枯草芽孢杆菌产胞外淀粉酶高产菌株的选育讲义

枯草芽孢杆菌产胞外淀粉酶高产菌株的选育
在以微生物为材料的遗传学研究中，用某些物理因素或化学因素处理微生物，使基因发生突变，可能导致微生物提高或者减低合成某一物质的能力。

物理诱变剂常用的有X射线、紫外线、快中子、γ射线等。

诱变处理首先是选择诱变剂，微生物诱变中最常用的物理诱变剂是紫外线。

用诱变剂处理微生物，一般要求微生物呈单核的单细胞或单孢子的悬浮液，分布均匀，这样可以避免出现不纯的菌落。

用于诱变处理的微生物一般处于对数生长期，处于该期的细菌对诱变剂最敏感。

必须选择合适的剂量进行诱变处理，剂量的表示有二种，绝对剂量和相对剂量。

绝对剂量的单位以尔格/cm2表示，一般用相对剂量。

相对剂量与3个因素有关：诱变源和处理微生物的距离、诱变源（紫外灯）的功率、处理的时间。

前2个因素是固定的，所以通过处理时间控制诱变剂量。

处理不同微生物的最适剂量是不同的，须经预备实验确定。

本综合实验利用紫外线诱变枯草芽孢杆菌悬浮的菌体，分析不同参数下的紫外线致死率及诱变率，筛选产量提高的产淀粉酶菌株。

学习物理因素诱变育种的方法，并掌握分光光度法测定液化型淀粉酶活力的基本原理和方法，最终从诱变菌株中筛选出淀粉酶活力较高的菌株。

实验一紫外诱变及高产菌株的初筛
（一）实验目的
通过实验，观察紫外线对枯草芽孢杆菌的诱变效应，并学习物理因素诱变育种的方法。

（二）实验材料与用品
菌种：枯草芽孢杆菌(产胞外淀粉酶)；
仪器：血球计数板，显微镜，紫外线灯（15W），电磁搅拌器，离心机。

（三）实验内容与方法
（1）菌悬液的制备
a) 取培养48小时的枯草芽孢杆菌的斜面4—5 支，用无菌生理盐水将菌苔洗下，并倒入盛有玻璃珠的小三角烧瓶中，振荡30分钟，以打碎菌块。

b) 将上述菌液离心（3000r/min，离心 15 分钟），弃去上清液，将菌体用无菌生理盐水洗涤2—3次，最后制成菌悬液。

c) 用显微镜直接计数法计数，调整细胞浓度为每毫升 108个。

（2）平板制作
将淀粉琼脂培养基溶化后，冷至55℃左右时倒平板，凝固后待用。

（3）紫外线处理
a) 将紫外线灯开关打开预热约 20分钟。

b) 取直径6cm无菌平皿2套，分别加入上述菌悬液 5ml，并放入无菌搅拌棒于平皿中。

c) 将盛有菌悬液的2平皿置于磁力搅拌器上，在距离为 30cm，功率为 15W 的紫外线灯下分别搅拌照射1分钟及3分钟。

（4）稀释在红灯下，将上述经诱变处理的菌悬液以10 倍稀释法稀释成 10-1-10-6（具体可
按估计的存活率进行稀释）。

（5）涂平板取 10-4、10-5、10-6三个稀释度涂平板，每个稀释度涂平板 3只，每只平板加稀释菌液0.1 ml，用无菌玻璃刮棒涂匀。

以同样操作，取未经紫外线处理的菌稀释液涂平板作对照。

（6）培养
将上述涂匀的平板，用黑布（或黑纸）包好，置37℃培养 48 小时。

注意每个平皿背面要标明处理时间和稀释度。

（7）计数将培养
48小时后的平板取出进行细菌计数，根据对照平板上菌落数，计算出每毫升菌液中的活菌数。

同样计算出紫外线处理 1分钟、3 分钟后的存活细胞数及其致死率。

（8）观察诱变效应
将细胞计数后的平板，分别向菌落数在5—6 个左右的平板内加碘液数滴，在菌落周围将出现透明圈。

分别测量透明圈直径与菌落直径并计算其比值（HC 值）。

与对照平板进行比较，根据结果，说明诱变效应。

并选取HC比值大的菌落移接到试管斜面上培养。

（四）实验作业
记录实验数据，分析实验结果并进行讨论，撰写实验报告。

实验二高产菌株的鉴定
（一）实验目的
1．掌握分光光度法测定液化型淀粉酶活力的基本原理和方法；
2．从初筛所获得的诱变菌株中筛选出淀粉酶活力高的菌株。

（二）实验原理
淀粉酶是指能催化分解淀粉分子中糖苷键的一类酶，包括α-淀粉酶、淀粉1，4-麦芽糖苷酶（β-淀粉酶）、淀粉1，4-葡萄糖苷酶（糖化酶）和淀粉1，6-葡萄糖苷酶（异淀粉酶）。

α-淀粉酶可以从淀粉分子内部切断淀粉的α-1，4糖苷键，形成麦芽糖、含6个葡萄糖单位的寡糖和带有支链的寡糖，使淀粉的粘度下降，因此又称为液化型淀粉酶。

淀粉遇碘呈蓝色。

这种淀粉-碘复合物在660nm处有较大的吸收峰，可以用分光光度计测定。

随着酶的不断作用，淀粉长链被切断，生成小分子糊精，使其对碘的蓝色反应逐渐消失，因此可以根据一定时间内蓝色消失的程度为指标来测定α-淀粉酶的活力。

（三）实验用品
1．粗酶液
实验一保存的HC比值大的菌落进行摇瓶发酵，发酵液离心后可作为粗酶液。

2．试剂
碘原液：称取碘化钾22g，加少量蒸馏水溶解，加入碘11g，溶解后定容至500ml，贮于棕色瓶中；
比色用稀释碘液：取碘原液2ml，加碘化钾20g，用蒸馏水定容至500ml，贮于棕色瓶中；
2%可溶性淀粉：称取可溶性淀粉（干燥至恒重）2g，用少量蒸馏水混合调匀，徐徐倾入煮沸的蒸馏水中，边加边搅拌，煮沸2min后冷却，加水定容至100ml，需当天配制；
pH6.0的磷酸氢二钠－柠檬酸缓冲液：称取磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）4.523g，柠檬酸0.807g，用水溶解并定容至100ml；
0.5mol/L乙酸溶液。

3．器材
离心机，分光光度计，恒温水浴锅，试管架，秒表；试管，移液管，烧杯，离心管。

（四）实验方法
1．标准曲线的绘制：
表2－1标准曲线的制作
将可溶性淀粉稀释成0.2%，0.5%，1%，1.5%，2%的稀释液；
吸取淀粉稀释液2.0ml加至试管中，加入磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液1.0ml，40℃水浴保温15min；
加蒸馏水1ml，40℃保温30min后加入0.5mol/L乙酸10ml；
吸取反应液1ml，加入稀碘液10ml，混匀，在660nm下测吸光值A；
以淀粉浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，作标准曲线。

2．酶液的制备
将发酵液离心（5000r/min，10min），取上清液作为粗酶液，以pH6.0缓冲液稀释至适当浓度，作为待测酶液。

3．淀粉酶活力测定
按下列程序操作：
（五）注意事项
1．淀粉一定要用少量冷水调匀，再倒入热水中溶解，若直接加到热水中，会溶解不均匀，甚至结块。

淀粉液应当天配制，配好的淀粉液应是透明澄清的，不能有颗粒状物质存在。

2．酶液应该进行适当稀释。

（六）作业
1．绘制标准曲线。

2．记录各样品的A660，并计算其酶活力，计算方法参见附录。

（七）思考题
1．测定酶活力时，在具体操作上应注意哪些问题？
2．为什么测定酶活力的试剂要在40℃水浴锅中预热？
附：
酶活力单位的定义：1 ml酶液在40℃、pH 6.0的条件下，每小时分解的淀粉的毫克数。

表示为U/ml。