二、肿瘤干细胞及其耐药机制

肿瘤干细胞及其耐药机制
欧扬郭秀丽
(山东大学药学院新药药理研究所,济南250012)
摘要肿瘤干细胞是存在于造血系统肿瘤和一些实体瘤中具有干细胞特性的细胞。

肿瘤干细胞假说认为,经药物治疗后肿瘤复发和转移与肿瘤干细胞残存有密切关系。

其原因可能是肿瘤干细胞高表达ABC转运蛋白和B c-l2抗凋亡蛋白,同时其本身又具有一些干细胞特性。

对肿瘤干细胞耐药机制的研究,将有助于发现新的肿瘤治疗靶点和更好的抗癌策略。

关键词肿瘤干细胞;耐药性;ABC转运蛋白;治疗
中图分类号R730.2
Tum or Ste m C ells and D rug R esistance OU Yang,GUO X i u-L i(D e part m ent of N e wdrug P har m a-cology,School of Phar m aceu tical S ciences,Shandong University,Ji nan250012,China)
Abst ract The tum or ste m ce lls possessing ste m ce lls properties have been descri b ed i n hae m atopo ietic cancer and so m e so lid tu m ors.It is believed the regenera ti o n and displace of cancer after che m otherapy have ti g h ten relati o n w ith the residual tu m or ste m ce lls.The m ain reason is t h at tum or ste m cells over-ex-press ATP-b i n d i n g cassette drug transporters and B c-l2.M oreover,tu m or ste m ce lls have the character o f ste m cells.M ore insight into the m echan is m s o f tum or ste m cells m ight he l p l e ad to ne w therapeutic tar-gets and better anticancer strateg i e s.
K ey w ords tum or ste m cells;drug resistance;ATP-b i n d i n g cassette drug transporters;t h erapy
在肿瘤研究中,干细胞研究帮助人们加深对肿瘤的发生、发展及转移的认识。

研究者通过比较干细胞和肿瘤细胞,发现两者有惊人的相似之处,譬如同样具有自我更新和分裂增殖能力;同样有N otch、W nt、Sonic hedgehog(Shh)和Bm-i1等信号通路参与细胞的生长发育;具有迁移或转移能力[1]。

这些相似点暗示在肿瘤组织中可能存在一小部分非肿瘤细胞,与其它机体干细胞一样具有自我更新和无限增殖的能力,以及相似的耐药机制。

基于这些研究发现,研究者提出肿瘤干细胞(tumo r ste m cells,TSC)学说[1],并在一些肿瘤组织中找到了TSC存在的证据。

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一、TSC的证实
TSC是存在于一些肿瘤组织,具有自我更新和分裂增殖能力,与肿瘤细胞有不同分化表型的细胞,在肿瘤的发生、发展和转移中起重要作用[2]。

早在上世纪70年代,N o w ell等(1976)研究时发现从一些白血病病人血液中能分离出某些极少量的细胞,经体内移植后能进一步增殖形成脾集落,因此提出白血病干细胞(leuke m ia ste m ce lls,LSC)的概念。

此后,Bonnet等(1997)在急性髓性白血病(acute m ye-l o id leuke m i a,AM L)病人身上发现一群表面标记为CD34+CD38-的AML细胞,该群细胞具有分化、增殖和自我更新能力,接种到非肥胖型糖尿病/重症联合免疫缺陷(nonobese diabetic/severe co m bined i m-m unodeficiency disease,NOD/SC I D)小鼠体内能克隆形成AM L,相反,CD34-CD38+表型的AML细胞却不具有致瘤性。

进一步比较正常造血干细胞(H SC)和CD34+CD38-细胞表面标志物,发现CD34+CD38-细胞并不表达H SC的表面标记物Thy1,推测CD34+CD38-Thy1-细胞可能是LSC。

在一些实体瘤中研究者也找到了TSC存在的证据。

A-l H ajj等[3]将从人乳腺癌组织中分离纯化出的CD44+CD24-/low L i n-细胞接种到NOD/SCI D小鼠体内,结果在接种部位形成新的肿瘤。

从再生肿瘤中再次分离纯化得到CD44+CD24-/lo w L i n-细胞作第二次接种,仍可形成肿瘤,且前后形成的肿瘤细胞表型没有异质性差异,表明CD44+CD24-/low L i n-细胞具有肿瘤源性;在神经系统肿瘤中也找到TSC存在的证据。

S i n gh等[4]从小儿骨髓母细胞瘤和神经胶质瘤分离获得CD133+细胞亚群。

该群细胞在体外可被诱导分化为神经球,和正常的脑神经干细胞一样具有自我更新、分化和增殖能力;具有脑神经干细胞的表面标记物CD133和nesti n,但缺乏分化细胞的表面标记物。

当把CD133+细胞接种到NOD/ SC I D小鼠体内能很快诱导肿瘤形成,再生肿瘤和原来的肿瘤具有类似的表型。

另外,H e mm ati等[5]发现CD133+细胞表达的表面标记物(nestin,musash-i 1)以及增殖/自我更新基因(CD133、Sox2、m elk、PSP、bm-i1)和正常脑神经干细胞表达的相同,而且CD133+细胞在体外可以被诱导分化成神经元和星形细胞,而接种到小鼠脑内后可分化成神经元和胶质细胞。

近年,陆续有报道称在胶质瘤细胞系C6[6]、前列腺癌[7]、视网膜母细胞瘤[8]和胰腺癌[9]中也找到相关的TSC。

二、TSC与肿瘤耐药
(一)肿瘤耐药的机制导致肿瘤治疗失败的原因很多,多药耐药性(m ulti d rug resi s tance,MDR)是主要原因之一。

MDR是指肿瘤细胞对一种药物产生耐药性的同时,对其它结构和作用不同的抗肿瘤药也产生交叉耐药性。

MDR的形成机制很复杂,既与细胞膜上的多药耐药性相关蛋白(MRP)、P-糖蛋白(P-gp)、肺多药耐药性相关蛋白(LRP)、乳癌耐药性相关蛋白(BCRP)等膜蛋白有关,同时也与细胞质内的DNA拓扑异构酶(Topo)、蛋白激酶C (P KC)、谷胱甘肽(GS H)和谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、醛脱氢酶(AL-DH)等有关。

在治疗方面已研发出相关药物,例如:喜树碱类药和阿霉素抑制DNA拓扑异构酶;十字孢碱特异性抑制PKC;利尿酸抑制GST增加肿瘤耐药性细胞对烷化剂的敏感性。

从疗效看,这些抗癌药物的作用是有限的,因为一部分病人存在肿瘤复发现象,原因主要是因为恶性肿瘤细胞本身有一定抗药性,同时可能也与未及时有效杀死TSC有关[1]。

(二)TSC的耐药机制
1.表达ABC转运蛋白:ABC转运蛋白是一类跨膜蛋白,可转运一系列底物,包括:代谢物、药物霉素、内源性脂质、肽类、核苷酸和甾醇等。

研究较多的ABC转运蛋白主要有ABCB1(MDR1),编码P-gp;ABCC1(MRP1),编码MRP;ABCG2(BCRP/ MXR/ABCP),编码BCRP。

这些转运蛋白是亲水性和疏水性化合物的混合转运载体,利用ATP水解提供的能量主动把药物由细胞内泵出细胞外,避免药物的细胞毒作用。

ABC转运蛋白在体内广泛分布。

ABCB1除在一些器官组织,如:肝、肾、胃肠道、血-脑/血-睾屏障有分布外,在一些培养的造血干细胞、间质干细胞、胰腺干细胞、侧群细胞(side popu lati o n,SP)及人类胎儿干细胞/祖细胞(h NSPCs)中都有表达,而且ABCB1可以作为hNSPC s的标记物。

Isla m等[10]研究hNSPCs的ABCB1表达发现,当使用竞争性或非竞争性的ABCB1底物抑制剂以及促ATP水解或抑制ATP结合的化合物时,都能提高Rh123在hNSPCs 的蓄积程度,表明ABCB1转运蛋白是hNSPCs产生耐药性的因素之一。

ABCG2是被最晚发现的ABC转运蛋白。

AB-CG2作为一个具有广泛底物作用的特异性外排泵,可识别带正负电荷的分子、有机离子和硫酸盐络合
物。

主要存在于干细胞,某些肿瘤细胞和上皮细胞的顶膜。

表达ABCG2是鼠类干细胞的保守特性。

在原始的H SC中,ABC G2的mRNA呈高水平表达,细胞分化时表达水平下降。

ABCG2也是SP主要的ABC转运蛋白,且ABCG2在不同来源的SP中均呈高表达,其功能被认为是参与肿瘤细胞的多药耐药性。

Zhou等(2001)的ABCG2/BCRP1基因转染研究,证实ABCG2/BCRP1是SP转运H oechst染料所必需的。

而U ch i d a等[11]以M DR1+/BCRP1-基因敲除小鼠为模型,用流式细胞术分析细胞对H oechst 33342和Rh123的泵出情况,结果显示SP数量显著减少甚至缺失,推测ABCG2/BCRP1可能是SP的主要表型特征。

目前有关ABCG2在干细胞分化和耐药性中的作用仍处于研究中。

此外,有研究表明LSC优先表达BCRP。

Raai-j m akers等[12]将KO143作用于LSC,结果KO143特异性抑制BCRP,给予盐酸米托蒽醌后LSC内盐酸米托蒽醌含量增加。

进一步实验发现LSC内盐酸米托蒽醌增加的量低于耐盐酸米托蒽醌的乳腺癌细胞系M CF7-MR,表明LSC不仅表达BCRP,而且同时还表达其它ABC转运蛋白。

2.抗凋亡基因高水平表达:Bc1-2属于一类新的癌基因家族,根据其结构和功能的不同分为三个亚家族:(1)抗凋亡蛋白亚家族(亚家族1),包括Bc1-2、B c1-xl、Bc1-w、M c1-1、A1(BF1-1);(2)含多区域的促凋亡蛋白亚家族(亚家族2),包括Bax、Bak、M td(Bok);(3)仅含B H3区域的促凋亡蛋白亚家族(亚家族3),包括B ik(N bk)、B id、Bad、B i m(Bod)、H r k等。

Bc-l2在AM L细胞的CD34+和CD34-亚群中都有表达,但CD34+亚群的抗凋亡能力明显高于CD34-亚群。

经蛋白免疫印迹技术分析发现, CD34+亚群表达高水平的抗凋亡基因bc-l2、bc-l x l、m c-l1和P-gp而表达低水平的凋亡基因bax(Am ber 等.2003)。

这种现象也部分解释了为什么临床上CD34+AML病人更容易对传统抗肿瘤药物产生耐受性。

除高水平表达Bc-l2外,TSC的耐药性也和其它抗凋亡基因的持续高表达有关。

Jordan等(2000)比较H SC和LSC基因增殖表达时发现LSC的肿瘤抑制物干扰素调节因子1(I R F-1)和死亡相关蛋白激酶(death-associated protein kinase,DAPK)呈持续高表达状态。

深入研究I RF-1的上游转录调节因子的表达水平,发现I R F-1的激活物NF-J B处于高表达水平,而在其它正常细胞内却未被激活。

说明NF-J B是LSC的一个关键的存活基因,其持续高表达使LSC具有更强的抗凋亡活性。

3.处于静止期:TSC如果处于G0期,不分裂,对作用于细胞周期或快速分化细胞的药物本身就有耐药性。

临床常用的肿瘤治疗药物5-氟尿嘧啶(5-Fu)主要针对处于细胞活跃周期的肿瘤细胞。

将预先用5-Fu处理过的LSC接种到SCI D小鼠上,经过一段时间饲养后SC I D小鼠出现AM L,说明处于G0期的LSC本身对5-Fu具有耐药性(Ter pstra等. 1996)。

体内功能测定结果显示约96%的LSC处于G0期,类似于H SC。

这项研究解释了为什么AML 对标准化疗方案有耐受性,因为标准化疗方案只对循环池中的成熟细胞有杀伤作用,而处于G0期的LSC因为不分裂,不能被药物完全杀死而残留下来,一旦受到适当刺激重新进入细胞分裂周期将继续增殖分化出新的肿瘤细胞,造成肿瘤复发。

其它治疗药物,如治疗白血病的药物伊马替尼在体外可以阻断G1/S期的BCR-ABL阳性细胞,但诱导细胞凋亡的作用并不明显。

TSC处于G
期也使其对化疗药物的敏感性与其它肿瘤细胞有差异,研究显示LSC 对柔红霉素的敏感性远低于白血病细胞;对阿糖胞苷也具有耐受性(Costell等.2000,Jordan等. 2000)。

TSC对一些化疗药物的低敏感性使其能在药物治疗后存留下来,造成肿瘤复发和转移。

4.具有自我更新能力:TSC另一个重要的特性就是保持自我更新能力。

TSC的自我更新机制可能是促进肿瘤发展和转移的关键因素之一。

Bm-i1是干细胞的一个自我更新基因,属po lyco m b家族成员,对维持H SC的自我更新和多向分化具有重要作用,同时也参与肿瘤的发生。

B m-i1也是LSC自我更新必需的基因。

Lessard等[13]将癌基因(M eisla, H oxa9)导入正常小鼠和B m-i1基因敲除小鼠的胎肝细胞内构建成两组白血病模型。

经射线照射,正常组小鼠和基因敲除组小鼠均形成白血病。

将这些白血病小鼠的骨髓移植到另两组白血病模型中,正常组小鼠仍可形成白血病,而在基因敲除组小鼠血液中仅存在少量白血病细胞甚至没有,表明B m-i1缺失使LSC的增殖能力受限,无法诱导白血病形成。

TSC中Bm-i1基因的存在保证了TSC的DNA受损伤后仍能进行自我修复,保持稳定的生物学性状。

除上述机制外,TSC可能还存在其它耐药机制。

像H SC的一些基因在早期定型的祖细胞水平上并不表达,TSC可能也存在正常干细胞靶点表达缺失的现象,使其能够逃脱某些药物的作用。

此外,干细
胞由于长时间接触辐射或致癌物质,随时间推移会逐渐产生变异,TSC可能也存在此机制,通过此机制把耐药性传给子代细胞[1]。

一个典型的例证就是在人类白血病细胞和淋巴癌细胞中ABCB1突变,在细胞膜呈高表达(Knutsen等.1998)。

三、针对TSC的治疗措施
TSC的耐药性使肿瘤的治疗面临巨大挑战和困难。

针对TSC生物学特性,研究者开展了一些治疗方法的研究和尝试。

(一)采用ABC转运蛋白抑制剂治疗此类抑制剂如ABCB1抑制剂维拉帕米、环孢霉素A、PSC 833和VX-710,但治疗效果不很理想。

然而,相关的研究表明ABC转运蛋白是可以被抑制的。

GF120918是从烟色曲霉素获得的真菌霉素,不仅可有效的抑制P-gp也可抑制ABCG2。

而fum itre m or-gin C(FTC)有效逆转过表达ABCG2细胞的耐药性,并与细胞内药物蓄积量呈正相关,对P-gp和ABCC1同样有抑制作用,但FTC存在神经毒作用。

在FTC 基础上开发出的衍生物Ko143可以增加某些药物的肠道吸收,提高小鼠肿瘤细胞对药物的敏感性,且以高剂量口服或腹腔注射给予小鼠没有明显的毒性作用。

其它一些治疗方法,如用锤头核酶,5D3抗AB-CG2单克隆抗体或RNA干扰来调节ABCG2的功能,在临床治疗中也取得较好效果[14]。

(二)采用细胞因子治疗目前已有针对TSC 进行肿瘤治疗的研究。

MG132是一种蛋白酶抑制剂。

Guz m an等[15]将MG132和蒽环类抗生素去甲柔红霉素合用治疗AM L,体内体外实验均表明MG132和去甲柔红霉素具有协同作用,能迅速而广泛地诱导LSC凋亡而对正常的H SC没有影响,其机制可能是MG132阻止NF-J B负性调节蛋白I K B降解,结果诱导NF-J B下调,导致LSC大面积凋亡。

此外,部分p53基因和p53介导的基因表达上调也在一定程度上参与LSC的凋亡过程。

(三)白喉毒素/粒细胞集落刺激因子(GM-CSF)辅助化疗传统的抗肿瘤方案大部分是针对循环池细胞,对处于G0期的TSC效果不明显。

目前正在开发免疫毒素(i m m unotox i n s)药物对TSC有较好的靶向性,GM-CSF就是其中一种。

粒细胞集落刺激因子是一种多肽链的细胞生长因子,可特异地调节粒细胞的增殖与分化,并能增强成熟粒细胞的功能,对机体应激防御系统有重要意义。

NOD/SC I D 小鼠经过GM-CSF治疗后,骨髓白血病肿块较阳性对照组明显缩小,推测与LSC表达GM-CSF受体有关系[16]。

因为目前尚未从纯化的LSC中检测到G M-CSF受体的表达,有关GM-CSF的作用机制还有待进一步研究,但这为研究人员开发针对处于G0期TSC的药物提供了新思路。

另外,A ltundag等[17]在治疗乳腺癌中发现粒细胞集落刺激因子除了刺激H SC外,还协同刺激乳腺癌干细胞,促使干细胞进入细胞周期,提高TSC对肿瘤药物的敏感。

采用细胞因子进行辅助化疗在临床治疗上有重要意义,随着研究的深入,采用化疗药物和细胞因子合用的治疗将为肿瘤患者带来希望。

(四)免疫诱导用干细胞抗原诱导机体细胞免疫,杀伤带有干细胞抗原的肿瘤细胞。

前列腺干细胞抗原(prostate ste m cell anti g en,PSCA)是前列腺细胞特有的,从正常前列腺、前列腺上皮内瘤直至发展到激素依赖及非依赖的前列腺癌,PSCA的表达呈递增趋势且表达程度与肿瘤的进展相关[18]。

以异种移植人前列腺癌小鼠为模型,以单克隆抗体(mAb)1G8(I gG1J)和3C5(I gG2a J)治疗,结果,小鼠的存活时间明显延长(Saffran等.2001),而且mAb与细胞有丝分裂抑制剂美登醇(m ay tansi n o id)联合应用,在体内体外实验中也均表现出显著效果,不仅可有效抑制PSCA+前列腺癌细胞的迁移性生长,对已形成的PSC A+前列腺癌也具有明显的杀伤作用[19]。

(五)采用药物靶向制剂治疗这种方案是将药物用纳米材料包裹或与具有靶向性的材料以共价键结合,其优势在于能够有效提高治疗靶点的药物浓度,减少非特异性和副作用,同时又可避免药物间的相互作用。

阿霉素和聚羟丙酯甲基丙胺(H P MA)的聚合物能在一些药物外排泵周围聚集,就是这种高分子药物结合物潜在优势的证明(M i n ko.1998)。

另外,TSC的特异性表面标记物也是该方案的研究热点。

一个典型的例证是乳腺癌干细胞上的CD44受体。

该受体在大部分的TSC都有存在,而透明质酸是其天然配体,研究表明结合透明质酸的化疗药物对表达CD44受体的肿瘤细胞具有明显的靶向性。

但是以靶向制剂治疗TSC目前还面临许多困难:暂时还缺乏合适有效的实验模型来证明其对TSC同样有效;并不是所有表达ABC转运蛋白的细胞都是TSC,也不是所有的TSC表达相同的ABC转运蛋白;TSC也并不是高度特异性表达相关受体,如CD44;机体本身的复杂性,如对透明质酸的降解,也限制了药物靶向制剂的应用[20]。

临床上应用维甲酸治疗急性早幼粒细胞白血病
取得显著疗效,因此采用维甲酸先诱导TSC分化再进行后续治疗也是一个可行的治疗尝试(Se ll等. 2004)。

除此之外,通过比较TSC和正常干细胞基因表达的差异,鉴定出TSC关键的生长基因,将是肿瘤靶向基因治疗的革命性转折。

四、TSC研究存在的问题及发展趋势
TSC理论为人们理解肿瘤的发生、发展、转移、耐药性产生和复发等问题提供了一个新的视角,以LSC为靶点的白血病治疗已经取得了很好的临床疗效,在实体肿瘤方面也进行了有益的尝试,为肿瘤患者带来了希望。

但由于TSC自我更新能力、DNA修复能力、抗凋亡及ABC转运蛋白的广泛表达等因素的存在,因此针对TSC的治疗与实际临床应用尚有距离。

另外,TSC研究还面临着一些急需解决的问题:TSC是否是肿瘤组织中普遍存在的现象,还仅仅是个别现象;TSC来源于何种干细胞,其致肿瘤发病机制是什么;TSC的细胞表面标记物应该如何特异性标识以更好地分离和鉴定;TSC与正常干细胞的生长基因和信号转导途径有何差别,怎样才能保证药物能特异性杀死TSC而不影响其它正常干细胞。

TSC理论解释了一些肿瘤研究中碰到的问题,但人们现在还远未完全认识TSC,对TSC的认识需要边研究边重新定义。

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