HUNGATE亨盖特滚管法厌氧培养操作步骤
亨盖特滚管技术
厌氧菌的分离和培养关键词：厌氧菌分离培养 2008-06-12 00:00 来源：丁香园点击次数：23001 目的1.1 了解厌氧微生物的生长特性1.2 观察厌氧微生物（双歧杆菌）的形态特征1.3 掌握厌氧微生物的滚管分离、培养与计数技术2 原理目前培养厌氧微生物的简便而又有效的技术包括有：厌氧箱培养技术；厌氧罐培养技术；厌氧袋培养技术；亨盖特厌氧滚管技术。
这里介绍的是亨盖特厌氧滚管技术。
亨盖特厌氧滚管技术是美国微生物学家亨盖特（Hungate）于1950年首次提出并应用于瘤胃厌氧微生物研究的一种厌氧培养技术。
以后这项技术又经历了几十年的不断改进，从而使亨盖特厌氧技术日趣完善，并逐渐发展成为研究厌氧微生物的一整套完整技术。
而且多年来的实践已经证明它是研究严格、专性厌氧菌的一种极为有效的技术。
亨盖特厌样滚管培养技术不仅可用于有益厌氧菌如双歧杆菌等的分离、与活菌培养计数，还可以用于有害腐败菌（如酪酸菌）或病原菌（如肉毒梭状芽孢杆菌）的分离与鉴定。
3 材料3.1 样品双歧酸奶（液体）、双歧杆菌制剂（固体）。
3.2 培养基改良MRS培养基，PTYG培养基。
3.3 仪器和器具亨盖特厌氧滚管装置一套，厌氧管，厌氧瓶，滚管机，定量加样器4 流程铜柱除氧→预还原培养基→稀释用液制备→稀释样品→滚管→培养→计数5 方法5.1铜柱系统除氧铜柱是一个内部装有铜丝或铜屑的硬质玻璃管。
此管的大小为40—400mm，两段被加工成漏斗装，外壁绕有加热带，并与变压器相连来控制电压和稳定铜柱的温度。
铜柱两端连接胶管，一端连接气钢瓶，一端连接出气管口。
由于从气钢瓶出来的气体如N2、CO2和H2等通常都含有O2，故当这些气体通过温度约360℃的铜柱时，铜和气体中的微量O2化合生成CuO，铜柱则由明亮的黄色变为黑色。
当向氧化状的铜柱通入H2时，H2与CuO中的氧就结合形成H2O，而CuO又被还原成了铜，铜柱则又呈现明亮的黄色。
此铜柱可以反复使用，并不断起到除氧的目的。
检验科厌氧培养的规范操作流程
检验科厌氧培养的规范操作流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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厌氧菌的培养方法
祁红兵
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1
物理方法包括遮断空气法、煮沸法、真空法、空 气置换法、气体喷射法或转管法等
化学方法包括焦性没食子酸法、铁丝绒法、保险 粉法等
生物学方法包括与需氧菌共生好氧法、燕麦发芽 法等
混合法包括厌氧罐（袋）法、厌氧手套箱法或厌 氧室法、空气置换铁丝绒法、空气置换钯粒法等。
D
2
1 液体培养基的厌氧培养法
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2.6 生物好氧厌氧培养法
疱肉培养基: 牛肉渣
0.5g
牛肉浸液 7ml
液面上加盖3～4mm厚的融化凡士林，灭菌。
生物好氧厌氧培养方法
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23
2.7 转管技术和气体喷射培养法
钢瓶进气
360℃
铜柱
除氧气体
微量O2
（亮黄色）
H2源 CuO （黑色）
接种或移植
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24
2.8厌氧手套箱法
又称厌氧室法
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27
4 厌氧菌的保存
4.1继代保存：
以GAM半固体流动培养基和TEP半固 体培养基作传代培养保存。用毛细吸管吸 菌进行继代培养，使用白金接种环移菌接 种，可以避免有的菌在操作中接触空气或 氧化物而死亡。数周作一次继代培养。新 分离的的菌种，在几个月内，每3～4星期 传代一次。被保存的菌种，放室温下暗处。 最好是不同菌用不同培养基保存。
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13
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2.2.3 保险粉的厌氧罐培养法
二亚硫酸钠（Na2S2O4） 碳酸氢钠 无水硫酸钠
不用触媒
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2.3 钢丝绒法
酸性硫酸铜溶液 钢(铁)丝绒
铜和铁的络合物
O2
厌氧指示剂
亨盖特厌氧滚管装置
亨盖特厌氧滚管装置
亨盖特滚管技术是在厌氧微生物分离培养实验中一个重要的部分，是将培养基和接种物混合后利用滚动厌氧试管的方式将培养基均匀的涂布在试管内表面，如同进行常规的平板培养，在厌氧的条件下培养单个菌落，之后则可以挑取单个菌落达到分离的目的。
常规方法是将融化的培养基于接种物混合后迅速置于冰上进行滚动，琼脂降温后便凝固于试管内表面。
这种操作效率低，而且琼脂的厚度不容易控制均匀，此时采用电机驱动的滚管机就是实验人员的最佳选择。
自行设计生产的亨盖特滚管机采用直流电机无极调速方式驱动一根软性滚轴带动试管转动，并采取加冰水或者是电子制冷水对试管进行冷却，高速转动的滚轴可以提供极佳的琼脂厚度均一性，提高滚管成品率。
一、工作环境
1、电源：DC24V 1A。
二、技术参数
1、转速可调，最大转速550rpm；
2、转速数字显示；
3、具水位控制功能；
4、采用电磁阀控制排水；
5、可采用碎冰、冰盒、冰袋或配套电子制冷器作为冷媒；
6、具防试管脱位功能；
7、不受试管盖形状影响。
2022年湖北工业大学食品科学与工程专业《微生物学》期末试卷B(有答案)
2022年湖北工业大学食品科学与工程专业《微生物学》期末试卷B(有答案）一、填空题1、放线菌的代表属有______、______、______、______等。
2、朊病毒与真病毒有巨大差别，例如______、______、______、和______等。
3、6分子葡萄糖经HMP途径进行直接氧化和一系列复杂反应后，最终产物为______个______分子，______个______分子和6个CO2。
4、从元素水平来看，微生物的有机氮源有______和______两类，无机氮源则有______、______和______三类。
5、食用菌一般是指可食用的有大型______的高等真菌，分类上主要属于______，其次为______。
6、我国古代劳动人民在微生物应用方面的主要贡献是发明用______独特工艺加工______原料以生产______。
7、厌氧菌的固体培养方法有：______、______、______、______和______。
8、参与硫循环的微生物有______、______、______。
9、根据感受态建立方式，可以分为______转化和______转化，前者感受态的出现是细胞一定生长阶段的生理特性；后者则是通过人为诱导的方法，使细胞具有摄取DNA的能力，或人为地将DNA导入细胞内。
10、病原菌或病原体的侵袭力由______、______和______三方面组成。
二、判断题11、支原体是一类无细胞壁，也是整个生物界中发现的能独立营养的最小原核生物。
（）12、被动扩散是微生物细胞吸收营养物质的主要方式。
（）13、一般地说，形态构造和生活史越复杂的微生物，它们的次生代谢产物的种类就越多。
（）14、病毒包膜系病毒以芽出方式成熟时自细胞膜衍生而来，故其结构和脂质种类与含量皆与细胞膜相同。
（）15、足细胞可在曲霉和青霉的分生孢子梗的基部找到。
（）16、（G＋C）mol%值的差别，可作为微生物系统分类工作中正确设置分类单元的可靠依据。
2022年山西师范大学食品科学与工程专业《微生物学》期末试卷A(有答案)
2022年山西师范大学食品科学与工程专业《微生物学》期末试卷A(有答案）一、填空题1、G＋菌细胞壁的主要成分是______和______；前者的双糖单位是由一个______通过______与另一个______相连构成，这一双糖单位易被______水解，而导致细菌细胞壁“散架”而死亡。
2、当宿主细胞内的大量子代噬菌体成熟后，由于水解细胞膜的______ 和水解细胞壁的______等的作用，促进了细胞的裂解。
3、ED途径的一特征反应是将2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖（KDPG）裂解为______和______，因此，其特征酶为______。
4、通常牛肉膏蛋白胨培养基适合于培养______、应将pH调至______；高氏一号培养基适合于培养______、应将pH调至______；马丁氏培养基合于培养______、pH为______；马铃薯葡萄糖培养基适合于培养______、pH为______。
5、真菌细胞壁的主要成分是______，另有少量的蛋白质和脂类。
低等真菌的细胞壁成分以______为主，酵母菌以______为主，而高等陆生真菌则以______为主。
6、第一个用自制显微镜观察到微生物的学者是______，被称为微生物学研究的先驱者，而法国学者______和德国学者______则是微生物生理学和病原菌学研究的开创者。
7、厌氧菌的固体培养方法有：______、______、______、______和______。
8、自然界的碳素循环主要包括______和______两个过程。
9、通常情况下，菌种可保藏在______℃和______℃的低温下。
10、在补体结合实验中，无溶血现象出现称为补体结合实验______，说明样品中______抗原存在。
二、判断题11、光合细菌和蓝细菌都只含有叶绿素，所以都能进行光合作用，同化CO2合成菌体有机质。
（）12、氮素营养物质不仅用来合成细胞中的蛋白质，还可以为部分微生物提供能源。
厌氧培养箱之厌氧菌的培养操作
厌氧培养箱之厌氧菌的培养操作厌氧菌在有氧的情况下不能生长。
要培养厌氧菌，必须创造一个无氧的环境。
通常用培养基中加入还原剂，或用物理、化学方法去除环境中的游离氧，以降低氧化还原电势。
如疱肉培养基、硫基乙酸钠培养基，牛心脑浸液培养基等。
常用的厌氧培养方法有许多，可根据实际情况选用。
1．厌氧缸法接种好标本的平板或液体培养基试管，可放入厌氧缸内培养，厌氧缸是普通的干燥缸，用物理化学的方法使缸内造成厌氧环境，从而将厌氧菌培养出来。
2．厌氧袋（Bio-bag）即在塑料袋内造成厌氧环境来培养厌氧菌。
塑料袋透明而不透气，内装气体发生管（有硼Q化钠的碳酸氢钠固体以及5%柠檬酸安瓿）、美兰指示剂管、钯催化剂管、干燥剂。
放入已接种好的平板后，尽量挤出袋内空气，然后密封袋口。
先折断气体发生管，后折断美兰指示剂管，命名袋内在半小时内造成无气环境。
如不突变表示袋内已达厌氧状态，可以孵育。
3．厌氧手套箱（Anaerobie glove box）即厌氧培养箱。
它是一个密闭的大型金属箱，箱的前面有一个有机玻璃做的透明面板，板上装有两个手套，可通过手套在箱内进行操作，故名。
箱侧有一交换室，具有内外二门，内门通箱内先关着。
欲放物入箱，先打开外门，放入交换室，关上外门进行抽气和换气（H2，CO2，N2）达到厌氧状态，然后手伸入手套把交换室内门打开，将物品移入箱内，关上内门。
箱内保持厌氧状态，也是利用充气中的氢在钯的催化下和箱中钱残余氧化合成水的原理。
该箱可调节温度，本身是孵箱或孵箱即附在其内，还可放入解剖显微镜便于观察厌氧菌菌落，这种厌氧箱适于作厌氧细菌的大量培养研究，大量培养基可放入作预还原和厌氧性无菌试验。
金属硬壁型厌氧箱的抽气、充气、厌氧环境和温度等均系自动调节。
4.厌氧盒：原理同厌氧袋，有成品销售。
5.生物耗氧法：在一密闭的容器内放以生物（多是植物），消耗氧气，同时产生二氧化碳，供细菌生长用。
我没见过。
6.焦性末食子酸法：在一洁净的玻片上铺上纱布或滤纸，均匀撒上焦性末食子酸，然后再混入NaHCO3粉末或NaOH溶液，迅速将已接种细菌的平板倒扣在上面，用融化的白蜡封边，造成一个封闭空间。
厌氧培养方法
厌氧性细菌的分离培养法厌氧菌需有较低的氧化—还原势能才能生长(例如破伤风梭状芽孢杆菌需氧化—还原电势降低至0.11V时才开始生长)，在有氧的环境下，培养基的氧化—还原电势较高，不适于厌氧菌的生长。
为使培养基降低势，降低培养环境的氧压是十分必要的。
现有的厌氧培养法甚多，主要有生物学，化学和物理学3种方法，可根据各实验室的具体情况而选用。
1．生物学方法培养基中含有植物组织(如马铃薯、燕麦、发芽谷物等)或动物组织(新鲜无菌的小片组织或加热杀菌的肌肉、心、脑等)，由于组织的呼吸作用或组织中的可氧化物质氧化而消耗氧气(如肌肉或脑组织中不饱和脂肪酸的氧化能消耗氧气，碎肉培养基的应用，就是根据这个原理)，组织中所含的还原性化合物如谷胱甘肽也可以使氧化—还原电势下降。
另外，将厌氧菌与需氧菌共同培养在一个平皿内，利用需氧菌的生长将氧消耗后，使厌氧菌能生长。
其方法是将培养皿的一半接种吸收氧气能力强的需氧菌(如枯草杆菌)，另一半接种厌氧菌，接种后将平皿倒扣在一块玻璃板上，并用石蜡密封，置37恒温箱中培养2~3d 后，即可观察到需氧菌和厌氧菌均先后生长。
2．化学方法利用还原作用强的化学物质，将环境或培养基内的氧气吸收，或用还原氧化型物质，降低氧化—还原电势。
（１）李伏夫(B．M．JIbbob)法此法系用连二亚硫酸纳(Sodium hydrosulphite)和碳酸钠以吸收空气中的氧气，其反应式如下：Na2S204十Na2C03十O2一→Na2SO4十Na2SO3十C02取一有盖的玻璃罐，罐底垫一薄层棉花，将接种好的平皿重叠正放于罐内(如系液体培养基，则直立于罐内)，最上端保留可容纳1~2个平皿的空间(视玻罐的体积而定)，按玻罐的体积每1000cm3空间用连二亚硫酸纳及碳酸钠各30g，在纸上混匀后，盛于上面的空平皿中，加水少许使混合物潮湿，但不可过湿，以免罐内水分过多。
若用无盖玻罐，则可将平皿重叠正放在浅底容器上，以无盖玻罐罩于皿上，罐口周围用胶泥或水银封闭(如图１－５)。
产甲烷菌的分离纯化培养及其培养基对于菌株的选择作用
产甲烷菌的分离纯化培养及其培养基对于菌株的选择作用庞德公;杨红建【摘要】产甲烷菌是一类能够将无机或有机化合物经过厌氧发酵转化成甲烷和二氧化碳的严格厌氧古细菌,其参与的产甲烷作用通常发生在厌氧发酵过程的最后一步.发酵产物甲烷则是目前加剧全球气候变暖的一种重要温室气体.为了进一步了解不同种类产甲烷菌的生物学特性,近10年来对于产甲烷菌分离培养技术的研究不断深入并受重点关注.作者介绍了产甲烷菌的典型生境与生物学地位、产甲烷菌的分类及生理特征,并着重阐述了产甲烷菌分离纯化培养技术及培养基中不同底物与化学抑制剂对于产甲烷菌的选择作用.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2010(037)006【总页数】4页(P32-35)【关键词】产甲烷菌;分离纯化;选择性培养基【作者】庞德公;杨红建【作者单位】中国农业大学动物科技学院,北京,100193;中国农业大学动物科技学院,北京,100193【正文语种】中文【中图分类】Q93-3产甲烷菌是水生古细菌门(euryarchaeota)中一类可将无机或有机化合物经厌氧发酵转化成甲烷和二氧化碳的严格厌氧古菌,由于其所参与的甲烷生物合成是自然界碳素循环中的关键链条,同时也是温室气体甲烷最主要的生物学合成途径,因而在全球气候变暖的大趋势下,产甲烷菌的生活习性及甲烷生物合成的机理与调控受到了人们极大的关注。
为了进一步了解不同种类产甲烷菌的生物学特性,有关产甲烷菌分离培养技术的研究也取得了较大的进步。
作者着重回顾了产甲烷菌分离纯化培养技术及培养基中不同成分对于产甲烷菌的选择作用。
1 自然界中的产甲烷菌1.1 产甲烷菌的典型生境产甲烷菌广泛存在于各种厌氧环境与极端环境中,目前产甲烷菌的分离培养大多来自以下3种生境：①水沉积物、沼泽、苔原、稻田、腐败的树木心材及厌氧污泥消化器;②瘤胃、盲肠和肠;③地热温泉、洋脊热液喷口和非洲的基伍湖(丁安娜等,1991)。
据报道在中国柴达木盆地地下1701 m深的岩芯中也发现了具有生物活性的产甲烷菌(周翥虹等,1990)。
厌氧微生物的分离与培养
厌氧微生物的分离与培养一、实验目的熟练掌握Hungate厌氧操作技能，了解和掌握厌氧微生物的培养基配制，并进行分离纯化。
二、实验用具装有分压表的氮气钢瓶，氢气钢瓶，调压变压器，铜柱和铜柱固定架，高压灭菌锅，厌氧管（15ml）,厌氧瓶(50ml)，异丁烯橡胶塞、电炉、圆底烧瓶（500ml、1000ml）、各种规格的定量注射器（1ml、2ml，5ml），18#针头，酒精灯，酒精棉等。
三、实验操作(一)、高纯无氧N2的制备1、接通电源：把输出电压缓缓从0伏分级升到50～90伏之间（调电压的过程持续大约2-3s就可以了）。
大约20分钟后，铜柱温度能达到350℃左右（输出电压禁止长时间超过90V以上，否则会导致铜玻璃柱变形直至破裂，甚至发生安全事故）。
2、待铜柱温度升至350℃左右时，加热套触摸起来比较烫，开启氢气钢瓶并形成气流，使铜柱内的铜丝还原（反应速率很快，几秒钟见效，还原与否可以从铜丝颜色的变化看到，同时柱内会产生水蒸气，氧化铜与氢气反应所致；通氢气的时候最好打开窗户，一定熄灭操作台边上所有明火，包括酒精灯和电炉）。
3、待铜丝被氢气还原呈现纯紫铜铮亮色，同时把里面的水蒸气也排出完全后，关闭氢气钢瓶，压力表指针降为零；打开氮气钢瓶，气流大小以把针头对准操作者手背5cm距离明显感觉到气流为宜，并随时注意气流是否足够。
4、使用完毕后，先关紧氮气钢瓶，使压力表的指示针回至零位，接着关闭电源，使调压变压器调节指示回至0伏处。
(二)、无氧无菌水的配制1.将500ml一定浓度的NaCl水溶液（防止稀释时细胞涨破）沿玻璃棒倒入固定在铁架台上的1000ml圆底烧瓶中（选择合适的圆底烧瓶，水不可太满，否则水沸腾时容易溅出），最好放入几个防爆玻璃珠。
向500ml水中加入终浓度为0.001‰的刃天青（resazurin），即加入0.5ml 的1‰刃天青母液（W/V），并加入0.25g半胱氨酸（L-Cysteine）(终浓度0.5‰)。
培养相应的厌氧菌
有一套必要的附属装置，例如培养基配置系统，蒸
汽灭菌系统。以及发酵产物的后处理系统。
2.厌氧菌大规模的液体培养装置
下 课 啦
（3）亨盖特滚筒技术 (Hungate roll-tube technique)
是利用除氧筒来制备高纯度氮，用纯氮驱除小环境中的空气， 使培养基的配制，分装、灭菌和贮存，以及菌种的接种、培养、 观察、分离、移种和保藏等过程始终处于高度无氧条件下。
（4）厌氧罐 （anaerobic jar)
（5）厌氧手套箱 （anaerobic glove box)
一实验室培养法1高层琼脂柱用加有还原剂的固体或半固体培养基装入试管中穿刺接种培养相应的厌氧菌2厌氧培养皿3亨盖特滚筒技术hungaterolltubetechnique是利用除氧筒来制备高纯度氮用纯氮驱除小环境中的空气使培养基的配制分装灭菌和贮存以及菌种的接种培养观察分离移种和保藏等过程始终处于高度无氧条件下
（二）液体培养法
1.好氧菌的培养 通过增加液体与氧的接触面积或提高氧分压 来提高溶氧速率，主要措施是： （1）浅层液体培养； （2）利用摇床对三角瓶培养物作振荡培养； （3）在深层液体培养瓶的底部通入加压空气， 用空气分布器使以小泡形式均匀喷出； （4）对培养液进行机械搅拌，并在培养器的 壁上设置挡板装置。
⑦从单纯微生物细胞——高等动、植物细胞；
⑧从单菌发酵发展——混菌发酵；
⑨从利用野生菌种——利用变异株以及“工程菌”
一 、实验室培养法
（一）固体培养法
1.好氧菌的培养 主要有试管斜面、培养皿平板及较
大型的克氏扁平，茄子瓶等的平板培养方法。
2.厌氧菌的固体培养
（1）高层琼脂柱 用加有还原剂的固体或半固体培养 基装入试管中，穿刺接种，培养相应的厌氧菌 （2）厌氧培养皿
2022年西安交通大学生物技术专业《微生物学》期末试卷A(有答案)
2022年西安交通大学生物技术专业《微生物学》期末试卷A(有答案）一、填空题1、芽孢的形成须经过7个阶段，它们是______、______、______、______、______、______和______。
2、烈性噬菌体生活史可分五个阶段，即______、______、______、______和______。
3、微生物有两种同化CO2的方式：______和______。
自养微生物固定CO2的途径主要有3条：卡尔文循环途径，可分为______、______和 ______3个阶段；还原性三羧酸途径，通过逆向的三羧酸循环途径进行，多数酶与正向三羧酸循环途径相同，只有依赖于ATP的______是个例外；乙酰辅酶A途径，存在于甲烷产生菌、硫酸还原菌和在发酵过程中将CO2转变乙酸的细菌中，非循环式CO2固定的产物是______和______。
4、从元素水平来看，微生物的有机氮源有______和______两类，无机氮源则有______、______和______三类。
5、典型蕈菌的子实体是由顶部的______、中部的______和基部的______三部分组成。
6、细菌分类鉴定的主要文献是______。
7、厌氧菌的固体培养方法有：______、______、______、______和______。
8、由霉腐微生物引起的材料劣变有______、______、______和______ 等多种。
9、细菌的质粒种类很多，其中接合性质粒如______，抗药性质粒如______，产细菌素质粒如______，诱癌质粒如______，诱生不定根的质粒如______，执行固氮的质粒如______，降解性质粒如______等。
10、补体的本质是一类______，它能被任何一种______所激活，然后发挥其______、______和______等作用。
二、判断题11、芽孢在细菌细胞体内的不同部位均可随意着生。
（）12、在基团转位运输方式中，除了在运输过程中物质发生化学变化这一特点外，其他特征均与主动运输方式相同。
厌氧培养罐操作方法
厌氧培养罐操作方法厌氧培养罐是一种用于培养厌氧菌的实验设备。
下面将详细介绍厌氧培养罐的操作方法。
1. 准备工作首先，准备所需的实验材料和试剂。
这包括培养基、无菌培养棒、培养液、培养物等。
同时，准备好操作台和一套无菌技术。
2. 操作过程（1）将培养罐取出，并在培养罐底部放置一个培养基平板。
培养基平板上新鲜制作的培养基需要事先无菌化。
（2）在培养罐内注入适量的培养液，将培养液与培养基平板接触。
培养液中可以添加适量的营养物，以供厌氧菌生长。
（3）用无菌培养棒，将待培养的菌落划入培养液中。
划入的菌落要尽量小，并且要尽可能避免空气进入培养液中。
（4）将培养罐口和培养液接触的部分涂抹上凡士林或者石蜡，以防止空气进入。
（5）将培养罐盖紧，确保完全密闭。
可以用炭盖密封培养罐，以进一步保证厌氧环境。
（6）将培养罐放入恒温培养箱中，并设置适当的温度和培养时间。
根据不同的菌种，温度设置在30-37之间。
3. 注意事项（1）在进行厌氧培养罐操作前，需要严格执行无菌操作。
使用无菌技术，穿戴好实验服和手套，并做好无菌环境的保持。
（2）在操作过程中尽量避免将空气带入培养液或培养罐内。
因为厌氧菌无法生长在氧气环境下，空气的污染可能会影响培养结果。
（3）注意培养罐的密闭性。
在连接培养罐和培养液的部分应该密封良好，以防止空气进入。
（4）培养罐中的培养液要保持清洁。
如有沉淀或是生长不良的情况，应及时更换新的培养液。
（5）在取样时，要做好无菌操作。
严格遵守取样时的操作规范，以避免细菌的传播和污染。
4. 厌氧培养罐的应用厌氧培养罐广泛应用于微生物学、生物工程以及医学研究领域。
通过在厌氧环境中培养微生物，可以研究厌氧菌的生理特性、代谢途径等。
同时，还可以用于分离和鉴定厌氧菌的方法。
总结：厌氧培养罐的操作方法相比于常规培养方法有一定的特殊性，需要在严格无菌条件下进行，并注意保持培养罐的密闭性。
只有这样才能得到可靠的培养结果，为相关研究提供有效的支持。
Hungate亨盖特滚管法厌氧培养操作步骤
Hungate滚管法厌氧培养操作概要以双歧杆菌培养为例：实验步骤：1.铜柱系统除氧铜柱是一个内部装有铜丝或铜屑的硬质玻璃管。
此管的大小为40—400mm，两段被加工成漏斗装，外壁绕有加热带，并与变压器相连来控制电压和稳定铜柱的温度。
铜柱两端连接胶管，一端连接气钢瓶，一端连接出气管口。
由于从气钢瓶出来的气体如N2、CO2和H2等通常都含有O2，故当这些气体通过温度约360℃的铜柱时，铜和气体中的微量O2化合生成CuO，铜柱则由明亮的黄色变为黑色。
当向氧化状的铜柱通入H2时，H2与CuO中的氧就结合形成H2O，而CuO又被还原成了铜，铜柱则又呈现明亮的黄色。
此铜柱可以反复使用，并不断起到除氧的目的。
当然H2源也可以由氢气发生器产生。
2 预还原培养基及稀释液的制备制作预还原培养基及稀释液时，先将配制好的培养基和稀释液煮沸驱氧，而后用半定量加样器趁热分装到螺口厌氧试管(FM scientific 货号2651-6001)中，一般琼脂培养基装4.5-5ml，稀释液装9ml，并插入通N2气的长针头以排除O2。
此时可以清楚地看到培养基内加入的氧化还原指示剂—刃天青由蓝到红最后变成无色，说明试管内已成为无氧状态，然后盖上螺口的丁烯胶塞及螺盖，灭菌备用。
3 双歧杆菌样品不同稀释度的制备在无菌条件下准确称取1g固体或用无菌注射器吸取1ml混合均匀的液体样品，而后加入装有预还原生理盐水的厌氧试管中，用震荡器将其震荡均匀，制成10-1稀释液。
用无菌注射器吸取1ml 10-1稀释液至另一支装有9ml生理盐水的试管中，制成10-2稀释液。
按此操作方法依次进行10倍系列稀释至10-7，制成不同浓度的样品稀释液。
通常选10-5、10-6、10-7三个稀释度进行滚管培养计数。
4厌氧滚管培养法将盛有融化的无菌无氧琼脂培养基试管放置于50℃左右的恒温水浴中，用1ml无菌注射器分别吸取10-5、10-6、10-7三个稀释度的稀释液各0.1ml于融化了的琼脂培养基试管中，而后将其平放于滚管机（FM Scientific 型号R10）上迅速滚动，这样带菌的融化培养基在试管内壁立即凝固成一薄层。
厌氧菌培养标本处理标准操作程序
厌氧菌培养标本处理标准操作程序1 检验目的检测是否为厌氧菌感染。
2 原始样本要求各类标本。
3 采样容器厌氧菌运送培养拭子、血培养瓶。
4 试剂革兰染液、厌氧发生袋。
5 检验程序5.1 标本采集标本应从正常无菌部位或通过严格无菌技术采集，血液、无菌体液及通过外科无菌手术抽出的脓液等，与常规方法相同。
肺部分泌物可经气管在环甲膜平面以下抽取，或用纤维支气管镜，将取样刷剪下，可放入运送培养基或床边接种。
已破溃脓肿，用无菌拭子擦去表面脓液，取深部分泌物。
5.2 标本运送和处理a) 血、脑脊液和腹水标本可注入厌氧血培养瓶，在血培养仪中直接进行培养。
b) 如临床有要求，也可床边接种。
不能床边接种的标本，用运送培养基送检。
c) 标本送达实验室后，立即接种相应培养基，放入厌氧袋内进行培养，同时应放入氧消耗剂和厌氧指示卡，迅速密封培养。
5.3. 阳性处理若怀疑有厌氧菌生长，将接种于厌氧袋内的血琼脂平板上的菌落或生长于硫乙醇酸钠肉汤管底的菌或厌氧瓶内的菌涂片后革兰染色，初步分成革兰阴性球菌、革兰阴性杆菌、革兰阳性球菌和革兰阳性杆菌。
5.4 耐氧试验厌氧环境培养 48 小时后，将可疑菌接种于两个血平板，分别放入有氧、无氧环境中培养 48 小时，如都能生长为兼性厌氧菌；如有氧环境不生长，而在无氧环境生长则为专性厌氧菌。
5.5 初步分群5.5.1 菌落形态对菌落的大小、形态、颜色、有无斑点、透明与否、是否为黏液样菌落进行分类。
5.5.2 色素产黑素拟杆菌-不解糖拟杆菌群孵育 2～10 天可产生黄褐色至黑色色素；龋齿放线菌在室温孵育 3～4 天后产生粉红色菌落；内氏放线菌延长孵育时间可产生黄褐色色素。
5.5.3 溶血产气荚膜梭菌在血平板上形成双溶血环，许多梭杆菌在空气中暴露30min 后菌落周围变绿色。
5.5.4 荧光产黑素拟杆菌、不解糖拟杆菌或韦荣球菌发生红色荧光，梭杆菌常发生黄绿色荧光，艰难梭菌发生绿色荧光。
5.5.5 触酶厌氧革兰阴性杆菌中大部分脆弱拟杆菌、多形拟杆菌、吉氏拟杆菌和腐败拟杆菌触酶阳性；梭菌属、双歧杆菌属、乳杆菌属和消化链球菌属触酶阳性；消化球菌属中某些菌株和丙酸杆菌触酶阳性，真杆菌亦可能为阳性。
采用Hungate厌氧培养技术分离纯化光合细菌
利用 Ｈｕ ｇ ｔ ｎ ａｅ厌氧 培养 技 术 ， 克服 恃统 分离 光台 细菌 方法 的不 足 ， 是一 种快 。
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厌氧微生物的分离与培养 (1)
产甲烷厌氧微生物的分离与培养一、实验目的掌握Hungate厌氧操作技能，掌握厌氧微生物的培养基配制和厌氧菌的富集、分离和纯化方法。
二、知识背景产甲烷菌（Mathanogens）是一类以产生大量甲烷气体作为能量代谢的终产物的特殊原核微生物，广泛存在于各种极端厌氧环境中。
作为自然界碳素循环中厌氧生物处理的最后一个成员，该菌与其它菌群协同作用，将大量的有机物转化成可再生能源，对自然界中的物质循环及当今社会能源危机中的能源替代问题具有极大的推动作用。
产甲烷菌是一类严格的厌氧细菌，至今还未发现产甲烷菌具有超氧化物歧化酶和过氧化氢酶，产甲烷菌不能除去在生命代谢过程中产生的超氧化物、过氧化氢等氧化产物，这些氧化物可损害组成细胞的大分子，如F420因子，当F420处于氧化态时，即与酶蛋白分离而失活。
因此，在对甲烷菌进行分离、培养以及操作过程中必须给予无氧的环境。
产甲烷菌广泛分布于自然界，在淤泥、瘤胃、人和动物的肠道、昆虫的肠道、湿树木、地热泉水、深海火山口、水田和海洋的沉积物、沼泽等厌氧环境中都有产甲烷菌存在。
三、原理产甲烷菌是一类必须生活在厌氧生境下并伴有甲烷产生的古生菌，其形态和生理、生化特性呈现明显的多样性。
它生长的氧化还原电位约为-0.33V，一般最适生长温度为30～40℃，最适pH为6.0～7.2。
例如细胞形态有球状、短杆状、长杆状、螺旋状和丝状等；Gram染色反应有阳性、阴性和不定性；产甲烷菌生长需要的营养与其它微生物一样，需要碳源、氮源、无机盐、生长因子等。
生长所需碳源约有10多种，除CO2外，还有其它一碳化合物（甲酸、甲醇、甲胺等）和二碳化合物（乙酸等）；只有当产甲烷菌在利用H2作CO2还原剂以产生生物合成所需细胞物质，才能利用CO2作电子受体以产生ATP和CH4。
四、实验药品、器材1、药品NH4Cl、MgCl2·6H2O、K2HPO4、KH2PO4、甲酸钠、乙酸钠、胰化酪蛋白、酵母膏、盐酸半胱氨酸、刃天青、Na2S·9H2O、NaHCO3、氨三乙酸、MgSO4·7H2O、MnSO4·2H2O、NaCl、FeSO4·7H2O、CoSO4·7H2O、CaCl2·2H2O、ZnSO4·7H2O、KAl（SO4）2·12H2O、CuSO4·5H2O、H 3BO3、Na2MoO4·2H2O、NiCl2·6H2O、Na2SeO3·5H2O、生物素、叶酸、盐酸吡哆醇、二水盐酸硫胺、核黄素、烟酸、D-泛酸钙、维生素B12、对氨基苯甲酸、硫辛酸。
微生物基础实训习题
微生物实验习题一．填空题1．显微镜的光学系统由__ , , 和__ ___ 组成。
2．显微镜的机械部分包括_ ，，，，， , , ，等九部分组成。
3使用显微镜低倍镜观察时, 聚光器应该_ ，使用显微镜高倍镜观察时，聚光器应该。
4．高倍镜头的数值孔径通常为__ ___，放大倍数为___ ____。
5．油镜头的数值孔径通常为_____ __，放大倍数为___ __。
6．低倍镜头的数值孔径通常是__ ___，放大倍数为____ _ 。
7．用日光灯作光源时，通常用__ ___反光镜，用自然光作光源时，通常用__ __ 反光镜。
8．细菌经简单染色后呈__ ___。
9．简单染色的操作程是__ __,__ __, __ _, _ __, __ _, __ __。
10．革兰氏染色的操作程序是，，，，，，，，，，，。
11．细菌经革兰氏染色后，革兰氏正反应菌呈_______，革兰氏负反应菌呈________。
12．革兰氏染色的关键操作是__ __。
13．细菌在革兰氏染色过程中，最后用蕃红复染的原因是__ 、、，，，。
14．两个典型的革兰氏正反应细菌和革兰氏负反应细菌经革兰氏染色后都呈阴性反应往往是由于_ 和__ _引起。
15．有荚膜的细菌用负染色法染色后, 荚膜为____ 色，菌体为_____ 色。
16．芽胞染色的操作程序是___ ，，，，，，，。
17．用孔雀绿和复红作细菌芽胞染色时，可使菌体呈____ 色，使芽胞呈____ 色。
18．芽胞染色的关键操作是__ ___。
19．霉菌水浸片的制片程序是_ ，，，，，。
20．制霉菌水浸片时加棉兰染色液可使菌体呈___ 色。
21．实验室配制固体培养基的操作程序是，，，，，，。
22．配制常规培养基时通常用______水。
23．配制培养基时常用__ ___ 和 ______调节 pH值。
24．固体培养基常用______ 作凝固剂，普通固体培养基的用量一般为___ __ ，半固体培养基的用量一般为_________。
实验十二 厌氧性细菌(1稿)
实验十二厌氧性细菌〔厌氧培养方法〕厌氧性细菌〔Anaerobicbacteria〕是一大群必须在无氧或低氧环境中才能生长繁殖的细菌；一般情况下，这类细菌在无氧条件下比在有氧环境中生长好，不能在空气〔氧气浓度大于18%〕和〔或〕二氧化碳浓度小于10%以下的固体培养基外表生长。
这类细菌缺乏完整的代谢酶体系，其能量代谢多以无氧发酵的方式进展。
它能引起人体不同部位的感染，包括阑尾炎、胆囊炎、中耳炎、口腔感染、心内膜炎、子宫内膜炎、脑脓肿、心肌坏死、骨髓炎、腹膜炎、脓胸、输卵管炎、脓毒性关节炎、肝脓肿、鼻窦炎、肠道手术或创伤后伤口感染、盆腔炎以及菌血症等。
〔一〕无芽胞厌氧菌主要种类及生物学性状无芽胞厌氧菌共有23个属，与人类疾病相关的主要有10个属。
1.革兰阴性厌氧杆菌有8个属，类杆菌属中的脆弱类杆菌最为重要。
形态呈多形性，有荚膜。
除类杆菌在培养基上生长迅速外，其余均生长缓慢。
2.革兰阴性厌氧菌有3个属，其中以韦荣菌属最重要。
为咽喉部主要厌氧菌，但在临床厌氧菌别离标本中，别离率小于1%，且为混合感染菌之一。
其他革兰阴性球菌极少别离到。
3.革兰阳性厌氧菌有5个属，其中有临床意义的是消化链球菌属，主要寄居在阴道。
本菌属细菌生长缓慢，培养需5～7天。
4.革兰阳性厌氧杆菌有7个属，其中以以下3个属为主：〔1〕丙酸杆菌属：小杆菌，无鞭毛，能在普通培养基上生长，需要2～5天，与人类有关的有3个种，以痤疮丙酸杆菌最为常见。
〔2〕双歧杆菌：呈多形性，有分枝，无动力，严格厌氧，耐酸。
29个种中有10个种与人类有关，其中只有齿双歧杆菌与龋齿和牙周炎有关。
其他种极少从临床标本中别离到。
〔3〕优杆菌属：单一形态或多形态，动力不定，严格厌氧，生化反响活泼，生长缓慢，常需培养7天，最常见的是迟钝优杆菌。
〔二〕微生物学检查要从感染灶深部采取标本。
最好是切取感染灶组织或活检标本，立即送检医.学教育网搜集整理。
1.直接涂片镜检：将采集的标本直接涂片染色镜检，观察细菌形态、染色及菌量，为进一步培养以及初步诊断提供依据。
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Hungate滚管法厌氧培养操作概要
以双歧杆菌培养为例：
实验步骤：
1.铜柱系统除氧
铜柱是一个内部装有铜丝或铜屑的硬质玻璃管。
此管的大小为40—400mm，两段被加工成漏斗装，外壁绕有加热带，并与变压器相连来控制电压和稳定铜柱的温度。
铜柱两端连接胶管，一端连接气钢瓶，一端连接出气管口。
由于从气钢瓶出来的气体如N2、CO2和H2等通常都含有O2，故当这些气体通过温度约360℃的铜柱时，铜和气体中的微量O2化合生成CuO，铜柱则由明亮的黄色变为黑色。
当向氧化状的铜柱通入H2时，H2与CuO中的氧就结合形成H2O，而CuO又被还原成了铜，铜柱则又呈现明亮的黄色。
此铜柱可以反复使用，并不断起到除氧的目的。
当然H2源也可以由氢气发生器产生。
2 预还原培养基及稀释液的制备
制作预还原培养基及稀释液时，先将配制好的培养基和稀释液煮沸驱氧，而后用半定量加样器趁热分装到螺口厌氧试管(FM scientific 货号2651-6001)中，一般琼脂培养基装4.5-5ml，稀释液装9ml，并插入通N2气的长针头以排除O2。
此时可以清楚地看到培养基内加入的氧化还原指示剂—刃天青由蓝到红最后变成无色，说明试管内已成为无氧状态，然后盖上螺口的丁烯胶塞及螺盖，灭菌备用。
3 双歧杆菌样品不同稀释度的制备
在无菌条件下准确称取1g固体或用无菌注射器吸取1ml混合均匀的液体样品，而后加入装有预还原生理盐水的厌氧试管中，用震荡器将其震荡均匀，制成10-1
稀释液。
用无菌注射器吸取1ml 10-1稀释液至另一支装有9ml生理盐水的试管中，制成10-2稀释液。
按此操作方法依次进行10倍系列稀释至10-7，制成不同浓度的样品稀释液。
通常选10-5、10-6、10-7三个稀释度进行滚管培养计数。
4厌氧滚管培养法
将盛有融化的无菌无氧琼脂培养基试管放置于50℃左右的恒温水浴中，用1ml无菌注射器分别吸取10-5、10-6、10-7三个稀释度的稀释液各0.1ml于融化了的琼脂培养基试管中，而后将其平放于滚管机（FM Scientific 型号R10）上迅速滚动，这样带菌的融化培养基在试管内壁立即凝固成一薄层。
每个稀释度重复3次，而后置于37℃（酸奶样品42℃）恒温培养箱中培养。
一般培养24—48小时后，即可在厌氧管的琼脂层内或表面长出肉眼可见的菌落。
5.厌氧管清洗和灭菌方法
清洗厌氧管时，先用2%盐酸浸泡过夜，自来水冲洗干净后，用蒸馏水浸泡至pH中性，干燥后贴上标签，标上菌号及时间，121℃下高压灭菌15-20分钟，备用。
6.注意事项
1注射器在使用前必须经过121℃、20min灭菌。
2注意无菌操作，保持手和培养管的清洁。
每次接种前需用酒精棉球将厌氧管盖子擦一遍。
3用注射器吸取菌悬液注入固体培养基后，如需再次吸取，应快速将注射器插入厌氧管中，以防止针头污染。
备注：本操作概要仅供参考。