ)８ＹＮ－１２㊁１５㊁１９㊁２２㊁２３㊁２４㊁３９㊁４２
表２㊀ＳＳＲ标记信息
引物编号正向引物序列(５ᶄ~３ᶄ)反向引物序列(５ᶄ~３ᶄ)重复单元扩增片段/ｂｐ退火温度/ħＱ４ＡＧＣＧＴＡＡＣＣＣＡＡＡＴＧＴＧＡＡＡＧＧＡＴＧＴＧＣＴＡＣＴＧＣＧＡＣＴＡＴＧ(ＴＣ)６２８３５１Ｑ１０ＣＴＴＣＴＡＣＧＧＣＧＧＡＡＣＴＧＧＴＣＡＣＡＴＴＣＡＡＣＧＧＧＡＡＣＡＡＣＡ(ＣＴ)６２４７５２Ｑ２８ＡＡＣＣＡＧＴＧＡＣＣＣＣＡＧＣＡＡＧＧＡＴＡＧＣＣＡＡＡＧＡＧＣＡＧＡＡＧＴＡ(ＴＴＣ)６２１４５３Ｑ３６ＧＴＧＴＴＧＧＴＧＡＧＧＡＡＡＡＴＧＣＴＡＡＡＣＣＴＧＣＴＧＧＡＡＧＧＣＴＡＡＡＴ(ＣＴＣ)５２０８５２Ｑ４７ＧＡＣＡＡＧＣＣＧＡＡＧＣＧＡＧＴＧＡＣＡＡＡＧＧＡＡＡＡＣＧＡＣＡＧＣＡＡＣＣ(ＣＴＴ)５２６４５４Ｑ５５ＧＣＡＧＡＡＡＴＣＣＡＣＣＴＣＣＣＡＣＴＣＡＧＣＣＣＡＴＣＡＣＴＡＣＣＴＴＣＡＣＴＴ(ＣＴＡ)６２４８５５Ｑ５７ＡＴＴＣＧＧＣＧＴＴＧＧＡＧＴＴＣＧＡＡＴＧＣＣＡＧＧＧＴＣＣＧＴＴＴＧＴ(ＧＣＧ)５２７７５３Ｑ６２ＡＧＴＡＴＣＣＣＴＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＴＣＣＡＡＡＴＧＣＴＴＧＣＣＧＴＣＣ(ＡＧ)７２８３５３Ｑ６７ＴＡＡＣＧＧＡＧＴＧＧＧＡＣＣＴＡＡＧＡＧＣＡＧＣＧＧＧＧＴＧＣＣＡＴＡＣＡＡＡＧ(ＴＧ)１０２７６５６Ｑ７０ＴＡＴＣＡＡＣＡＡＴＧＣＣＧＣＣＴＴＣＡＡＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＡＡＡＴＡＡＣＴＧ(ＧＴ)１１２９７５３Ｑ７１ＴＣＴＧＡＡＧＴＴＧＡＡＡＡＴＧＧＡＧＣＣＣＣＣＧＣＡＧＣＣＴＧＡＡＧＣＣＴＡＡＴ(ＣＧＧ)７２８２５５Ｑ７８ＴＴＣＴＣＣＣＡＡＡＣＣＴＣＡＡＡＡＣＣＣＴＴＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＣＧＣＣＡＴ(ＣＣＡ)９１６８５４Ｑ７９ＴＧＣＴＣＣＧＴＣＡＡＧＧＣＡＡＡＡＣＧＡＴＧＧＧＣＡＡＣＣＧＡＡＡＣＴＣＡＣ(ＣＧＣ)５２１７５４
㊀㊀根据位点扩增片段分子质量大小的不同来显示位点多态性变化ꎬ依分子质量从大到小依次记录Ａ㊁Ｂ㊁Ｃ㊁Ｄ㊁ ꎮ根据所用ＳＳＲ标记的扩增情况ꎬ计算引物可转移率和多态率:引物可转移率＝(成功扩增引物数/供试引物总数)ˑ１００％ꎬ引物多态率＝(多态性引物条带数/供试引物总数)ˑ１００％ꎮ利用ＰＯＰ￣ＧＥＮＥ１.３２进行观测等位基因数(Ｎａ)㊁有效等位基因数(Ｎｅ)㊁Ｓｈａｎｎｏｎ信息指数(Ｉ)等遗传参数估计ꎮ根据ＰＩＣ－ＣＡＬＣ软件计算每一个引物位点的多态信息含量(ＰＩＣ)ꎮ使用ＮＴＳＹＳ－ｐｃ２.１０ｅ软件对原始数据矩阵进行遗传相似性系数计算和二维主成分分析(ＰＣＡ)ꎬ以ＵＰＧＭＡ聚类绘制聚类树状图ꎮ利用ＣＯＰＨ和ＭｘＣｏｍｐ模块进行Ｍａｎｔｅｌ检验聚类树矩阵与遗传相似系数矩阵一致性ꎮ
２㊀结果与分析
２.１㊀楸树ＳＳＲ引物在滇楸上的可转移性检测总测试１３对楸树ＳＳＲ引物ꎬ从４个不同来源滇楸无性系中各随机取一份材料进行ＰＣＲ预扩增ꎬ结果显示１３对楸树ＳＳＲ引物在４份滇楸无性系中均能有效扩增ꎬ引物可转移率为１００％ꎬ且扩增产物条带清晰ꎬ与预期片段大小相近ꎮ进一步用这１３对引物对其余７１份滇楸无性系进行ＰＣＲ扩增ꎬ最终１３对楸树ＳＳＲ引物在全部７５个滇楸无性系中均表型出多态性分离ꎬ共检测到７６个等位基因ꎬ引物多态率是１００％ꎬ图１为４个无性系样品在Ｑ４位点上等
１５
第２期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀彭婵ꎬ等:楸树ＳＳＲ标记在滇楸中的可转移性与应用
位基因表现型ꎮ可见楸树ＳＳＲ引物在滇楸中有很好的可转移性ꎮ
图１㊀部分滇楸无性系在Ｑ４位点的等位基因变异
２.２㊀楸树ＳＳＲ引物在滇楸上的遗传参数
遗传参数分析显示不同楸树ＳＳＲ引物检测滇楸多态性的能力差异很大(表３)ꎬ各引物位点观测到的等位基因数量(Ｎａ)从２个到１５个不等ꎬ平均为６个ꎻ其中有效等位基因数(Ｎｅ)最高的为引物Ｑ６２(６.００６４)ꎬ有效等位基因数最低为引物Ｑ５７(１.０１３４)ꎬ均值为２.３６４４ꎮ多态信息指数(ＰＩＣ)变
副为０.０１３２~０.８１６０ꎬ平均为０.４０７２ꎬ最高ＰＩＣ为引物Ｑ６２ꎬ其次为Ｑ７０㊁Ｑ７９㊁Ｑ４ꎬ最低为Ｑ５７ꎬ次低为Ｑ３６和Ｑ４７ꎮ比较ＰＩＣ高低两组引物位点的重复单元碱基数ꎬ发现二核苷酸重复单元引物与三核苷酸重复单元引物分布相当ꎬ即核苷酸重复单元与引物所能揭示的多态性能力相关性不大ꎮ
１３对引物平均观测杂合度(Ｈｏ)为０.３９０８略低于平均期望杂合度(Ｈｅ)０.４４９８ꎬＳｈａｎｎｏｎ－Ｗｅａｖｅｒ指数(Ｉ)均值为０.９０３１ꎻＮｅｉ ｓ基因多样性指数(Ｈ)均值为０.４４６８ꎬ遗传相似性系数(ＧＳ)在０.６１８４~１.００００之间ꎬ平均值为０.８２０５ꎬ说明７５个滇楸无性系遗传基础较窄ꎬ基因变异为中度多态性ꎮ
表３㊀ＳＳＲ标记在７５份滇楸中的多态性信息
位点观测等位基因数/个有效等位基因数/个观测杂合度期望杂合度香农多样性指数Ｎｅｉ ｓ基因多样性指数多态信息指数Ｑ４７２.９０１７０.６４０００.６５９８１.１８６８０.６５５４０.５９０５Ｑ１０５２.３５９００.５２０００.５８００１.０１０６０.５７６１０.４９１８Ｑ２８２１.７３９９０.３４６７０.４２８１０.６１６４０.４２５２０.３３４８Ｑ３６３１.１１４１０.１０６７０.１０３１０.２４５２０.１０２４０.０９９８Ｑ４７３１.１４４００.１０６７０.１２６７０.２７８３０.１２５９０.１２０６Ｑ５５５２.１５８１０.５８６７０.５４０２１.０１０２０.５３６６０.４８５６Ｑ５７２１.０１３４０.０１３３０.０１３３０.０４０００.０１３２０.０１３２Ｑ６２１５６.００６４０.５７３３０.８３９１２.１２９００.８３３５０.８１６０Ｑ６７８１.５７８９０.３０６７０.３６９１０.８１４６０.３６６７０.３４８６Ｑ７０７４.７９１３０.７３３３０.７９６６１.７２６３０.７９１３０.７６３９Ｑ７１５１.３５９００.２００００.２６６００.５８４６０.２６４２０.２５３１Ｑ７８６２.０８５７０.４００００.５２４００.８７７６０.５２０５０.４２７１Ｑ７９８２.４８６２０.５４６７０.６０１８１.２２０６０.５９７８０.５４８３平均值５.８４６２２.３６４４０.３９０８０.４４９８０.９０３１０.４４６８０.４０７２
２.３㊀滇楸无性系间聚类与主成分分析
聚类分析可以显示研究个体之间亲缘关系的远近ꎬ利用ＳＳＲ扩增数据结果ꎬ采用ＮＴＳＹＳ软件对滇楸无性系进行ＵＰＧＭＡ聚类分析ꎬ构建亲缘关系树状图(图２)ꎮ７５个滇楸无性系之间的遗传相似性系数变幅在０.６１８４~１.０００ꎬ平均值为０.８２０５ꎮ其中
ＸＹ－４０与ＸＹ－３之间的相似系数最小为０.６１８４ꎬ表明它们之间的遗传距离最大ꎬ遗传相似性程度最低ꎻ
２５㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀东㊀北㊀林㊀业㊀大㊀学㊀学㊀报㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第４７卷
遗传一致度为最大值１.０００的单株有五组:ＧＺ－２６㊁ＧＺ－３８㊁ＧＺ－６３号和ＸＹ－８号ꎬＧＺ－２１号和ＸＹ－２２号ꎬＸＹ－４２号和ＨＮ－１８号ꎬＧＺ－３６号和ＧＺ－３７号ꎬＧＺ－６７号和ＹＮ－１５号ꎬ说明它们的遗传相似性程度最高ꎬ亲缘关系最近ꎬ可能为同种异名ꎬ也可能它们具有相同的亲本或为一方的变异品种ꎮ
当遗传相似性系数为０.７９时ꎬ可将７５个滇楸无性系划分为５个类群ꎬ最大类群Ⅰ占所有供试材料的８９％ꎬ类群Ⅰ在遗传相似性系数为０.８２处又可以分成６个亚群Ａ~ＦꎬＡ亚群２个个体(ＧＺ－１＼ＹＮ－３９)ꎬＢ亚群最大有５４个个体包括所有来源材料ꎬ但绝大多数材料来自贵州(４０个个体)ꎬ呈比较明显的地域性ꎬＣ亚群除ＸＹ－２０外其他均来自贵州(ＧＺ－３＼
ＧＺ－５＼ＧＺ－１７＼ＧＺ－５８)㊁Ｄ亚群和Ｅ亚群分别来自云南(ＹＮ－２３＼ＹＮ－４２)和襄阳(ＸＹ－２＼ＸＹ－３３)㊁Ｆ亚群(ＧＺ－３３＼ＹＮ－１９)ꎬ类群Ⅱ㊁Ⅲ㊁Ⅳ和Ⅴ每类分别由２个㊁１个㊁２个和３个个体构成ꎬ材料来源贵州㊁云南㊁河南和襄阳４地ꎬ说明这几个无性系材料与其他材料遗传距离相对更远ꎮ其中类群Ⅴ比较特殊ꎬＧＺ－６７㊁ＹＮ－１５㊁ＸＹ－３这３个无性系并没有与其他来单株聚在一起ꎬ而是与其他个体相聚最远ꎬ亲缘关系最远ꎮ
图２㊀滇楸群体的Ｎｅｉ ｓ遗传相似性系数ＵＰＧＭＡ聚类图
㊀㊀为检测ＵＰＧＭＡ的聚类结果ꎬ将其转换成协表征矩阵并与相似系数矩阵进行Ｍａｎｔｅｌ统计检验ꎬ结果表明这２个矩阵显著相关ꎬ相关系数为ｒ＝０.８１２３ꎬ表明滇楸无性系间遗传距离与地理距离之间存在不完全相关性ꎬ与ＵＰＧＭＡ聚类结果相符ꎬ说明此次聚类结果能够较好地反映所收集滇楸无性系之间的遗传距离ꎮ
主成分分析图能更直观的反映供试材料之间的亲缘关系(图３)ꎬ对７５份滇楸无性系进行主成分分析ꎬ类群Ⅴ３份材料ＧＺ－６７㊁ＹＮ－１５㊁ＸＹ－３相对集中于分析空间左边ꎬ远离群体样本ꎬ与ＵＰＧＭＡ聚类结果基本一致ꎮ
３　结论与讨论
目前ꎬＳＳＲ标记在植物中的可转移性已经得到许多研究证实ꎬ石晓蒙等[２１]探讨了栎属的无梗花栎㊁蒙古栎㊁夏栎㊁麻栎㊁辽东栎开发的微卫星标记引物在同属栓皮栎中的可转移性情况ꎬ发现这五种栎类的ＳＳＲ引物在栓皮栎的有效扩增总比例占
６６.１％ꎮ其中最高可转移性微卫星引物为夏栎ꎬ高
３５
第２期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀彭婵ꎬ等:楸树ＳＳＲ标记在滇楸中的可转移性与应用
达８０％ꎮ许玉兰等[２２]对利用在松属植物中已经公布的９对ＳＳＲ引物ꎬ以松属双维管束亚属３种(云南松㊁高山松㊁马尾松)３变种(细叶云南松㊁地盘松㊁思茅松)以及扭松共７个种或变种(变型)为材料开展遗传学研究ꎬ进一步阐明了松属ＳＳＲ标记在近缘物种中遗传多样性的应用ꎮ不仅是同属内不同物种间ꎬ即使被试材料不属于一个纲ꎬ在分类地位上差异很大ꎬ也有许多ＳＳＲ标记成功转移扩增的报道ꎬＸｉａｏ
ｅｔａｌ.[２３]随机选取６４对枣基因组测序开发的ＳＳＲꎬ对隶属于８个科７个目２个不同纲的１５个被子植物进行ＳＳＲ引物的转移性研究ꎬ发现在跨科物种间可转移性从２０.３１％到６５.６３％不等ꎬ而在同属的酸枣中引物可转移性为１００％ꎬ可见不同物种中引物的可转移性程度和物种间的亲缘关系远近有一定相关性ꎬ但是陈金金[２４]等人的研究也认为不能仅以可转移引物数与可转移百分率来准确反映不同物种间的遗传关系ꎮ本研究中利用１３个楸树ＳＳＲ微卫星标记分析滇楸７５个无性系的遗传多样性ꎬ引物可转移率为１００％ꎬ共检测到７６个等位基因ꎬ比方乐成等[２０]在楸树中检测出的８９个等位基因少１１个ꎬ但引物多态率为１００％比方高１％ꎬ即表明楸树ＳＳＲ引物在滇楸材料中有很好的可转移性ꎬ也间接反映出滇楸与楸树在基因组上有很高同源性ꎬ这也与李秀兰[１２]应用ＡＦＬＰ和ＳＮＰ标记研究楸树与滇楸的遗传关系结果一致ꎮ因此引物可转移性高低一定程度上能作为不同物种间的基因组结构特征比较以及起源演化关系的科学佐证ꎮ
图３㊀二维主成分分析
㊀㊀遗传多样性研究是评价生物多样性的重要手段ꎬ遗传多样性越高ꎬ环境适应能力就越强ꎬ越有利于保障物种的生存及演化ꎮ此前在楸属植物上遗传多样性的研究多集中在表型性状变异上ꎬ梅芳等[２５]和赵秋玲等[２６]分别对楸树和灰楸的生长与叶部性状㊁姚淑君等[４ꎬ２７]对滇楸花部和果实性状等研究发现ꎬ表型性状的变异范围广泛㊁多样性丰富ꎮ但形态学研究易受环境影响ꎬ反映的信息有限ꎮ因此ꎬ结合分子生物学方法能够更加深入的揭示物种遗传变异规律和变异机制ꎮ
Ｎｅｉ ｓ基因多样性指数(Ｈ)和期望杂合度(Ｈｅ)在林木遗传育种最常用作衡量物种遗传变异的两个指标ꎬ石欣等利用ＩＳＳＲ标记研究中国１０个类型楸树基因多样性指数为０.２９０９ꎬ李秀兰[１２]利用ＡＦＬＰ标记分析从南阳引进的楸树和从贵州等地引进的滇楸Ｈ值也较低ꎬ分别为０.２７４和０.２７３ꎮ本研究中滇楸Ｎｅｉ ｓ基因多样性指数处于０.０１３２~０.８３３５之间ꎬ平均值０.４４６８ꎬ说明遗传多样性较为丰富ꎬ方乐成等[２０]的实验结果Ｈ值为０.６６７７最高ꎬＳＳＲ标记结果Ｈ值更高这可能是因为ＳＳＲ标记是由楸树基因组开发ꎬ针对性更强ꎬ能检测到的多态性更高ꎬ所包含遗传信息也更多ꎮ比较期望杂合度(Ｈｅ)本研究平均值为０.４５２５ꎬ也明显高于郝明灼等[１８]使用
ＩＳＳＲ和ＳＲＡＰ对所收集古楸树(Ｈｅ＝０.３９５０)和国内主栽优树品种(Ｈｅ＝０.２５０８)的分析结果ꎬ但是低于Ｗａｎｇｅｔａｌ.[１３]利用楸树ＥＳＴ－ＳＳＲ检测河南㊁安
４５㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀东㊀北㊀林㊀业㊀大㊀学㊀学㊀报㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第４７卷
徽㊁江苏和山东的４个楸树群体的研究结果(Ｈｅ＝０.７５)ꎮ原因可能是一㊁滇楸和楸树虽同属但不同种ꎬ自身存在一定的遗传差异ꎻ二㊁本研究使用的ＳＳＲ引物开发自楸树全基因组ꎬＥＳＴ－ＳＳＲ引物设计则源于基因组中相对保守的转录区域ꎬ所以具更高的多态性检出率ꎮ
以遗传相似系数为基础进行ＵＰＧＭＡ聚类ꎬ绘制的遗传聚类树状图能直观表现个体间亲缘ꎬ本研究ＵＰＧＭＡ聚类可以将滇楸无性系划分为５个类群ꎬ类群中地域性聚集不明显ꎬＰＣＡ图也直观反映这点ꎮ其中８９％无性系归入Ⅰ类群ꎬ在遗传相似性系数为０.８２处类群Ⅰ又可以分成Ａ~Ｆ６个亚群ꎬ在最大的Ｂ亚群中ꎬ４８份贵州无性系材料有４０份分布于此亚群ꎬ且Ｃ㊁Ｄ㊁Ｅ亚群也各自由来自贵州㊁云南㊁襄阳３地材料汇集ꎬ亚群地域性聚集较明显ꎬ这也与Ｍａｎｔｅｌ统计检验相符ꎮ推测可能是由于我们收集的大部分材料来自贵州㊁云南ꎬ这些材料地域相近㊁生存环境相似ꎬ在选育过程中为发展优良性状ꎬ其中某一地区野生种经驯化后ꎬ被其他地方相互引种为当地栽培种ꎬ并人工选择ꎬ致使各地品种间不断异交ꎬ导致亲缘关系越来越近ꎮ７５个无性系中ＧＺ－６７㊁ＹＮ－１５㊁ＸＹ－３聚类远离其他样本ꎬ说明这３个无性系与其他无性系之间遗传差异最大ꎮ本试验中检测出５组材料之间遗传相似性系数值为１聚在一起ꎬ可能这些无性系是同种异名ꎬ或者是本研究中所用引物数量较少ꎬ尚不能将这些无性系完全分开ꎬ建议后期可以开发更多数量ＳＳＲ引物ꎬ拓宽对滇楸全基因组的检测区间ꎬ或许可以将这些样本分开ꎮ
参㊀考㊀文㊀献
[１]㊀张新叶ꎬ李振芳ꎬ张亚东ꎬ等.湖北引种滇楸优良无性系早期选
择[Ｊ].中国农学通报ꎬ２０１６ꎬ３２(１０):２４－２９.
[２]㊀唐玲ꎬ姜卫兵ꎬ翁忙玲.楸树的园林特性及其开发应用[Ｊ].中国
农学通报ꎬ２００７ꎬ２３(４):２７６－２８０.
[３]㊀麻文俊.楸树优良无性系２－８苗期生理变化与基因表达对干
旱胁迫的响应[Ｄ].北京:中国林业科学研究院ꎬ２０１３. [４]㊀姚淑均ꎬ张守攻ꎬ王军辉ꎬ等.滇楸花部性状的表型多样性研究[Ｊ].中南林业科技大学学报ꎬ２０１３ꎬ２３(１０):１９－２４. [５]㊀张新叶ꎬ彭婵ꎬ李振芳ꎬ等.湖北引种滇楸优良无性系苗期测定与选择[Ｊ].西南林业大学学报ꎬ２０１４ꎬ３４(６):５５－５９. [６]㊀贾继文ꎬ王军辉ꎬ张金凤ꎬ等.楸树与滇楸种间杂交的初步研究[Ｊ].林业科学研究ꎬ２０１０ꎬ２３(３):３８２－３８６.[７]㊀黄国伟ꎬ陈慧玲ꎬ包一鸣ꎬ等.滇楸幼苗无性系光合特性的比较[Ｊ].东北林业大学学报ꎬ２０１５ꎬ４３(１):２０－２３.
[８]㊀江荣翠ꎬ彭方仁ꎬ谭鹏鹏.滇楸体胚发生及生理生化特性研究[Ｊ].林业科技开发ꎬ２０１４ꎬ２８(１):２５－２９.
[９]㊀梅芳ꎬ王军辉ꎬ贾继文ꎬ等.楸树种质生长和叶部性状的遗传多
样性[Ｊ].植物遗传资源学报ꎬ２０１４ꎬ１５(１):２０６－２１０. [１０]㊀张烨然ꎬ杜克兵ꎬ仝瑞冠ꎬ等.３种梓树属植物的抗涝性[Ｊ].东
北林业大学学报ꎬ２０１７ꎬ４５(３):２３－２８.
[１１]㊀徐利霞ꎬ姚小华ꎬ杨水平ꎬ等.旱胁迫条件下３树种幼苗光合特
性比较研究[Ｊ].西南大学学报(自然科学版)ꎬ２００７ꎬ２９(５):
１６８－１７２.
[１２]㊀李秀兰.楸树群体遗传多样性及种间亲缘关系研究[Ｄ].宜
昌:三峡大学ꎬ２０１３.
[１３]㊀ＷＡＮＧＰꎬＭＡＹꎬＭＡＬꎬｅｔａｌ.Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａ￣ｔｉｏｎｏｆＥＳＴ－ＳＳＲｍａｒｋｅｒｓｆｏｒＣａｔａｌｐａｂｕｎｇｅｉ(Ｂｉｇｎｏｎｉａｃｅａｅ)
[Ｊ].ＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｉｎＰｌａｎｔＳｃｉｅｎｃｅｓꎬ２０１６ꎬ４(４).ＤＯＩ:２０.３７３２/
ａｐｐｓ.１５００１１７.
[１４]㊀ＰＯＷＥＬＬＷꎬＭＡＣＨＲＡＹＧＣꎬＰＲＯＶＡＮＪ.Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｒｅ￣ｖｅａｌｅｄｂｙｓｉｍｐｌｅｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅｐｅａｔ[Ｊ].ＴｒｅｎｄｓｉｎＰｌａｎｔＳｃｉｅｎｃｅꎬ
１９９６ꎬ１(７):２１５－２２２.ＤＯＩ:１０.１０６/１３６０－１３８５(９６)８６８９８－１. [１５]㊀ＭＣＧＲＥＧＯＲＣＥꎬＬＡＭＢＥＲＴＣＡꎬＧＲＥＹＬＩＮＧＭＭꎬｅｔａｌ.ＡｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅａｓｓｅｓｓｍｅｎｔｏｆＤＮＡｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ
(ＲＡＰＤꎬＩＳＳＲꎬＡＦＬＰａｎｄＳＳＲ)ｉｎｔｅｔｒａｐｌｏｉｄｐｏｔａｔｏ(Ｓｏｌａｎｕｍ
ｔｕｂｅｒｏｓｕｍＬ.)ｇｅｒｍｐｌａｓｍ[Ｊ].Ｅｕｐｈｙｔｉｃａꎬ２０００ꎬ１１３(２):１３５－
１４４.
[１６]㊀ＶＡＲＳＨＮＥＹＲＫꎬＧＲＡＮＥＲＡꎬＳＯＲＥＬＬＯＳＭＥ.Ｇｅｎｉｃｍｉｃｒｏ￣ｓａｔｅｌｌｉｔｅｍａｒｋｅｒｓｉｎｐｌａｎｔｓ:ｆｅａｔｕｒｅｓａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ[Ｊ].Ｔｒｅｎｄｓ
ｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬ２００５ꎬ２３(１):４８－５５.
[１７]㊀ＫＵＬＥＵＮＧＣꎬＢＡＥＮＺＩＧＥＲＰＳꎬＤＷＥＩＫＡＴＩ.ＴｒａｎｓｆｅｒａｂｉｌｉｔｙｏｆＳＳＲｍａｒｋｅｒｓａｍｏｎｇｗｈｅａｔꎬｒｙｅꎬａｎｄｔｒｉｔｉｃａｌｅ.Ｔａｇ.ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ＆
ＡｐｐｌｉｅｄＧｅｎｅｔｉｃｓ[Ｊ].ＴｈｅｏｒｅｔｉｓｃｈｅＵｎｄＡｎｇｅｗａｎｄｔｅＧｅｎｅｔｉｋꎬ
２００４ꎬ１０８(６):１１４７－１１５０.
[１８]㊀郝明灼ꎬ彭方仁ꎬ王改萍ꎬ等.楸树人工杂交授粉试验及种实分
析[Ｊ].南京林业大学学报(自然科学版)ꎬ２００８ꎬ３２(５):１３１－
１３４.
[１９]㊀史建强ꎬ李艳琴ꎬ张宗文ꎬ等.荞麦及其野生种遗传多样性分析[Ｊ].植物遗传资源学报ꎬ２０１５ꎬ１６(３):４４３－４５０.
[２０]㊀方乐成ꎬ夏慧敏ꎬ麻文俊ꎬ等.基于ＳＳＲ标记的楸树遗传多样
性及核心种质构建[Ｊ].东北林业大学学报ꎬ２０１７ꎬ４５(８):１－
５.
[２１]㊀石晓蒙ꎬ温强ꎬ曹牧ꎬ等.基于近缘种微卫星引物的栓皮栎ＳＳＲ
标记开发及群体检测[Ｊ].分子植物育种ꎬ２０１７ꎬ１５(２):６３３－
６３９.
[２２]㊀许玉兰ꎬ蔡年辉ꎬ白青松ꎬ等.基于微卫星分子标记的云南松及
其近缘种遗传关系分析[Ｊ].西南林业大学学报ꎬ２０１７ꎬ３７
(１):１－９.
[２３]㊀ＸＩＡＯＪꎬＺＨＡＯＪꎬＬＩＵＭꎬｅｔａｌ.Ｇｅｎｏｍｅ￣ｗｉｄｅｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｓｉｍｐｌｅｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅｐｅａｔ(ＳＳＲ)ｌｏｃｉｉｎｃｈｉｎｅｓｅｊｕｊｕｂｅａｎｄｊｕ￣
ｊｕｂｅＳＳＲｐｒｉｍｅｒｔｒａｎｓｆｅｒａｂｉｌｉｔｙ[Ｊ].ＰｌｏＳＯｎｅꎬ２０１５ꎬ１０(５):
ｅ０１２７８１２.ＤＯＩ:１０.１３７１/ｊｏｕｒｎａｌ.ｐｏｎｅ.０１２７８１２.
[２４]㊀陈金金ꎬ彭俊华.小麦ＥＳＴ－ＳＳＲ标记对几种有潜力的禾本科
能源植物的可转移性研究[Ｊ].植物科学学报ꎬ２０１１ꎬ２９(６):
６９６－７０３.
[２５]㊀梅芳ꎬ王军辉ꎬ贾继文ꎬ等.楸树种质生长和叶部性状的遗传多
样性[Ｊ].植物遗传资源学报ꎬ２０１４ꎬ１５(１):２０６－２１０. [２６]㊀赵秋玲ꎬ马建伟ꎬ王军辉ꎬ等.灰楸不同流域种质变异与多样性
研究[Ｊ].植物遗传资源学报ꎬ２０１２ꎬ１３(５):８０３－８０９. [２７]㊀姚淑均ꎬ张守攻ꎬ王军辉ꎬ等.滇楸结实特性及果实性状变异研
究[Ｊ].种子ꎬ２０１３ꎬ３２(３):５－１０.
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第２期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀彭婵ꎬ等:楸树ＳＳＲ标记在滇楸中的可转移性与应用。