药对研究(Ⅴ)

药对研究（Ⅴ）
作者：李伟霞唐于平宿树兰刘培郭建明尚尔鑫钱大玮段金廒
来源：《中国中药杂志》2013年第24期
[摘要]随着现代科学技术的进步，人类正按照自己的目的越来越有效地利用自然资源与其内在规律。

药对是在临床应用中被证明为行之有效的2个相对固定药物的配伍组合，有其内在的规定性，是单味中药与若干方剂之间的桥梁。

借助现代科学技术，选择适宜的研究策略与方法，揭示药对配伍组合规律，对于发展方剂配伍理论、提高中医临床治疗水平和创制现代中药都具有十分重要的意义。

[关键词]药对；研究策略；相互作用；系统生物学；网络药理学
[收稿日期]2013-09-11
[基金项目]国家科技支撑计划项目（2008BAI51B01）；国家自然科学基金项目（81274058）；江苏省高校自然科学重大基础研究项目（10KJA360039）
[通信作者]*唐于平，Tel：（025） 85811695，E-mail： yupingtang@许多学者都有一个共同的认识：中医药学源远流长，博大精深，是中华民族优秀的文化瑰宝；作为炎黄子孙和中医药工作者，我们必须有重大历史责任感和神圣使命感做好中医药研究，把中国几千年的中医药经验进行分析，把的确经得住考验的部分、精华继承下来，并发展到现代科学知识水平。

药对是历代中医药学家在长期遣方用药过程中积累起来的简约而精妙的经验总结，其尽管只是两药相合，却搭配巧妙、比例得当，能很好地诠释中药“合群妙用”的特点。

药对是单味中药与若干方剂之间的桥梁，是许多方剂隐含的规律性特征与辩证施治内涵的体现。

因此，借助现代科学技术与手段，运用适宜于中医药特色的研究策略与方法，揭示药对的配伍特点和临床应用规律，对于解析方剂的组成结构，掌握遣药组方规律，提高临床治疗水平，发展中医药配伍理论和创制现代中药都具有十分重要的理论意义与实践价值。

1通过比较研究药对的配伍规律
比较法是一种应用广泛的，区别事物相同点和不同点最基本的逻辑思维方法，是认识世界不可缺少的一种思维方式。

比较法在中医药教育和科学研究中均得到了有效的应用[1]。

药对不同于单味中药，但却是中药学应用的升华；它也不同于方剂学，而又是方剂学的基础，它是单味中药与若干方剂之间的桥梁，所以比较法就非常适合应用于药对的研究。

药对的比较研究可分为2个方面：一方面是从横向进行比较，主要包括药对-单味药、药对-方剂、单味药-药对-方剂（制剂）、单体成分-单味药-药对-方剂、单体成分-成分群/部位-单味药-药对-方剂等的比较。

如王雁梅等[2]采用RP-HPLC比较测定芎汤（当归9 g、川芎9 g）、生化汤（当归9 g、川芎9 g、桃仁6 g、炮姜2 g、制甘草2 g）、四物汤（当归9 g、川芎9 g、白芍9 g、熟地黄12 g）中阿魏酸煎出量分别为（109.4±3.0），（95.3±1.9），（85.6±2.0） mg·L-1，说明当归-川芎
药对配伍桃仁、炮姜、制甘草，以及配伍白芍、熟地黄后阿魏酸煎出量均降低。

另一方面是从纵向进行比较，主要包括同一药对不同配伍比例、不同提取方法、不同炮制品、不同部位/成分（群）配伍的比较，以及同一药味不同系列药对的比较等。

如张朔等[3]通过比较黄连-吴茱萸不同配比（1∶1，2∶1，3∶1，4∶1，5∶1，6∶1，7∶1，8∶1，9∶1，10∶1）对大鼠胃酸分泌和胃溃疡愈合治疗作用的影响发现，黄连、吴茱萸6∶1具有显著的抑制大鼠胃酸分泌及抗溃疡作用，为最佳配伍比例。

此外，药对的比较研究中还存在横向和纵向同时进行比较的情况。

如于洋等[4]研究发现，不同比例的黄柏、苍术配伍对二甲苯所致小鼠耳肿胀有协同抗炎作用、对小鼠腹腔毛细血管通透性有抑制作用，且尤以苍柏1∶2组作用明显，优于单味药组，同苍柏1∶1（二妙散）组和苍柏2∶1组相比也有增强趋势；对蛋清所致大鼠足肿胀的抗炎作用与苍术组比均有明显增强趋势，但各比例配伍组之间无明显差异。

苍柏1∶1，1∶2组对正常小鼠炭粒廓清功能抑制作用明显。

苍柏不同比例配伍均有抑制大鼠右后足趾肿胀的作用，且尤以苍柏1∶1和2∶1组作用明显，优于黄柏、苍术单用组。

苍柏1∶1组对大鼠佐剂性关节炎（AA）的抗炎作用最优。

通过横向比较，既可观察单体成分、成分群、部位、单味药、药对、方剂之间物质基础与功效的差异取向变化，亦可以药对作为重要桥梁，实现方剂从点到面的系统研究，探讨其内在的关联关系；通过纵向比较，既可筛选出药对发挥疗效的最佳配比，验证药对经典配比的科学性，亦可寻求新的药对的精当配比，拓宽药对的临床应用等。

比较法在药对研究中具有重要的应用价值，通过药对各个方面的比较，根据其功效物质基础、药理效应与机制和临床应用表现，分析得出其配伍的规律性特点。

并可根据其比较结果中的特殊性，推测药对发展的趋势，更好地把握药对发生与发展的规律。

比较法在药对的研究中应用极为广泛，它不但可以独立地被应用于药对的研究中，往往还贯穿于药对的其他研究策略与方法中。

2在体实验和离体实验的整合效应评价
在体实验是对整体动物进行药物作用的观察，包括正常动物和病理模型动物实验。

在体实验保持了机体本身的完整性，包括神经反射、体液联系、完整的内脏功能、机体对药物的代谢排泄等，特别是它可以采用符合临床的给药途径，这些都是体外实验所不如的。

但在对药对配伍效应和作用机制进行研究时，仅在正常动物身上进行试验是往往不够的，还要制备相应的病理模型。

尤其是符合中医“证”的模型。

因为，有些作用在正常动物身上无法体现，如要观察药物的镇痛作用，就首先要制造疼痛的模型；要观察药物的抗炎作用，就要有炎症动物模型等；病理模型模拟疾病，比正常机体更接近病人的机能状态，而机体机能状态不同对药物的反应产生量或质的影响。

如有些药物对正常动物作用不明显，而对病理模型动物却表现出明显的作用。

因此，制备相应的病理模型在药对配伍效应与机制研究中非常重要。

离体实验是指在体外进行的实验，包括各种动物的离体组织，如脑组织、肝组织等；离体器官，如离体心脏、离体子宫、离体肠管、离体气管、离体主动脉条、离体神经等；离体或体外培养的细胞，如血细胞、心肌细胞、脑细胞、胶原细胞等；试管内或培养基内的细菌、病毒等菌群代谢、病原体或癌细胞的实验等。

体外实验可以按照要求严格控制实验条件，有重复性较好、用药量少、节省动物、所得结果较易分析等优点。

但因离体器官、细胞直接接触药物，
在进行此类实验时，应充分估计到中药提取物中的杂质和理化特性的不同对实验结果的影响，如药液的酸碱度、各种电解质和鞣质等。

如有些中药在体外具有较强的抗菌作用，但在体内不一定表现出相同的作用；某些中药提取物含有大量的金属离子，尽管在体外表现出对平滑肌或心肌细胞有明显的药理活性，但口服不一定再现相应的药效。

在体实验有时得到的结论比较笼统，要深入分析作用机制时，往往需要结合离体实验，两者相辅相成，互为补充[5]。

如靳康[6]分别从整体（急性心肌缺血再灌注损伤实验）、器官（离体血管舒张实验）、细胞（原代心肌细胞培养缺氧再复氧损伤实验）和分子（Western blot实验）水平上探讨了丹参-丹皮药对中2种化合物丹酚酸B（Sal B）-丹皮酚（Pae）不同配伍比例（4∶0，3.5∶0.5，3∶1，2.5∶1.5，2∶2，1.5∶2.5，1∶3，0.5∶3.5，0∶4）对急性心肌缺血再灌注损伤模型的影响。

在体实验和离体实验结果均说明，Sal B和Pae两者配比组合在心肌缺血再灌注损伤的保护作用方面与心肌血管的调节可能存在较为密切的联系，且最佳配比
（3∶1）与药典记载的双丹制剂所计算的组合配比也基本一致，其结果相互比较、相互印证，从而保证了实验结论的可靠性。

整体性是中药的基本属性，其通过所包含的多组分、多成分发挥多途径、多靶点的协同、有机整合药效作用。

因而，建立符合方药自身特点、能够客观表征其整体疗效的药效评价体系，揭示其多组分、多靶点协同整合作用机制，是中药现代基础研究的重要组成部分。

而在对药对配伍效应与机制研究过程中，同一实验往往涉及多个检测指标，对同一药对的研究往往还涉及在体实验和离体实验等等，为了综合评价药对的整体药效，往往需要将多个不同性质、不同类别、不同水平、不同计量单位的指标转化成一个无计量单位但能反映事物相对水平和整体变动的综合指标，然后进行综合比较、分析，优选出整体效应最佳的配比，该法即为多指标综合指数法。

目前在药对的整体效应评价中已有不少应用。

依据多指标综合指数法，首先分别对同一效应的相关指标进行单一化处理即标化，当模型组相应指标数值与正常组相比升高时，V标化=（V模型-V给药）/V模型；当模型组相应指标数值与正常组相比降低时，V标化=（V给药-V模型）/V模型。

标化后的指标权重采用专家评分法即同行专家依据模型中各指标在总效应整体评价中的相对重要程度，独立给出各指标的权重系数；然后与近10年来总效应的相关文献中对各个指标的检测频次统计相结合，综合给出各个指标的权重系数。

总效应值即为各指标的标化值乘以权重系数后的加和值。

本课题组[7]采用多指标综合指数法评价了当归-川芎药对不同配伍比例（1∶0，1∶1，1.5∶1，0∶1）、不同提取方法（水提、醇提、先水提后醇提）样品的活血化瘀作用。

归芎药对所有样品中，1∶1醇提物给药组对血瘀大鼠的活血化瘀效果最好；提取方法相同的情况下，当归-川芎配伍后的活血化瘀作用优于当归和川芎的单味药，川芎对血瘀大鼠的活血化瘀作用在一定程度上优于当归；配比相同的情况下，醇提给药组的活血化瘀作用优于水提和先水提后醇提给药组。

该方法的特点是“先综合，后对比”，是近年来在医院管理、医疗质量控制、药理效应比较等综合评价中较为常用的分析方法。

在药理效应中应用此法，综合指数越大，总效应越强，从而准确地评价效应的综合水平。

3功效物质与整合效应关联分析
中药即使是单味药就含有多种化学成分，更不用说药对或方剂了，但只有其中一部分化学物质对临床疗效有贡献，这些有贡献的成分才是要关注和挖掘的中药有效物质，其是否有效都必须与不同的效应紧密关联。

寻找药对有效物质的方法通常都是通过分离分析药对中所含成分（群）结合相应的在体、离体实验来实现的。

如王平等[8]研究大黄-黄芩药对水煎液和3个提取部位（氯仿部位、正丁醇部位、水溶性部位）的抗内毒素活性发现，大黄-黄芩药对的正丁醇部位在体内外实验中均显示良好的抗内毒素活性，其活性强于水溶性部位和氯仿部位。

说明正丁醇部位为大黄-黄芩药对抗内毒素的有效部位。

蔡宝祥等[9]采用正交设计考察丹参提取物（主要含丹参素、原儿茶醛等酚酸类物质）、山楂丙酮提取物（主要含熊果酸等三萜类物质）和山楂无水乙醇提取物（主要含金丝桃苷、芦丁等黄酮类物质）三者之间的交互作用。

结果显示，丹参提取物可降低TC，TG和LDL-C，升高HDL-C；山楂丙酮提取物可降低TC，TG和
LDL-C；山楂无水乙醇提取物可明显升高HDL-C；它们均是调脂的有效部位。

其中，丹参提取物和山楂丙酮提取物可协同降低高脂血症小鼠血清TC，LDL-C，丹参提取物和山楂无水乙醇提取物可协同升高高脂血症小鼠血清HDL-C。

表明各个部位之间存在着对调脂有益的交互作用。

通过分离分析与活性追踪相结合是寻找有效物质的主要方法。

然而，孤立地考察各组分的生物活性虽然简化了对象问题，但却有可能忽略了组分配伍与药效的相关性而导致活性物质丢失的问题，很难全面说明组方成分对药对整体活性发挥的具体贡献。

因此，需要发展一种适合于中医药整合调节配伍机制的有效组分发现的方法与策略。

从20世纪80年代，基因敲除技术已成为现代生物学与医学研究的重要工具，其基本原理是通过去除某一特定基因造成实验动物整体功能的改变，从而辨析该基因对生物体整体功能的贡献。

对于中药有效组分的发现，也可以借鉴基因敲除方法的思想，即通过组分敲除、敲入判断去除和加入某个组分对药对整体药效的影响，进而找出中药的有效组分。

俞凌燕[10]采用组分剔除法，以S180荷瘤小鼠肿瘤质量作为活性评价指标，以此筛选人参配伍麦冬对肿瘤化疗起增效作用的有效组分。

结果发现，人参二醇型皂苷是参麦方对环磷酰胺化疗S180荷瘤小鼠起作用的主要有效组分，而人参三醇型皂苷、麦冬多糖对全方配伍的贡献不显著，麦冬皂苷是无关组分。

该实验中参麦方的主要组分为人参二醇型皂苷、人参三醇型皂苷、麦冬多糖和麦冬皂苷。

4种成分以原方比例配伍而成的即为全方配伍组，组分剔除组（标记为配伍Ⅰ～Ⅳ）分别为全方配伍组中依次缺失人参二醇型皂苷、人参三醇型皂苷、麦冬多糖和麦冬皂苷后的其他3种组分配伍而成。

但此组分剔除法实则为组分配伍。

与徐强等[11-13]采用的免疫亲和色谱柱选择性剔除四逆散中成分，证明甘草酸和芍药苷是四逆散抗小鼠耳部炎症的活性成分及朱敏等[14]采用制备液相色谱技术分别剔除四物汤方中的芍药苷和洋川芎内酯I，比较单体成分、方剔除单体成分和全方的抗血小板聚集和凝血活性，发现芍药苷和洋川芎内酯I在四物汤抗血小板聚集和抗凝血效应上不仅直接发挥作用，也通过影响其他成分而间接发挥效应的方法不同。

后两者的方法是从全方中直接剔除某成分，然后比较单体成分、全方剔除单体成分和全方的活性，通过活性比较来验证被剔除成分对全方的贡献。

本实验室以当归-川芎药对及其单味药为对象，采用制备液相定向剔除目标化合物阿魏酸，结合抗氧化活性来评价阿魏酸在当归、川芎及和当归-川芎药对中的作用。

结果显示阿魏酸在当归、川芎与归芎药对的抗氧化活性方面都具有重要作用，其重要程度强弱依次为当归>川芎>当归-川芎药对。

目前有关药对中的定向剔除还只涉及剔除药对中的某一个成分后的比
较，没有涉及同时剔除2个成分或更多成分后的活性比较，进而评价多成分对全方的贡献度以及和效应之间的关系，这可能是今后研究的重点。

人工神经网络具有大规模分布并行处理、非线性、自组织、自学习、联想记忆等优良特性，是一种非线性映射系统，不要求变量满足正态性及独立性等条件，是一种不同于常规统计方法的信息处理系统，它的这些特征非常符合方药复杂作用体系的规律性探究。

运用MATLAB软件神经网络工具箱，将研究对象制备所得到的各样品总效应分别与对应样品中各成分的含量测定结果进行拟合，即先选择一个样品，先进行效应整合，然后将该样品中成分的含量按照2%的比率进行变化，在各成分含量的左右分别得到2个值，然后依据这5个数值计算出该成分含量的变化率，再乘以该成分在此效应中灌胃给药的含量即得该成分对该效应的贡献率，其他样品的效应与各个成分含量的相关性同此法进行拟合分析，进而依据各拟合值分析各个成分对各效应的影响大小。

神经网络系统处理后所得到的图即为该样品所对应的效应与效应成分的关联图，其中颜色和数值表示各样品中各成分分别对相应效应的影响程度，颜色越深数值越大，代表该成分的含量对效应变化影响越大。

本课题组[15]在基于多指标综合指数法对归芎药对不同配比组方进行效应整合的基础上，采用人工神经网络方法将归芎药对中主要效应物质含量与其整合效应值进行拟合与分析，以期揭示归芎药对中物质与效应的关联性及其程度。

通过拟合归芎药对7个配比（1∶0，2∶1，1.5∶1，1∶1，1∶1.5，1∶2，0∶1）和3种提取方法（水提液、50%醇提液、先水提后95%醇提液）所得样品中主要物质（绿原酸、咖啡酸、阿魏酸、洋川芎内酯Ⅰ、洋川芎内酯H、藁本内酯、正丁烯基苯酞、总芳香酸、总苯酞内酯）与养血补血、活血化瘀和调经止痛整合效应的关联，结果发现养血补血的效应物质主要为芳香酸，尤其是绿原酸和咖啡酸；芳香酸和苯酞内酯都是活血效应物质，尤其是绿原酸、洋川芎内酯I 和H对活血效应影响较大；调经止痛的效应物质也为芳香酸和苯酞内酯，尤其是藁本内酯、咖啡酸、阿魏酸和洋川芎内酯I对调经止痛效应的影响较大。

说明归芎药对中芳香酸和苯酞内酯均对养血补血、活血化瘀和调经止痛功效具有贡献，芳香酸更偏重于养血活血，苯酞内酯更偏重于调经止痛。

通过这些研究阐释了当归-川芎药对不同功效的效应物质基础及不同成分对药对整方功效的贡献大小，为中医方药复杂效应物质基础研究提供了探索性思路与方法。

4响应曲面法在药对相互作用研究中的应用
不同药物单独作用于人体，可产生不同的药理效应。

当多种药物组合应用时，由于它们的相互作用，药物的理化性质、体内过程（吸收、分布、生物转化和排泄）或组织对该药物的敏感性可能发生变化，从而改变了药物的药理和毒理效应，可使药效加强或副作用减轻，也可使药效减弱或副作用增加。

与多数化学药物相比，中药及方剂的多组分、多靶点特性决定了药物相互作用及其机制更为复杂。

因此，我国学者郑青山等[16]提出了复方药效学模型和组分相互作用模型，对中药及方剂之间的相互作用开展了探索性研究。

常用的药物相互作用研究方法有定性的辐射分析法、分数分析法、概率分析法、平行线分析法和定量的响应曲面分析法等。

每一种模型都有自身的特点和应用范围，定性的分析方法只能定性的分析药物之间的相互作用。

药物药效学的研究对于指导临床用药具有非常重要的作用，只有定量才能更加直观地体现药物之间的相互作用。

响应曲面法是一种新颖而有效的研究药物相互作用的方法，它不仅可以定性和定量地研究药物间的药效学相互作用规律，而且还可以寻找到效果满意、不良反应最小的药物
间的最佳阈值反应范围。

如史旭芹等[17]采用响应曲面设计与分析法，定量研究当归-黄芪不同配比（0∶1，1∶5，2∶5，2∶3，1∶1，3∶2，5∶2，5∶1，1∶0）提取物养血补血功效的相互作用。

结果显示，当归-黄芪配伍接近一半区域呈现出协同效应，在所测试的比例范围（1∶5～5∶1）均有协同效应表现，总体表现为高剂量组的协同作用强于低剂量组，尤其是当归剂量在10～40 g、黄芪剂量在90～180 g以及当归剂量在50～100 g、黄芪剂量在20～100 g表现出很强的协同效应（相互作用值-1）。

在药典规定剂量范围也均呈现出协同作用，其中当归补血汤亦在这个范围内。

通过建立数学模型来预测两药味之间的最佳配伍组合，可为药对配伍相互作用研究提供新的思路与方法。

5系统生物学和网络药理学的应用
系统生物学是生命科学研究领域的一门新兴学科。

它采用系统的方法，将研究对象看作一个整体，通过基因组学、蛋白质组学和代谢组学等各种高通量的组学平台全方位地获取海量的数据信息，并利用生物信息学及各种数学方法对数据分析处理，从而寻找规律，揭示自然界生物体所蕴涵的奥秘。

这与中医学从整体的角度去看待个体和认识、诊治疾病的理论殊途同归。

因此，在目前中医药的研究中，系统生物学研究的各种方法也在得到越来越多的重视和运用[18-24]。

随着系统生物学及多向药理学的方法相互融合，形成了新药发现、药物靶标预测及药理、毒理机制研究的新学科，即网络药理学。

它从生物网络的角度系统地揭示药物和机体相互作用的规律和原理，是集整体、动态、分析于一体的全面系统的研究技术，与中医整体观与辨证论治的原则不谋而合。

网络药理学为解析中药复杂体系、阐述中医药理论的科学内涵提供了新的思路和方法[25]。

近年来，这个理念已被应用于筛选具有协同作用的中药组合、基于网络的中医药药理研究、中药配伍规律揭示、药物靶标或作用通路预测等等[26-29]。

随着网络药理学的发展，它逐步与更多其他方法联合使用来解决更中医药复杂科学问题，如Pei L X等[30]将网络药理学和药代动力学联合使用来研究中药方剂复杂的物质基础，以补肾壮骨方为代表，首先明确该方剂的主要活性成分，然后通过网络药理学的方法寻找到了和这些成分相关的基因。

以此为引子，可以尝试将系统生物学和网络药理学联合使用来阐明药对的作用机制，以期为药对功效物质基础和作用机制的研究提供新的策略与方法。

6基础研究与临床应用相结合
药对配伍的研究自20世纪以来取得了不少突破性成果，成为了中医药现代化研究中的活跃领域之一，也是阐明方剂配伍机制的重要基础。

展望21世纪药对的配伍研究，需更多着眼于结合药对的功效物质和配伍效应与机制研究来全面探讨两药味配伍后在人体内发挥药效的基础条件、作用部位、作用物质、如何作用、以及由此而可能引起的继发效应等，在基础理论方面解答和认识药对在人体生理、病理条件下通过什么途径、如何起药效作用，进而对药对在方剂中的加减变化、使用指征、运用范围乃至注意事项等作出科学的阐释。

使药对的实验研究结果成为阐明方剂配伍理论、指导药对及其在方剂中临床运用的科学依据，成为药对和方剂乃至中医药理论的有机组成部分，成为促进药对和方剂学科现代化的内在动力[31]。

随着社会的发展，药对配伍的研究还必须密切联系临床实际与新药的研制开发。

如芎芍胶囊是在传统活血化。