2012CB518500 经穴效应循经特异性规律及关键影响因素基础研究

项目名称：经穴效应循经特异性规律及关键影响因
素基础研究
首席科学家：梁繁荣成都中医药大学
起止年限：2012.1-2016.8
依托部门：国家中医药管理局四川省科技厅
一、关键科学问题及研究内容
（一）项目研究工作假说
循经性是经穴效应特异性的基本表现形式，针刺手法、穴位配伍和得气是影响经穴效应循经特异性的关键因素，局部始动-中枢整合-效应器官响应多环节靶向调节是经穴效应循经特异性的生物学基础。

（二）拟解决的关键科学问题
在前期已完成973计划项目初步证实经穴效应存在特异性的基础上，运用多学科研究方法与手段，基于临床，深入阐明经穴效应循经特异性基本规律和关键影响因素，揭示经穴效应循经特异性多环节靶向调节的生物学基础。

（三）主要研究内容
1、经穴效应循经特异性基本规律的临床评价研究
以中医针灸理论为指导，结合针灸临床研究规范、临床流行病学、循证医学和GCP临床研究原则，以慢性稳定性心绞痛、原发性高血压等针灸有效病证为研究载体，运用多中心RCT的研究方法，通过客观、科学的临床评价手段，进一步证实经穴效应循经特异性基本规律。

2、经穴效应循经特异性基本规律的生物学基础研究
（1）经穴效应循经特异性局部启动靶向调节生物学基础研究
运用在体组织膜片钳、微透析、基因敲除、质子激发X射线荧光发射（PIXE）等技术和手段，重点向神经纤维-肥大细胞关联，肥大细胞脱颗粒下游分子事件、肥大细胞-微循环关联等在局部始动环节的靶向调节机制深入，揭示经穴效应循经特异性基本规律的局部启动机制，阐释经穴效应循经特异性基本规律在局部始动环节的生物学基础。

（2）经穴效应循经特异性中枢靶向整合生物学基础研究
运用功能磁共振/事件相关电位（fMRI/ERP）等功能神经影像技术和复杂网络分析技术，观察比较循经、非循经、非经非穴针刺对脑功能活动的影响，深入揭示经穴效应循经特异性的中枢整合响应模式特征。

（3）经穴效应循经特异性靶器官响应生物学基础研究
运用双源CT双能量心肌灌注成像技术，重点针对靶器官血流响应模式特征，
揭示经穴效应循经特异性靶器官血流动力学响应模式及特征；采用酸敏感离子通道（ASIC2-/-，ASIC3-/-）基因敲除小鼠，针对靶器官细胞膜钾、钠、钙离子通道及相关蛋白，揭示经穴效应循经特异性靶器官离子通道响应模式及特征；采用条件基因敲除等技术结合，重点针对靶器官肾上腺素β-受体、毒蕈碱M2受体及其信号转导通路，揭示经穴效应循经特异性靶器官受体响应模式及特征；采用代谢组学、ChIP-seq技术结合，揭示经穴效应循经特异性靶器官分子响应模式及特征。

通过局部始动、中枢整合、靶器官响应三个环节的研究，系统、全面、深入地揭示经穴效应循经特异性基本规律的生物学基础，阐释经穴效应循经特异性基本规律的科学内涵。

3、经穴效应循经特异性的关键影响因素的基础研究
（1）针刺手法对经穴效应循经特异性的影响特点及分子机制
采用多因素设计方法，明确不同捻转手法参数对经穴效应特异性的影响特点，为针灸临床提供新的针刺手法运用依据；围绕针刺手法的力学事件，结合局部生物力学、生物化学、分子生物学、蛋白组学等技术手段探讨不同捻转手法对自发性高血压大鼠（SHR）肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS）的相关分子及差异蛋白质的影响，揭示针刺手法影响经穴效应循经特异性的分子机制。

（2）穴位配伍对经穴效应循经特异性的影响特点及中枢整合机制
采用随机、对照临床研究方法，观察不同配伍方案针刺降压效应差异，探讨穴位配伍对经穴效应特异性的影响特点。

运用fMRI/PET-CT多模态神经影像技术和复杂网络分析技术，揭示不同穴位配伍方法影响经穴效应的中枢靶点脑区及其作用机制；运用蛋白组学方法分析靶点脑区的差异蛋白质，采用免疫组化方法再验证靶效应脑区差异蛋白的分布，深入研究穴位配伍影响经穴效应循经特异性的中枢整合机制。

（3）得气对经穴效应循经特异性的影响特点及分子响应机制
结合目前国际运用的得气评价方法，设计符合针灸研究应用的得气评价新体系，并明确不同得气状态对经穴效应循经特异性及其相关通道示踪成像影响的异同；运用分子生物学技术，揭示得气对经穴效应循经特异性靶器官通道开放、受体激活和分子级联事件放大效应的影响，从分子水平诠释得气对靶器官环节产生关键影响的生物学基础。

二、预期目标
（一）总体目标
以中医针灸理论为指导，运用多学科研究方法与手段，进一步证实经穴效应循经特异性基本规律；揭示经穴效应循经特异性的生物学基础和科学内涵；探讨针刺手法、穴位配伍、得气对经穴效应循经特异性的影响特点及机制，为针灸临床合理选穴配方提供科学依据。

（二）五年预期目标
1、以慢性稳定性心绞痛、原发性高血压为研究载体，运用国际公认的多中心随机对照研究方法，进一步证实经穴效应循经特异性基本规律，为针灸临床合理选穴和国际推广运用提供科学可靠的证据。

2、围绕经穴效应循经特异性局部始动、中枢整合及效应器官响应三个环节，系统揭示其多环节靶向调节的生物学机制，阐释经穴效应循经特异性的科学内涵。

3、围绕针刺手法、穴位配伍和得气三个关键影响因素，深入探讨其对经穴效应循经特异性的影响特点及作用机制，为经穴效应循经特异性的临床运用提供科学依据。

4、搭建或创新针灸临床研究平台、针灸机理可视化研究平台、针灸多学科交叉研究平台及针灸转化医学研究平台，促进针灸机理研究的可视化、系统化、规范化和可应用化，提升针灸研究水平。

5、开拓并完善针灸功能基因研究、针灸表观遗传调控研究、针灸代谢组学研究等新领域，引导国际针灸研究的新方向。

6、整合多学科研究人员，构建经穴特异性研究国际协作网络，组建一支长期合作、多学科交叉的创新研究团队。

7、发表文章140-150篇，SCI收录文章40-50篇，其中IF＞５的SCI收录文章不少于5篇，保持我国经穴特异性研究在国际上的领先地位。

8、培养硕、博士研究生60-80名、教育部新世纪优秀人才计划或国家杰出青年基金获得者1-3名，建立一支结构合理的经穴特异性国际合作研究团队。

9、通过5年的研究，凝练和提升传统经穴特异性理论，促进针灸学术的传承、创新和可持续发展。

三、研究方案
（一）总体研究思路
围绕“循经性是经穴效应特异性的基本表现形式，针刺手法、穴位配伍和得气是影响经穴效应循经特异性的关键因素，局部始动-中枢整合-效应器官响应多环节靶向调节是经穴效应循经特异性的生物学基础”的工作假说，综合运用临床疗效评价、分子生物学、功能基因组学、代谢组学、蛋白组学、生物信息学、表观遗传学、神经生物学、生物力学、神经影像学、脑连接组学、神经电生理学等多学科研究技术手段，结合中医针灸学辨证循经、辨位循经的临床实践特色，以原发性高血压、慢性稳定性心绞痛等作为研究载体，从临床疗效的角度进一步确证经穴效应循经特异性基本规律；从局部始动、中枢整合、靶器官响应三个环节，深入、系统、全面揭示经穴效应循经特异性的生物学基础；从针刺手法、穴位配伍、得气三个关键影响因素探讨其经穴效应循经特异性的影响特点及其机制。

（二）技术途径
（三）可行性分析
1、选题符合指南，立项依据充分：本项目围绕“深入阐明经穴效应循经特异性基本规律和关键影响因素，揭示经穴效应循经特异性多环节靶向调节的生物学基础”这一关键科学问题开展研究，把握了针灸学发展中的关键科学问题。

同时，在前期肯定经穴效应特异性的基础上，深入研究经穴效应循经特异性基本规
律及其关键影响因素，不仅是应对国际针灸经络研究挑战、抢占国际经穴特异性
研究领先地位具有重要的战略意义，也是开创继针刺镇痛获得国际认同之后又一新的突破口，对创新经络腧穴理论和提高针灸临床疗效，推进针灸学科的现代化、国际化等具有重要的科学价值，其立项依据充分。

2、研究思路清晰，技术路线可行：本项目以针灸理论与临床的关键科学问题─“经穴效应循经特异性基本规律、生物学基础及关键影响因素”为切入点，以体现针灸辨证循经、辨位循经疗效确切的疾病─慢性稳定性心绞痛、原发性高血压和原发性痛经为研究载体，采取传统和现代相结合、多学科交叉的研究方式，在进一步证实经穴效应循经特异性基本规律的基础上，从局部启动、中枢整合、靶器官响应环节深入、系统、全面揭示经穴效应循经特异性的生物学基础；从针刺手法、穴位配伍、得气三个方面探讨经穴效应循经特异性的关键影响因素。

其研究思路清晰，研究目标明确，研究层次清楚，技术路线切实可行。

3、研究基础良好，工作积累深厚：项目组成员研究领域和学科涵盖针灸学、循证医学、临床流行病学、神经影像学、代谢组学、分子生物学、表观遗传学、生物力学、神经生物学、生物信息学、生物医学工程学等，具有多学科协作研究的显著特点；项目组成员先后承担了国家“七五”、“八五”、“九五”、“十五”科技攻关、973计划、“十一五”支撑计划、国家自然科学基金重点项目、国家自然科学基金重大研究计划等重大项目的研究工作，取得了一系列研究成果，研究经验丰富、研究基础雄厚；本项目首席科学家所主持完成的973项目“基于临床的经穴特异性基础研究”，通过运用传统和现代研究的方法已初步证实了经穴特异性客观存在，相关科研成果获省部级奖励15项，发表相关学术论文680篇，出版相关学术专著27部。

该项目的研究已经在国际、国内产生了广泛的辐射和推动效应，为本项目的完成提供了坚实的保障。

4、研究条件优越，仪器设备先进：项目承担单位及各课题单位拥有4个国家级重点学科，11个省部级重点学科，5个省部级重点实验室，5个国家中医药管理局重点研究室，3个国家中医临床研究基地建设单位，7个国家中医药管理局三级科研实验室；拥有功能神经影像、神经电生理、表观遗传、分子生物、代谢组、蛋白质组等本项目研究所需的仪器设备，为项目的实施提供了先进、优越的工作条件，可充分保障研究工作的顺利实施和完成。

（四）创新点
1、在前期肯定经穴效应存在特异性的基础上，结合针灸辨证循经、辨位循经的临床特色，率先开展更符合针灸理论与临床实际的经穴效应循经特异性基本规律研究，突破了国际经穴特异性研究主要基于辨病开展穴位与非穴位效应差异的研究思路，与国内外研究相比，研究思路更具创新性。

2、紧密围绕“局部始动-中枢整合-效应器官响应多环节靶向调节是经穴效应循经特异性的生物学基础”的假说，率先对“神经-肥大细胞联动、肥大细胞-微循环整合、肥大细胞脱颗粒下游分子响应”的局部靶向调节机制，中枢时空网络整合机制以及靶器官响应的血管、离子通道、受体、代谢靶标分子机制进行系统、全面和深入的研究，是国际经穴特异性机理研究的首次全面探索。

3、针对经穴效应循经特异性的三大影响因素─针刺手法、穴位配伍和得气的不同作用特点，分别研究针刺手法的分子机制、穴位配伍的中枢网络整合特点、得气对靶器官分子的放大效应，重点突出，目的明确，有望取得突破性进展。

4、在技术手段上，既运用了形态学、神经生物学、分子生物学等还原论方法，又结合了代谢组学、蛋白组学等系统生物学的手段；既借鉴了传统、经典学科的研究方法，又引入功能影像学、在体组织膜片钳、微透析等针灸研究的特色和共识技术；还首次引入了ChIP-seq等表观遗传学等新兴学科领域的技术方法，同时在各课题设臵中充分考虑到正向证明和反向验证，这些方法的综合运用将有利于促进经穴特异性机理的深入和系统阐明，引导国际针灸研究的创新发展。

5、本项目通过多学科交叉研究，不仅“经穴效应循经特异性多环节靶向调节生物学基础”是整个项目的总体创新成果，而且，局部启动的靶向调节机制、中枢时空网络整合及关键分子靶点、针刺手法效应的分子机制、穴位配伍的中枢网络整合、得气的靶器官分子级联放大机制等研究成果都将是总体创新成果下的具体化，将对针灸经络理论的发展、临床疗效的提高等产生深远的影响，与国内外同类研究相比，其研究结果具有重要的科学意义和临床价值。

（五）课题设臵
课题1：经穴效应循经特异性基本规律临床评价及中枢靶向整合生物学基础研究
【研究目标】
（一）总体目标
以慢性稳定性心绞痛、原发性高血压为研究载体，运用国际公认的多中心RCT方法和多模态神经影像及复杂网络分析技术，进一步证实经穴效应循经特异性基本规律及中枢靶向整合机制，为针灸临床合理选穴和国际推广运用提供科学可靠的证据。

（二）五年目标
1、以针灸临床确有疗效的慢性稳定性心绞痛、原发性高血压为研究载体，从临床评价的角度进一步证实经穴效应循经特异性基本规律；
2、以慢性稳定性心绞痛为研究载体，采用多模态神经影像及复杂网络分析技术等，揭示经穴效应循经特异性的中枢网络整合机制；
3、发表论文50篇，SCI论文10-15篇，其中IF.>5的文章不少于2篇；出版专著1-2部；
4、培养教育部新世纪优秀人才计划或国家杰出青年基金1人，培养20-30名硕、博士研究生。

【研究内容】
1、经穴效应循经特异性基本规律临床评价研究
（1）以慢性稳定性心绞痛患者为研究对象，采用多中心RCT的临床试验方法，在基础治疗上分别采用辨位循经取穴、他经取穴、非经非穴的干预方案，系统评价经穴效应循经特异性基本规律；
（2）以原发性高血压患者为研究对象，采用多中心随机对照的临床试验方法，在基础治疗上分别采用辨证循经及非经非穴的干预方案，系统评价经穴效应循经特异性基本规律。

2、经穴效应循经特异性中枢整合机制研究
以慢性稳定性心绞痛为研究载体，综合运用血氧饱和依赖功能磁共振技术（BOLD-fMRI）和事件相关电位（ERP）技术，采集循经取穴针刺与非循经取穴针刺、非经非穴针刺所引起的大脑神经信息响应时空特征，分别构建循经、非循经、非经非穴针刺效应的中枢时空网络模型。

【研究方案】
1、经穴效应循经特异性基本规律临床评价研究
（1）慢性稳定性心绞痛针刺治疗循经特异性基本规律临床评价
采用多中心、随机、对照临床研究方法，采用解释性试验设计，系统评价辨
位循经取穴、他经取穴、非经非穴的干预方案治疗治疗慢性稳定性心绞痛的临床疗效。

研究对象：378例慢性稳定性心绞痛患者
研究对象的选择：
①纳入标准：
✧符合慢性稳定性心绞痛诊断标准；
✧年龄在18至80岁之间；
✧发病大于3个月以上；
✧冠状动脉狭窄超过50%，且每周心绞痛发作次数≥5次；
✧加拿大心血管协会心功能评定量表为I～II级；
✧药物治疗3个月及以上。

②排除标准：
✧近三个月内发展为不稳定性心绞痛或心肌梗死；
✧心衰患者，加拿大心血管协会心功能评定量表为III～IV级；
✧伴有其他重要脏器实质性损害的患者，如肺气肿、肝肾功异常（AST，
ALT，GUN等指标高于正常值3倍以上）等；
✧怀孕妇女；
✧心电图提示出现其他心脏功能恶化改变。

试验分组：①循心经、心包经取穴组：内关、神门等；②循肺经（他经）取穴组：列缺、太渊等；③非经非穴组：非穴点1：肘内侧,肘尖与腋窝连线中点。

非穴点2：肱骨内上髁与尺骨腕部之间中点，尺侧缘等。

观察指标：
①主要结局指标：每周心绞痛发作次数：采用日记方式，记录心绞痛患者每周心绞痛发作次数。

②次要结局指标：
✧心电图运动负荷时间：运用动态心电图监测患者在活动平板上进行负荷
运动，直到ST段压低0.1mA的时间。

✧心绞痛程度评价：采用VAS评分模式，记分从0～10，分值越低，疼痛
程度越轻。

✧ST段最大压低值：评价患者在运动负荷时，心电图监测显示的ST段降
低的最大值。

✧生活质量评分
（2）原发性高血压针刺治疗循经特异性基本规律临床评价
采用多中心随机对照临床研究方法，采用解释性试验设计，系统评价辨证循经及非经非穴的干预方案治疗治疗原发性高血压的临床疗效。

研究对象：309例原发性高血压患者
研究对象的选择：
①纳入标准：
✧原发性高血压患者在停用降血压药物后血压维持在140/90mmHg和
179/109mmHg之间；
✧18岁以上患者；
✧近6个月以来没有接受过针灸治疗；
✧没有停用降压药物的禁忌症；
✧入组前2个月内没有更换过降压药物或者没有接受药物治疗。

②排除标准：
✧24小时动态血压监测发现收缩压峰值高于220mmHg，舒张压峰值高于
115 mmHg的患者；
✧继发性高血压患者；
✧重要脏器损害，监测指标高于正常值3倍；
✧伴有糖尿病、心衰、脑血管意外、心肌梗死、肿瘤等重大疾病的患者。

试验分组：①辨证循经取穴组；②非辨证循经取穴组；③非经非穴组；
观察指标：
①主要结局指标：24小时内血压均值。

使用动态血压监测患者24小时内的收缩压和舒张压，计算24小时内的均值。

②次要结局指标：
✧白天和夜晚的血压均值。

分别计算白天和夜晚患者的收缩压和舒张压均
值
✧血压峰值。

使用动态血压监测观察患者24小时内血压，记录血压最高
值。

✧血压改善值。

随访点的血压均值和基线期血压均值的差值。

血压昼夜节律、血压变异性等。

2、经穴效应循经特异性中枢整合机制研究
以60例符合纳入标准的慢性稳定性心绞痛患者为研究对象，随机分为①循经取穴组（内关等）；②循他经取穴组（列缺等）；③非经非穴组；④等待治疗组，每组15人，分别采集针刺治疗前后的影像数据，采用复杂网络分析等方法研究不同取穴针刺治疗前后脑功能响应的差异，并采用相关分析融合影像数据与临床治疗数据，分析脑功能响应和临床疗效的相关性，深入探讨经穴效应循经特异性的中枢网络整合机制。

【承担单位】成都中医药大学、西安电子科技大学、南京中医药大学
【课题负责人】唐勇
【经费比例】32%
课题2：经穴效应循经特异性局部启动靶向调节生物学基础研究
【研究目标】
（一）总体目标
以慢性心肌缺血动物模型为研究载体，观察针刺对穴区组织内肥大细胞、神经电活动、微循环及肥大细胞脱颗粒后分子事件的影响，探讨经穴效应循经特异性的局部肥大细胞相关始动及传入机制。

（二）五年目标
1.以慢性心肌缺血动物模型为研究载体，观察针刺对穴区组织内肥大细胞、神经电活动、微循环及肥大细胞脱颗粒后分子事件，探讨经穴效应循经特异性的局部肥大细胞相关始动及传入机制；
2.以健康受试者和慢性稳定性心绞痛患者为研究对象，观察不同穴位皮内微血管自律性舒缩活动的异同及针刺对微循环单位的影响，探讨经穴效应循经特异性的局部微循环始动及传入机制。

3.以上海市针灸经络研究中心为基地，与国内外有关组织合作，吸引更多的一流科学家和科研机构投入到中医基础理论研究中，建立多学科开放式针灸经络现代研究平台，培养高水平具有国际视野、掌握相关现代科学技术的针灸经络研究人才。

为加强我国在针灸经络研究方面的国际学术地位奠定基础。

4.发表核心期刊学术论文40篇，SCI杂志收录15篇，其中影响因子>4的3篇；培养博士研究生10名以上，并注意研究队伍建设，锻炼出一支多学科高水平研究队伍，形成合理的人才梯队，培养优秀年轻人。

【研究内容】
1、肥大细胞等与经穴效应循经特异性的相关性研究
（1）以慢性心肌缺血动物模型为研究载体，采用在体组织膜片钳等技术，观察针刺对肥大细胞膜上的钙、氯通道的影响，探讨针刺产生的应力调控作用机制；
（2）以动物模型为研究载体，运用离体肥大细胞在不同剪切速率、方向、振幅下，发现机械力刺激导致TRP通道开放的规律，采用剔除TRP通道蛋白上不同蛋白段的肥大细胞，重复实验，确定其物理机制，研究循经取穴、他经穴和非经非穴胶原纤维在不同应力参数刺激下的生物物理特性变化，阐明机械和电刺激
产生不同的始动信号与疗效的关系；
（3）以动物模型为研究载体，通过剔除神经纤维和肥大细胞之间的连接蛋白基因，观察针刺对神经启动信号的影响，研究肥大细胞和神经纤维的细胞膜和化学物质的关联关系，以及这种关联对针刺信号在向神经系统转移中的重要作用，获得针刺有效信号的启动与传入特征；
（4）以动物模型为研究载体，通过调节穴位处化学物质浓度、拮抗或激活相应受体对有关传入神经放电以及针刺穴位引起的脏腑效应的影响，研究肥大细胞脱颗粒下游分子事件、肥大细胞-微循环关联、揭示肥大细胞相关分子及肥大细胞-微循环靶向整合的机制。

2、经穴区微血管自律性舒缩活动的循经特异性研究
以健康志愿者和慢性稳定性心绞痛患者为研究对象，分别比较经穴与非经非穴、同一经脉不同穴区、以及不同经脉穴位区皮内微血管自律性舒缩活动的特异性、共性和差异性，揭示经穴区皮内微血管自律性舒缩活动的循经特异性。

【研究方案】
1、肥大细胞等与经穴效应循经特异性的相关性研究
（1）拟采用心肌缺血大鼠模型，分别用定量手针仪和电针仪两种不同模式的针刺工具刺激实验动物穴位，以心电变化、血压变化、痛阈提高等作为效应指标。

同时对穴位处进行微透析，采用高效液相分析方法研究针刺前后穴位处腺苷类等化学物质的变化水平与针刺效应之间的关系。

循经穴位处组织染色观察肥大细胞的形态，研究腺苷类物质在针刺过程中的变化与肥大细胞脱颗粒之间的联系。

（2）拟通过基因手段培养TRPV2蛋白缺失的小鼠，以同窝野生型为对照，结合局部注射特异性拮抗剂观察针刺内关穴区等对心脏电活动的影响，阐明穴位处该基因蛋白在经穴效应循经特异性中的作用。

（3）利用人体肥大细胞系（HMC-1）的培养，通过平行板流动腔技术，施加切应力刺激，模拟循径组织液流动状态下的环境因素，使用钙荧光技术对细胞内的钙离子浓度进行实时测量，考察人体肥大细胞在不同形式的切应力刺激激活率的变化。

同时，采用TRPV2蛋白的特异性拮抗剂，屏蔽肥大细胞膜上TRPV2蛋白，进一步研究肥大细胞在切应力刺激下激活的分子基础。