一种全氟辛酸类药物通用人工抗原的合成方法[发明专利]

[19]
中华人民共和国国家知识产权局
[12]发明专利申请公布说明书
[11]公开号CN 101328216A [43]公开日2008年12月24日
[21]申请号200810021105.X [22]申请日2008.07.24
[21]申请号200810021105.X
[71]申请人江南大学
地址214122江苏省无锡市蠡湖大道1800号
[72]发明人胥传来 李灼坤 彭池方 马伟 徐丽广
袁媛 谢会玲 [74]专利代理机构无锡市大为专利商标事务所代理人时旭丹 刘品超
[51]Int.CI.C07K 14/765 (2006.01)C07K 1/14 (2006.01)C07K 1/10 (2006.01)
权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 1 页
[54]发明名称
一种全氟辛酸类药物通用人工抗原的合成方法
[57]摘要
一种全氟辛酸类药物通用人工抗原的合成方法，
属于生物化工技术领域。

本发明以全氟辛酸PFOA为
半抗原，用碳二亚胺将其与载体蛋白牛血清蛋白BS
A 偶联，用紫外扫描仪测定偶联物的偶联比。

本发
明成功合成了全氟辛酸的人工抗原全氟辛酸－牛血
清蛋白，合成步骤简洁，有效，完全可用于免疫分
析中，为以后人们的研究提供了必需的人工抗原，
可以满足国内对其研究的需要。

200810021105.X权 利 要 求 书第1/1页 1.一种全氟辛酸类药物通用人工抗原的合成方法，其特征是以全氟辛酸PFOA为半抗原，用碳二亚胺法将其与载体蛋白牛血清蛋白BSA偶联，用紫外扫描仪测定偶联物的偶联比，制备全氟辛酸类药物通用人工抗原，即全氟辛酸-牛血清蛋白；步骤为：
((1)人工抗原的合成：全氟辛酸、牛血清蛋白以摩尔比为40∶1的比例反应，取全氟辛酸、牛血清蛋白溶于0.1mol/L的pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液中，充分溶解后逐滴加入现配的水溶性碳二亚胺的甲醇溶液，室温轻柔搅拌反应3小时，即得偶联物PFOA-BSA人工抗原混合液；
透析袋前处理：取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去离子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用；
将人工抗原混合液移入透析袋中，用3×2L的0.01M的pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液和3×2L的去离子水透析3天，每天三次换液；
(2)人工抗原的鉴定：全氟辛酸-牛血清蛋白采用紫外扫描测定其偶联比，在吸收波长223nm处测吸光值，并计算其偶联比。

200810021105.X说 明 书第1/3页一种全氟辛酸类药物通用人工抗原的合成方法
技术领域
一种全氟辛酸类药物通用人工抗原的合成方法，属于生物化工技术领域。

背景技术
全氟辛酸，英文名称：Perfluorooctanoic acid(PFOA)，CAS号335-67-1，分子式为C8HF15O2。

全氟辛酸(PFOA)及其盐是一种常用的氟表面活性剂，具有很强的疏水性和疏油性，其化学结构远较其它表面活性剂稳定。

由于它优异的耐热、耐低温、自润滑性及化学稳定性等，被应用在航天、电子、化学和消防领域，并被用在生活部门如不粘锅具、防水透气材料(如防水衣物)、皮革、汽车部件及微波炉爆玉米花袋等。

PFOA难以降解，在环境中具有积累性和持久性，但其对人及环境的影响至今还没得出明确的结论。

P F O A可通过摄取、吸入、皮肤接触而被吸收，从而诱发癌症、肝肿大等疾病。

一些动物实验表明，PFOA能够扰乱脂肪酸的新陈代谢，影响生殖系统，可能与乳腺、睾丸、胰和肝肿瘤有关。

PFOA的生物毒性作用还包括对免疫系统产生抑制作用，干扰线粒体代谢，导致肝细胞损伤，疾病感染致死等。

由于其疏水疏油的特点，PFOA全氟有机物被生物摄取后一般不在脂肪组织中积累，其大部分与血浆蛋白结合存在于血液中，其余一部分则蓄积在动物的肝脏组织和肌肉组织中。

由于它的这种分布特点以及没有很好的检测方法，使得P F O A的污染问题很长时间没有受到科学家的重视。

全氟表面活性剂的研究在国际上已然成为环境科学和毒理学研究的热点，国内研究还尚属起步阶段。

现有的仪器检测法样品前处理复杂，所需的仪器昂贵，成本高，检测时间长，很难实现对PFOA进行快速、准确的检测，有必要研究针对PFOA的快速、便携的免疫检测技术。

这就需要合成能产生簇特异性抗体的免疫原。

目前为止，国内外尚没有针对全氟辛酸PFOA的免疫检测方法的报道，为了弥补这一空白，设计合成了直接以全氟辛酸(Perfluorooctanoic acid)为半抗原的用于全氟有机物检测的完全抗原。

发明内容
本发明的目的是提供一种全氟辛酸类药物通用人工抗原的合成方法。

所制备的产品用于全氟辛酸的免疫分析方法研究，为今后人们的研究提供了必需的免疫原。

本发明的技术方案：一种全氟辛酸类药物通用人工抗原的合成方法，以全氟辛酸P F O A为半抗原，用碳二亚胺法将其与载体蛋白牛血清蛋白B S A偶联，用紫外扫描仪(UNICO，UV-2802pcs)测定偶联物的偶联比，制备全氟辛酸类药
物通用人工抗原，即全氟辛酸-牛血清蛋白；步骤为：
(1)人工抗原的合成：全氟辛酸、牛血清蛋白以摩尔比为40∶1的比例反应，取全氟辛酸、牛血清蛋白溶于0.1mol/L的pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液中，充分溶解后逐滴加入现配的水溶性碳二亚胺的甲醇溶液，室温轻柔搅拌反应3小时，即得偶联物PFOA-BSA人工抗原混合液；
透析袋前处理：取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去离子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用；
将人工抗原混合液移入透析袋中，用3×2L的0.01M的pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液和3×2L的去离子水透析3天，每天三次换液；
(2)人工抗原的鉴定：全氟辛酸-牛血清蛋白采用紫外扫描测定其偶联比，在吸收波长223nm处测吸光值，并计算其偶联比。

本发明的有益效果：本发明成功合成了P F O A的免疫原，合成步骤简洁，有效，完全可用于免疫分析当中，为以后人们的研究提供了方便的途径，可以满足国内对其研究的需要。

附图说明
图1PFOA、BSA及其偶联物的紫外扫描组合图。

具体实施方式
实施例1
(1)人工抗原的制备
称取全氟辛酸2mg(0.00483mmol)、牛血清蛋白BSA 8mg(0.000121mmol)溶于1mL PBS(0.1mol/L)溶液中，充分溶解后逐滴加入现配的水溶性碳二亚胺E D C的甲醇溶液(40μL E D C溶于50μL甲醇)，室温轻柔搅拌反应3小时。

即得偶联物PFOA-BSA混合液。

透析袋前处理：取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去离子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用。

将反应液放入透析袋于0.01m o l/L的P B S中透析3天，每天三次换液。

(2)全氟辛酸人工抗原的鉴定
偶联比测定，即估算偶联物中被偶联的两种分子的比率(偶联比率)的方法，虽然种类很多，但都是依据检测偶联物中被偶联的两种分子含量(或相对含量)的原理建立起来的.分光光度法是利用物质对光的吸收与其浓度呈比例关系的原理分别测定被偶联的两种分子浓度.在大分子与小分子偶联物中，两种分子均有各自不同的紫外扫描光谱，并表现出光谱图迭加的性质。

摩尔吸收系数ε：取全氟辛酸(PFOA)纯品配制浓度为1mg·mL-1的超纯水溶液，通过紫外扫描可知P F O A的最大吸收波长为209n m，在209n m处的吸光值为0.760。

摩尔吸光系数计算为：εA＝吸光值/摩尔浓度。

本实验计算得
εA209＝314.05L·mol-1。

偶联物蛋白浓度测定：配制浓度为0，40，60，80，100，120，160，200μg·mL-1
的牛血清蛋白溶液1.5mL，加入5mL考马斯亮蓝染色液，立即混匀，30℃水浴温热5分钟，每个浓度做平行样.在595n m处测吸光值，绘制蛋白浓度与吸光值的关系曲线。

将偶联物溶液按一定比例稀释，在595nm处测定PFOA-牛血清蛋白抗原溶液的吸光值，从曲线上得到偶联物溶液的相应的蛋白浓度。

本实验计算得偶联物溶液的蛋白浓度为4.1016mg·mL-1。

偶联比测定：分别配制浓度0.5mg·mL-1的PFOA-BSA及0.5mg·mL-1的牛血清蛋白(B S A)，通过紫外扫描可知P F O A-B S A的最大吸收波长为223n m，在最大吸收波长223n m处的最大吸光值为2.2465；B S A在223n m处的最大吸光值为2.2024。

2.2465与2.2024的差0.0441可代表偶联物PFOA-BSA中的PFOA的紫外吸收值(即偶联物的吸光值一蛋白质的吸光值)。

根据上述差值和P F O A的摩尔吸光系数，可算得P F O A-B SA中的P F O A的摩尔浓度为0.0001404m o l/L，再转成μg·mL-1浓度为58.14μg·mL-1。

由已知的PFOA-BSA的质量浓度减去这个P F O A浓度，得到P F O A-B S A中的B S A质量浓度，同样转化为摩尔浓度。

则偶联比为P F O A-B S A中的P F O A的摩尔浓度与P F O A-B S A中的B S A的摩尔浓度之比值。

本实验计算得偶联比r≈21.03。

200810021105.X说 明 书 附 图第1/1页
图1。