CTAB法提取DNA、Trizol一步法提RNA及注意事项

CTAB法提取DNA及注意事项
0.1g菌丝体（植物新鲜组织）+ CTAB+适量石英砂研磨－→混匀－→ 65℃水浴1 h－→ 冰浴10min－→ 离心取研磨液于1.5mL 离心管－→ +700μL苯酚，混匀（5~20min）－→ 离心15min(10,000r) －→取上清液三次－→ +500μL（等体积）氯仿，混匀5—10 min－→ +离心15min －→取200μL上清液2次－→ 400μL异丙醇（等体积）上下颠5次，静置15min,离心10min－→去溶液，+700μL70%乙醇－→摇晃、离心10min－→去溶液，倒扣于纸上至酒精及水分挥发完
原理及注意事项：
1、加CTAB研磨：这一步骤是使得细胞裂解，CTAB是离子型表
面活性剂能溶解细胞膜及核膜蛋白，使核蛋白解聚、DNA游离。

（注意：若是用液氮研磨，则加CTAB前需将CTAB65℃预热，
因为当环境温度低于15℃时，CTAB析出，加冰冷样品前需预
热。

在液氮中研磨使材料易于破碎，减少酶的作用）
2、水浴过程中每需10 min混匀一次，使样品裂解充分。

3、加氯仿：异戊醇（24:1），使蛋白质变性、抽提液分相，核酸水
溶性强，离心可除去细胞碎片及大部分蛋白质。

4、取上清液（400微升，避免吸油层），
RNA提取（提前分装75%乙醇-DEPC及DEPC水）
Trizol一步法
1. 100 mg 叶片，液氮研磨（进口2 mL 管）。

2. 加入1 mL左右（800 μL）Trizol抽提液，摇匀，静置5 min （室温）。

3. 按每mL Trizol提取液加入200 μL 氯仿，剧烈震荡15 s ，室温静置5 min （3 min）。

4. 1,2000 r ,4℃离心15 min （提前将离心机调至4℃，盖上盖子，按下short键）。

取400-500μL 上清液（1.5 mL进口），加入等体积（500-600μL）异丙醇，颠倒混匀，-20℃，20 min （可省）。

5. 1,2000 r，4℃离心10 min, 弃上清液，1 mL75%乙醇清洗沉淀两次，每洗涤一次5000 r,4℃离心5 min。

（乙醇：75 mL无水乙醇+ 25 mL DEPC水）
6. 弃上清液，室温干燥，加30-40 μL ddH2O（经0.1% DEPC水处理，30μL /15μL），必要时可在55-60℃水浴助浴，保存-70℃或直接用于Northern Blot分析。

注意：RNA十分容易被降解，因此在操作过程中需戴手套，防止汗液中的RNA酶降解RNA。

提取RNA过程所需用具均需经严格灭菌、RNA酶失活处理。