教案3 食品中山梨酸、苯甲酸、糖精钠的测定

项目五用高效液相色谱法检测物质
任务一食品中山梨酸、苯甲酸、糖精钠的测定（液相色谱法）
单元一液相色谱分离原理和液相色谱仪的基本组成
教学内容
苯甲酸和山梨酸是我国目前最常用的食品防腐剂，广泛应用于各种果汁饮料中，以防止其变质。

但如果防腐剂的含量超过标准限度，或者长期饮用含有防腐剂的饮料，则会对人体健康造成不得影响，因此检测果汁中的苯甲酸和山梨酸含量是非常有必要的。

表GB2760-2007国家食品添加剂使用卫生标准
抑制物质腐败的药剂。

即对以腐败物质为代谢底物的微生物的生长具有持续的抑制作用。

重要的是它能在不同情况下抑制最易发生的腐败作用，特别是在一
般灭菌作用不充分时仍具有持续性的效果。

对纤维和木材的防腐用矿油、煤焦油、丹宁，对生物标本用甲醛、升汞、甲苯、对羟基苯甲酸丁酯、硝基糠腙衍生物或香脂类树脂。

在食品中使用防腐剂受到限制，因此多靠干燥、腌制等一些物理的方法。

特殊的防腐剂有乙酸等有机酸、以油酸脂为成分的植物油、芥子等特殊的精油成分。

对于生物体的局部（如人体表面或消化道），可以根据具体条件采用各种防腐剂（如碘仿、水杨酸苯酯、苯胺染料或吖啶类色素等）。

我国规定使用的防腐剂有苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸、山梨酸钾、丙酸钙等25种。

防腐剂应具备的几个条件：
1、性质较稳定：加入到食品中后在一定的时期内有效，在食品中有很好的稳定性
2、低浓度下具有较强的抑菌作用
3、本身不应具有刺激气味和异味
4、不应阻碍消化酶的作用，不应影响肠道内有益菌的作用
5、价格合理，使用较方便。

防腐剂的作用机理：
1、能使微生物的蛋白质凝固或变性，从而干扰其生长和繁殖。

2、防腐剂对微生物细胞壁、细胞膜产生作用。

由于能破坏或损伤细胞壁，或能干扰细胞壁合成的机理，致使胞内物质外泄，或影响与膜有关的呼吸链电子传递系统，从而具有抗微生物的作用。

3、作用于遗传物质或遗传微粒结构，进而影响到遗传物质的复制、转录、蛋白质的翻译等。

4、作用于微生物体内的酶系，抑制酶的活性，干扰其正常代谢。

高效液相色谱法概述
液相色谱是一种分离与分析技术。

相对于以气体作为流动相的气相色谱，凡是以液体作为流动相的任何一种色谱过程均为液相色谱。

在色谱发展过程中，根据固定相的形式产生了各自的命名，如纸色谱(Paper Chromatography)、薄层色谱(Thin-layer Chromatography)和柱色谱(Column Chromatography)。

在柱的液相色谱中，根据溶质在两相中分配机理的不同，可分为吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、离子色谱、排阻色谱等。

目前液相色谱主要指柱液相色谱。

高效液相色谱法在其发展过程中，曾出现过几种名称，其中有高速液相色谱(High Speed Liquid Chromatography)、高效率液相色谱(High Efficiency Liquid Chromatography)、高压液相色谱(High Pressure Liquid Chromatography)和高效能液相色谱(High Performance Liquid Chromatography)。

后一命名被广泛接受，缩写为HPLC。

1.2 高效液相色谱法的特点
高效液相色谱特别适合于分离分析高沸点、热稳定性差、高极性、高相对分子质量以及离子型的各种物质，只要被分析对象在流动相中可以溶解且适合于检测器，就可以直接进样分析。

蛋白质、氨基酸、酶、多肽、脂肪酸、维生素、糖类都可以作液相色谱分析。

聚乙烯、聚丙烯、聚酯等高相对分子质量的聚合物也可用排阻色谱法来分析。

高效液相色谱仪通常是在室温下操作，在特殊情况下，柱温也可在30～40℃操作。

样品一般不需处理，操作简便。

液相色谱不仅用于分析目的，有时也应用
制备色谱来制备少量纯样品。

目前，液相色谱发展集中在三个方面：①高效填料、高效柱在色谱领域倍受关注，是专业厂商争夺的战场；②使用微柱(柱径小于lmm)可使溶剂用量非常少，既降低成本，又减少污染，但为配合微柱使用，进样装置、检测器以及泵都要小，仪器制造困难；⑧发展更通用、灵敏度更高的检测器。

1.3 高效液相色谱固定相及流动相
1.3.1 固定相
由于在液相色谱中，存在着组分与固定相和流动相三者之间的作用力，因此固定相的选择是完成分离的一个重要因素。

根据色谱分离机理，固定相包括吸附色谱用的硅胶、氧化铝；分配色谱用的碳十八烷基、苯基、腈基、胺基等各种键合固定相；离子交换色谱用的离子交换剂等。

在液相色谱中，用于键合固定液的基质材料主要是硅胶和苯乙烯交联共聚物。

作为基质的硅胶主要分为薄壳型和全多孔型：薄壳型是由一个没有孔的坚硬内核(如玻璃、硅胶等)，在核的外表面结合上多孔薄层硅胶填料，这种填料表面积小、容量低、但分析速度快、柱效高；全多孔球型填料承载样品量大、柱效也很高，苯乙烯和二乙烯苯的交联共聚物，经常用作离子交换的母体，能够耐酸碱。

1.3.2 流动相
液相色谱流动相可称为溶剂(Solvent)[洗脱液(Eluent)或载液(Carrier Liquid)]，与此相应被分离的物质称之为溶质(Solute)或洗脱物(Elute)。

在给定固定相之后，溶质的保留以及物质对的分离，主要取决于所选定的溶剂。

从广义上讲，溶剂对改变溶质K‘（容量因子见气相色谱理论）的能力称为
溶剂强度。

能使溶质的K’越小，这种溶剂的溶剂强度就越大。

在液相色谱中，如果固定相的极性大于流动相的极性，则称色谱过程为正相色谱；如果固定相的极性小于流动相的极性，则称之为反相色谱。

1.3高效液相色谱法的主要类型
1.4.1液固吸附色谱法
吸附色谱(Adsorption Chromatography)，也称之为液固色谱(Liquid solid Chromatography)。

吸附一词可能更准确地反映这类分离过程的本质。

吸附色谱是经典的色谱分离过程，固定相是吸附剂，流动相是以非极性烃类为主的溶剂。

溶质的分离取决于溶质与流动相分子在吸附剂表面上的吸附竞争，不同组分分子与吸附剂分子间作用力不同，从而表现出不同组分的吸附平衡常数不同而得到最终分离。

液固吸附色谱由于传质快，装柱容易，重现性较好，70年代前期曾得到广泛应用。

其不足之处是试样容量小，需配用高灵敏度的检测器。

1.4.2 液液分配色谱法
分配色谱(Partition Chromatography)以溶质在流动相和固定相中的分配为基础，在液相色谱中，固定相是通过化学键合的方式固定在基质上。

组分分离是依据不同的组分在互不相溶的两相中分配系数不同，这是液液分配色谱中组分之所以能被分离的根本原因。

液液分配色谱根据固定相和流动相的相对极性，可分为正相分配色谱和反相分配色谱两类。

在正相分配色谱中，固定相的极性大于流动相的极性，组分在柱内的洗脱顺序按极性从小到大流出。

在反相色谱中，固定相是非极性的，流动相是极性的。

组分的洗脱顺序和正相色谱相反，极性大的组分先流
出，极性小的组分后流出。

在液液分配色谱中，流动相和固定相均为液体，作为固定相的液体是涂在很细的惰性载体上，可用于极性、非极性、水溶性、油溶性、离子型和非离子型等各种类型样品的分离和分析。

1.4.3 离子交换色谱法
离子交换色谱法(IEC)是各种液相色谱法中最先得到广泛应用的现代液相色谱法，它是在60年代初期随着氨基酸分析的出现而发展起来的，主要用于分离分析离子型化合物。

1.4.4 体积排阻色谱法
溶质分子在多孔填料表面上受到的排斥作用称为排阻(Exclusion)。

如果组分的分离是由于分子大小而引起的，则称为Size Exclusion Chromatography，这一类色谱的中文命名很不一致，如排阻、体积排阻、凝胶渗透、凝胶过滤色谱等。

液-液分配色谱法的分离机理
液-液分配色谱
键合相色谱：正相色谱与反相色谱
反相液相色谱
反相液相色谱是目前液相色谱分离模式中使用最广泛的一种分离分析模式。

在反相液相色谱中，溶质在固定相上的保留是基于分子间的非特异性疏水作用，由于所有的有机化合物分子都存在疏水基团，因此反相色谱更普遍适用于极性、非极性；水溶性、油溶性；离子性、非离子性；小分子、大分子；具有官能团差别或
分子量差别的同系物的分离。

（一）流动相
1．常见流动相
流动相洗脱强度顺序：水<甲醇<乙腈<乙醇<四氢呋喃<丙醇<二氯甲烷（与水不混溶）。

2．流动相的使用原则
一般情况下，甲醇水体系能够满足多数样品的分离要求，但乙腈往往是首选，一方面因其具有非常低的粘度，另一方面该洗脱液在低紫外（185~210nm）检测无吸收。

有些强疏水性样品即使采用100%乙腈仍无法洗脱，可采用更强的流动相（如四氢呋喃水或四氢呋喃乙腈）。

（二）固定相
反相色谱法最常用的固定相是C18、C8和苯基键合相的填料，在分离极性很大的化合物时，也可以采用氨基、氰基等极性基团键合固定相。

（三）反相色谱的分离机理
主要基于被分离溶质与固定相疏水作用力的差别。

通过调节固定相和流动相的性质。

疏溶剂
图示疏溶剂理论模型
理论：当溶质分子进入极性流动相后,即占据
流动相中相应的空间，而排挤一部分溶剂分子；当溶质分子被流动相推动和固定相接触时，溶质分子的非极性部分或非极性分子）会将非极性固定相上附着的溶剂膜排挤开，直接和非极性固定相上的烷基官能团相结合（吸附）形成缔合物，构成单分子吸附层；当流动相极性减小时，这种疏溶剂斥力下降，会发生解缔，并把溶质分子释放而被洗脱下来.
学生解释物质的分离原理
固定相的选择
流动相的选择
其它几种液相色谱分离类型
名称分离原理固定相流动相应用
极性：硅胶（酸性）、氧化镁和硫酸镁分子筛等液固吸附色谱基于各组分对
固定相吸附能力的差异非极性：高强度多孔微粒活性炭和多孔石墨化炭黑等
选择要求：基本原则：极性大的试样用极性较强（ε）的流动相，极性小的用低极性流动相常用于分离极性不同的化合物，但也能分离那些具有相同极性基团，
但数量不同的样品，还适用于分离异构体。

正相：极性固定液
非极性溶剂（主体为己烷、庚烷，可加入<20%的极性改性剂）
用来分离极性较强的水溶性样品（非极性组分先，极性组分后）
液液分配色谱基于各组分在两相间的分配定律反相：极性较弱或非极性的固定液极性较强的溶剂（主体为水，加入一定量的改性剂）用来分离油溶性样品（极性组分先，非极性组分后）GFC（凝胶过滤色谱）：水溶剂
凝胶色谱依据分子尺寸大小的顺序来进行分离多孔性聚合材料
GPC（凝胶渗透色谱）：有机溶剂用来分析高分子物质的相对分子量分布离子色谱基于离子交换树脂上可离解的离子与流动相中具有相同电荷的溶质离子之间进行的可逆交换，
学生练习：
分离下述化合物，宜选用何种色谱方法？
（A）聚苯乙烯相对分子量分布（B）多环芳烃
（C）氨基酸（D）Ca 2+，Ba 2+，Mg 2+
按固定相与流动相相对极性的不同，液液分配色谱可分为哪两类方法？现在有A、B 两物质，极性A＞B，问在两种液液分配色谱上的出峰顺序如何？
高效液相色谱仪
图高效液相色谱仪流程示意图
高效液相色谱仪由输液系统、进样装置、分离柱、检测处理系统等部分组成1.5.1 高压泵
高压泵是高效液相色谱的关键部件之一，用它完成流动相的输送任务，要求它输送的流动相压力稳定，流速恒定(士1％)；耐高压(30～60MPa)，耐腐蚀，流量可调，适用于梯度洗脱等。

(1)恒压泵：输出压力恒定的泵。

气源为高压气瓶。

高压泵所输出的流动相的流速不仅与泵的输出压力有关，而且与流动相的黏度、色谱柱的长度、填充物颗粒大小以及填充的均匀度均有关系。

由于影响因素多，就要求泵的性能好，否则，整个仪器及分析结果的可靠性会受到严重影响。

常用的恒压泵为气动放大泵。

这种泵的优点是输出无脉动，对检测器的噪声低，输出压力高，但输出的流动相流速欠稳定。

(2)恒流泵：输出流量恒定的泵，称为恒流泵。

它所输出的流量不受色谱柱阻的影响，若柱阻增大，输出的压强也增大，柱阻减小，输出压强也减小。

因此，可保持流量恒定。

常用的为螺旋泵和往复泵。

(3)螺旋泵：其工作状态是用马达带动螺杆，以推动活塞快速运动，可获得高压无脉动的液流输出。

当调节活塞的运动速度时，可使输出流量改变。

这种泵可承受的压力一般在20～50MPa。

为防压力过高产生危险，泵设有过压保护和压力指示。

(4)往复泵：常用的是柱塞往复泵。

这种泵类似于打气筒，泵内体积小，
输出流量恒定，适宜于梯度洗脱。

但输出液脉动大，需加阻尼器。

1.5.2 梯度洗脱装置
梯度洗脱装置可分为高压梯度与低压梯度两种。

高压梯度(或称内梯度)是按预先设计的程序分别用两台高压泵把两种溶剂输入一个混合器，待混合均匀后再输入色谱柱。

低压梯度(或称外梯度)是将两种溶剂按一定程序混合，再用一台高压泵输入色谱柱。

这两种装置各有优缺点，前者价格贵，准确度高。

后者成本低廉，使用方便。

1.5.3 进样装置
高效液相色谱中的进样方法有多种，如隔膜式进样、停流进样、阀进样或自动进样器进样等。

进样装置安装在进样口处，坏了可随时拆卸清洗、更换。

先进的高效液相色谱仪都配有自动进样器，一般用于无人操作或样品数量多需很快报出分析结果的情况。

这种进样器采用微机控制一个六通阀的采样、进样及清洗、干燥等动作。

工作时将样品小瓶置于转盘式(也有直排式、链式等)样品架小孔内(多达几十个)，按一定程序启动仪器，仪器自动进行工作，一段时间便全部工作完成，自动报出分析结果。

1.5.4 色谱柱
色谱柱是高效液相色谱的重要部件，可用不锈钢管、氟塑料或玻璃管制成，对不锈钢管柱的内壁要仔细抛光，以保证装填固定相的均匀性和色谱柱效的提高。

色谱柱一般制成直形，便于填充与安装。

长度一般30cm左右，内径l～
4mm。

其中内径2～3mm使用较多；小于lmm的细管径柱已经问市，由于柱细，柱长可适度增长，所制成的高效液相色谱毛细管柱具有很高的柱效，同时也节省溶剂。

1.5.5 检测器
检测器是检测色谱柱分离过程中组分在流动相中浓度的变化的重要部件，要求灵敏度高、噪声低、线性范围宽、重现性好、适用性广等。

常用的检测器有紫外光度检测器(UV)、示差折光检测器(RI)、微吸附热检测器(MAD)、氢火焰检测器(FID)、荧光检测器等，其中紫外检测器最常用。

各种检测器均有优缺点，液相色谱一质谱联用仪是当前最优秀的仪器之一，质谱仪是其中最灵敏的检测器，它不仅如此，而且具有快速、准确度高、可测定组分的结构等特点。

项目五用高效液相色谱法检测物质
任务一食品中山梨酸、苯甲酸、糖精钠的测定（液相色谱法）单元二液相色谱仪基本操作
教学内容
复习气相色谱仪的基本组成和分析流程
教师引入液相色谱仪的基本操作
教师展示液相色谱仪操作的整个过程（本过程以“教师现场演示”的方式进行教学，目的是让学生掌握整个测定过程）
配制流动相：甲醇/水（85/15）的流动相1000mL，并进行过滤和脱气处理。

把流动相贮液器放置在略高于高压泵的位置，插入带有不锈钢滤芯的输液管
更换色谱柱。

设置流动相比例、流量等参数。

打开高压泵的电源开关，打开排放阀，“purge”1-2分钟，关闭“purge”，使仪器在设定的条件下平衡。

打开检测器开关，设置检测波长。

打开工作站，设置分析方法。

等基线平衡后，用微量注射器量取定量环体积的3-5倍的苯试样(10μL分析纯苯试样，用甲醇稀释至50mL)，在上述分析条件下进样。

记录下样品名对应的文件名，同时打印出经优化的色谱图和分析结果。

学生分组练习（根据实验室的实际情况，安排学生分组练习，一部分学生练习配制流动相，一部分学生练习操作仪器。

）
液相色谱仪的基本组成
（教师结合学生的练习，讲解岛津液相色谱仪的组成）
1、高压输液系统：贮液器和高压输液泵
①贮液器
贮液器主要用来提供足够数量的符合要求的流动相以完成分析工作，对于贮液器的要求是：第一、必须有足够的容积，以备重复分析时保证供液；第二、脱气方便；第三、能耐一定的压力；第四、所选用的材质对所使用的溶剂都是惰性的。

②高压输液泵(Pump)
高压输液泵是高效液相色谱仪的关键部件，其作用是将流动相以稳定的流速或压力输送到色谱
分离系统。

要求：由于高压输液泵的性能直接影响到分离分析结果的好坏，因此，实际分析过程中为了保证良好的分离分析结果，要求高压输液泵必须满足以下几点要求：第一、泵体材料能耐化学腐蚀；第二、能在高压（30～60MPa）下连续工作；第三、输出流量稳定（±1%），无脉冲，重复性高（±0.5%），而且输出流量范围宽；第四、适用于梯度洗脱。

类型：高压输液泵一般可分为恒压泵和恒流泵两大类。

③过滤器(Filter)
在高压输液泵的进口和它的出口与进样阀之间，应设置过滤器。

其作用是防止微小的机械杂质进入流动相，损害高压输液泵和进样阀。

常见的溶剂过滤器和管道过滤器的结构，
2、进样系统
液相色谱进样针类似于气相色谱进样针，只是其针头为平头，以免扎破六通阀管
路。

常用的进样器有以下二种：
①六通阀进样器
现在的液相色谱仪所采用的手动进样器几乎都是耐高压、重复性好和操作方便的阀进样器。

六通阀进样器是最常用的，进样体积由定量管确定，常规高效液相色谱仪中通常使用的是10μL，20μL体积的定量管。

②自动进样器
3、分离系统
分离系统的主要部件是色谱柱，柱效高、选择性好、分析速度快是对色谱柱的一般要求。

此外，色谱柱在装填料之前是没有方向性的，但填充完毕的色谱柱是有方向的，即流动相的方向应与柱的填充方向（装柱时填充液的流向）一致。

色谱柱的管外都以箭头显著地标示了该柱的使用方向，安装和更换色谱柱时一定要使流动相能按箭头所指方向流动。

一般在色谱柱前要求安装保护柱，起到保护延长分析柱寿命的作用。

有些物质的分离条件要求有一定的温度，因此，给色谱柱配一个柱温箱是非常有必要的。

4、检测系统
HPLC 检测器是用于连续监测被色谱系统分离后的柱流出物组成和含量变化的装置。

其作用是将柱流出物中样品组成和含量的变化转化为可供检测的信号，完成定性定量分析的任务。

HPLC 检测器一般分为两类，通用型检测器和专用型检测器。

通用型检测器包括折光指数检测器、电导检测器和蒸发光散射检测器等。

专用型检测器包括紫外-可见光检测器和荧光检测器。

5、数据处理系统(色谱工作站)
高效液相色谱的分析结果除可用记录仪绘制谱图外，现已广泛使用色谱数据处理机和色谱工作站来记录和处理色谱分析的数据。

液相色谱操作中的注意事项，如溶剂的使用，色谱柱的安装、进样针的使用等。

液相色谱的分析流程与气相色谱的分析流程有何不同？
液相色谱仪与气相色谱仪的基本组成有何不同？
岛津液相色谱仪操作规程
3.7.1开机：
打开泵电源、设定流速、更换流动相、平衡柱子30分钟；
[Func]+“流速”+[enter]
打开检测器，设定波长；
[Func]+“波长”+[enter]+[CE]
打开工作站（积分议），设定相关参数；
3.7.2进样及数据采集
进样方法：插针，搬起，注入，搬下，拔针。

数据处理及打印报告
关机：
3.7.3 数据采集完毕即可关闭检测器;
泵更换甲醇冲洗流路30分钟(如使用缓冲盐流动相请先用水冲洗流路10分钟); 关泵
注意事项：
（1）流动相必须用HPLC级的试剂，使用前过滤除去其中的颗粒性杂质和其他物质(使用0.45um或更细的膜过滤)。

（2）流动相过滤后要用超声波脱气，脱气后应该恢复到室温后使用。

（3）不能用纯乙腈作为流动相，这样会使单向阀粘住而导致泵不进液。

（4）使用缓冲溶液时，做完样品后应立即用去离子水冲洗管路及柱子(一小时)，然后用甲醇(或甲醇水溶液)冲洗40分钟以上，以充分洗去离子。

对于柱塞杆外部，做完样品后也必须用去离子水冲洗20ml以上。

（5）长时间不用仪器，应该将柱子取下用堵头封好保存，注意不能用纯水保存柱子，而应该用有机相(如甲醇等)，因为纯水易长霉。

（6）每次做完样品后应该用溶解样品的溶剂清洗进样器。

（7）C18柱绝对不能进蛋白样品，血样、生物样品。

（8）堵塞导致压力太大，按预柱→混合器中的过滤器→管路过滤器→单向阀检查并清洗。

清洗方法；①以异丙醇作溶剂冲洗：②放在异丙醇中间用超声波清洗；③用10％稀硝酸清洗。

（9）气泡会致使压力不稳，重现性差，所以在使用过程中要尽量避免产生气泡。

（10）如果进液管内不进液体时，要使用注射器吸液：通常在输液前要进行流动相的清洗。

（11）要注意柱子的PH值范围，不得注射强酸强碱的样品，特别是碱性样品。

（12）更换流动相时应该先将吸滤头部分放入烧杯中边振动边清洗，然后插入新的流动相中。

更换无互溶性的流动相时要用异丙醇过渡一下。

高效液相色谱的定性与定量分析方法与气相色谱法基本相似，所用的各种名词
与参数也相同。

定性方法（联系气相色谱的定性）
1、利用已知标准样品定性
利用标准样品对未知化合物定性是最常用的液相色谱定性方法，该方法的原理与气相色谱法中相同。

2、利用检测器的选择性定性
双检测器定性体系可以用来对被测化合物进行定性分析，同一种检测器对不同种类的化合物的响应值是不同的，而不同的检测器对同一种化合物的响应也是不同的。

所以当某一被测化合物同时被两种或两种以上检测器检测时，两检测器或几个检测器对被测化合物检测灵敏度比值是与被测化合物的性质密切相关的。

3、利用紫外检测器全波长扫描功能定性
紫外检测器是液相色谱中使用最广泛的一种检测器。

全波长扫描紫外检测器检测化合物的紫外光谱图。

再通过对照标准谱图的方法来识别化合物。

此外，利用二极管阵列检测器得到的包括有色谱信号、时间、波长的三维色谱光谱图，其定性结果与传统方法相比具有更大的优势。

归一化法定量
归一化法：归一化法要求所有组分都能分离并有响应，其基本方法与气相色谱中的归一化法类似。

计算公式为wi = Ai / åAi
实例：本次实验数据的计算处理。

HPLC 方法的建立
（教师可引导学生对甲苯纯度测定方法予以分析）。