菠萝蛋白酶提取、分离纯化及稳定性研究

４
关于学位论文原创性和使用授权的声明
本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进行科学研究所 取得的成果。对在论文研究期间给予指导、帮助和做出重要贡献的个 人或集体，均在文中明确说明。本声明的法律责任由本人承担。
本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的规定，同 意学校保留和按要求向国家有关部门或机构送交论文纸质本和电子 版，允许论文被查阅和借阅。本人授权山东农业大学可以将本学位论 文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印 或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文，同时授权中国科学技术 信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并向 社会公众提供信息服务。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
２·Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎａｎｏ－Ｔｉ０２ ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ
Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ
ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｏｆ Ｎａｎｏ－Ｔｉ０２ ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ Ｗａｓ ｒｅｓｅａｒｃｈｅｄ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｓｉｎｇｌｅ
ｆａｃｔｏｒ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ．Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ｎａｎｏ．ＴｉＯ，
山东农业大学 硕士学位论文 菠萝蛋白酶提取、分离纯化及稳定性研究 姓名：马超 申请学位级别：硕士 专业：食品科学 指导教师：乔旭光;吴茂玉
20090615
山东农业大学硕士论文
摘要
本研究测定并比较了菠萝果、皮、茎中蛋白酶活性及蛋白质含量，得 到同一品种及成熟度的菠萝果、茎及皮中的酶活差距较大，菠萝茎中酶活 性最高，果肉中次之，皮中最低。以菠萝茎为原料，比较了高岭土吸附法， 超滤浓缩有机溶剂沉淀法及纳米二氧化钛吸附法对茎菠萝蛋白酶纯化效 果的影响。对纳米二氧化钛吸附法制备的茎菠萝蛋白酶采用离子交换层析 法进一步纯化，并进行稳定性研究。主要结果和结论如下：
ｃｏｍｐｌｅｘ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，ｃｏｎｓｕｍｐｔｉｖｅ，ｅｘｃｅｓｓｉｖｅ ｅｑｕｉｐｍｅｎｔｓ，ａｎｄ ｌｏｗ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｒａｔｅ；Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ ａｎｄ ｏｒｇａｎｉｃ ｓｏｌｖｅｎｔ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｃｏｕｌｄ ｎｏｔ ｒｅｍｏｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｓｉｍｉｌａｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｗｉｔｈ ｂｒｏｍｅｌａｉｎ；Ｈｏｗｅ ＿。ｖｅｒ，ｎａｎｏ·－Ｔｉ０２ ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ ｗａｓ ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｗｉｔｈ ｓｉｍｐｌｅ， ｌｅｓｓ—ｃｏｎｓｕｍｐｔｉｖｅ，ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｅｄ．
保密论文在解密后应遵守此规定。
论文作者签名：
导师签
日
期：
山东农业大学硕士论文
１引言
菠萝蛋白酶（Ｂｒｏｍｅｌａｉｎ），别名菠萝酶，是存在于菠萝（Ａｎａｎａ ＣＯｍＯＳｌ２Ｓ） 植株中的蛋白质水解酶，为浅黄色无定形粉末，微有异臭。菠萝的果、茎、 柄和叶片中都含有菠萝蛋白酶。一般从菠萝果中提取的称为果菠萝蛋白 酶，从菠萝皮、茎中提取的为茎菠萝蛋白酶。八成熟的菠萝果汁含有约 ０．４％的菠萝蛋白酶，成熟的菠萝果汁含有Ｏ．３％左右的菠萝蛋白酶，茎汁 含８．７％的菠萝蛋白酶（Ｍｕｒａｃｈｉ，ｅｔ ａ１．，１９６４）。１９８１年，Ｍａｒｃａｎｏ首先发现 菠萝汁中含有蛋白水解酶，随后Ｗｉｌｌｓｔａｔｔｅｒ，Ｂｅｒｇｍａｎｎ和Ｍａｒｔｉｎ相继指出， 菠萝蛋白酶存在于果、皮和茎部中，存在于茎部的称为茎酶（Ｓｔｅｍ ｂｒｏｍｅｌａｉｎ Ｅ．Ｃ．３．４．２２．４），存在于果汁中的酶称为果酶（Ｆｒｕｉｔ ｂｒｏｍｅｌａｉｎ Ｅ．Ｃ．３．４．２２．５）。Ｍｕｒａｃｈｉ和Ｎｅｕｒａｔｈ、Ｅ１．Ｇ ｈａｒｂａｗｉ和Ｗｈｉｔａｋｅｒ采取层析法 分离提取了菠萝蛋白酶并研究了它的活性成分。 １．１植物蛋白酶研究进展
ｌｉｇｈｔ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．Ｔｈｅ ｂｒｏｍｅｌａｉｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ（Ｓ）ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｗｉｔｈ ｔｈｅ
ｉｎｃｒｅａｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔｏｒａｇｅ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，ａｎｄ ｔｈｅ ｌｉｎｅａｒ ｅｑｕａｔｉｏｎ ｗａｓ Ｓ ２ １１９。５．１。４１１１，ｂｕｔ ｉｔ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｒａｐｉｄｌｙ ａｂｏｖｅ ７０℃：Ａｎｄ ｔｈｅ ｂｍｍｅｌａｉｎ’ｓ
ｏｆ ｓｔｅｍ ｂｒｏｍｅｌａｉｎ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｂｙ ｎａｎｏ—Ｚｉ０２ ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ ｗａｓ ｄｅｔｅｎｎｉｎｅｄ．ａｎｄ
ｆｕｒｔｈｅｒ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｂｙ ｉｏｎ—ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．Ｐｒｉｍａｒｉｌｙ ｒｅｓｕｌｔｓ ｗｅｒｅ ａｓ ｆｏｌｌｏｗｓ：
３．离子交换层析进一步分离纯化 用离子交换层析法对纳米二氧化 钛吸附法所得蛋白酶进一步纯化。采用美国伯乐公司离子交换树脂 １ ５８．００３０，以ｐＨ６．０的０．０１ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ－磷酸盐溶液为初始缓冲液，’以０．１～１．５ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ溶液进行线瞄扰脱，得到蛋白酶比活力６．４ｘ １ ０３ Ｕ／ｍｇ．Ｐｒ，纯化倍数提高到 １３．７３倍。
2单宁沉淀法工艺流程菠萝下脚料压榨一汁液去杂质一澄清液加稳定剂啼稳定液加单宁一单宁沉淀物洗脱一滤液干燥一酶制品3超滤浓缩法工艺流程菠萝下脚料压榨一汁液去杂质一澄清液超滤浓缩一浓缩液降温加沉淀剂沉淀一湿酶减压干燥一酶制品山东农业大学硕士论文以上方法中高岭土吸附法所得产品酶活较高但生产工艺和操作都比较复杂所需设备多原材料消耗也多酶活回收率低污染环境环保投资大
１．不同方法纯化效果比较 高岭土吸附法所得菠萝蛋白酶回收率为 ６４．３％，纯化倍数２．６３倍；超滤浓缩有机溶剂沉淀法所得酶回收率７８．４％， 纯化倍数１．３４倍：纳米二氧化钛吸附法所得酶回收率６４．７％，纯化倍数达 ５．２９倍。通过三种工艺及纯化效果比较得：高岭土吸附法生产工艺和操作 较复杂，原材料消耗多，所需设备也多，纯化倍数不高；超滤浓缩有机溶 剂沉淀法截留液中与菠萝蛋白酶分子量相近的杂蛋白无法除去，导致所得 酶制品比活力较低。而纳米二氧化钛吸附生产工艺和操作简单，原材料消 耗少，并能减少与菠萝蛋白酶分子量相近杂蛋白对后续超滤步骤的影响， 纯化效果优于前两种方法。
１·Ｔｈｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｍｏｎｇ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄｓ Ａ ２．６３ ｆｏｌｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ６４＿３％ｔｒｅａｔｅｄ ｂｖ Ｋａｄｉｌｌ
ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ，ａｎｄ ｔｈｏｓｅ ｂｙ ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ ａｎｄ ｎａｎｏ．Ｔｉ０２ ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ ｗｅｒｅ １．３４ ｆｏｌｄ，７８．４％ａｎｄ ５．２９ ｆｏｌｄ，６４．７％；ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｅｆｆｅｃｔ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ：ｋａｏｌｉｎ ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ ｈａｄ ｄｉｓａｄｖａｎｔａｇｅｓ ｏｆ
（Ｓ）明显下降，呈线性关系，Ｓ＝１１９．５．１．４１１Ｔ。菠萝蛋白酶在７０℃以下 加热活力下降幅度较小，超过７０℃，酶活力急剧下降；由半胱氨酸
（Ｏ．００５％）、ＥＤＴＡ（Ｏ．０５％）组或的复合稳定剂可使菠萝蛋白酶半衰期达 ２４０天。
关键词：菠萝蛋白酶；纳米Ｔｉ０２：超滤；纯化
２
ＡＢＳＴＲＡＣＴ
Ｔｈｉｓ ａｒｔｉｃｌｅ ｗａｓ ｃａｒｒｉｅｄ ｏｕｔ ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｉｏｎ－ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＢＩＯ－ＲＡＤ’Ｓ １ ５ ８·００３ ０ ｉｏｎ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｒｅｓｉｎ）． Ｕｓｍｇ ｔｒｉｓ—ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ ｏｆ ０．Ｏｌｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ６．０）ａｓ ｔｈｅ ｉｎｉｔｉａｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎ，ａｎｄ ｉｔ
ｗａｓ ｌｉｎｅａｒ ｅｌｕｔｅｄ ｂｙ ０。１～１．５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎ，ｔｈｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｃｏｕｌｄ ｒｅａｃｈ ｔｏ ６．４ｘ １０３ Ｕ／ｍｇ．Ｐｒｏ，ｗｉｔｈ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｒａｔｅ １３．７３ ｆｏｌｄ． ４．Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｏｎ ｔｈｅ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｂｒｏｍｅｌａｉｎ Ｔｈｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｓｔｅｍ ｂｒｏｍｅｌａｉｎ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｔｈａｔ ｂｒｏｍｅｌａｉｎ Ｗａｓ ｓｔａｂｌｅ ａｔ ｐＨ５．０－６．５，ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙ ａｔ ｐＨ６．０； Ｌｉｇｈｔ ｗａｓ ｒｅｍａｒｋａｂｌｅ ｔｏ ｔｈｅ ｓｔａｂｌｅ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｉｎ ｔｈｅ ｓｔｏｒｉｎｇ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ ｉｔ．Ｔｈｅ ｂｒｏｍｅｌａｉｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｕｎｄｅｒ ｄａｒｋ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｗａｓ １ ３．１％ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｉｎ ｎａｔｕｒａｌ
ａｃｉｄ ｂｕｆｆｅｒ ｏｆ ０．４ｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ６．０）．Ｔｈｅ ｅｌｕａｔｅ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｂｙ ｔｗｏ ２ｒａｄｅ ｏｆ ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ４０ＫＤ ａｎｄ ２０ＫＤ ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｍｅｍｂｒａｎｅ．ｗｉｔｌｌ ｔ１１ｅ
ｐｒｅｓｓｕｒｅ ２．５ｘ１０Ｓ－３．０ｘ１０５Ｐａ，ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆｐｒｏｔｅａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗａｓ ６４．７％．
菠萝蛋白酶提取、分离纯化及稳定性研究
４．菠萝蛋白酶稳定性研究对纳米二氧化钛吸附法得菠萝蛋白酶进 行保存稳定性实验，结果表明：菠萝蛋白酶在ｐＨ５．０～６．５时，酶活力较稳 定，ｐＨ６．０时酶活力稳定性最好；菠萝蛋白酶在贮存过程中光对其稳定性 的影响显著，室温贮存１０天后，避光条件下酶活力保留率比室内自然光 照条件下高１３．１％；随着贮存温度（Ｔ）的升高，菠萝蛋白酶活力保留率
ａｍｏｕｎｔ，ｐＨ，ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，ａｎｄ ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｗｅｒｅ ３．５％，４．７，１ ５℃，２５ｍｉｎ
ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，ｔｈｅ ｂｒｏｍｅｌａｉｎ ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｗａｓ ９８．２％，ａｎｄ ｔｈｅ ｂｒｏｍｅｌａｉｎ ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ｗａｓ ７９．３％，ｅｌｕｔｅｄ ３０ｍｉｎ ｕｓｉｎｇ ｃｉｔｒｉｃ
ｈａｌｆ－ｌｉｆｅ ｗａｓ ｅｘｔｅｎｄｅｄ ｔｏ ２４０ ｄａｙｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｃｏｍｐｏｓｉｔｅｓ（ｃｙｓｔｅｉｎｅ， Ｏ．００５％；ＥＤＴＡ，Ｏ．０５％）
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｂｒｏｍｅｌａｉｎ；Ｎａｎｏ－Ｚｉ０２；Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ；Ｐｕｆｆｆｉｃａｔｉｏｎ
２．纳米二氧化钛吸附法工艺优化 在纳米二氧化钛吸附工艺优化过 程中，以纳米二氧化钛用量，ｐＨ，温度，吸附时间等为因素，在单因素 实验的基础上进行正交试验，得到纳米二氧化钛的最佳吸附条件为：纳米 Ｔｉ０２用量为吸附液的３．５％，吸附液ｐＨ为４．７，吸附温度１５℃，吸附时 间２５ｒａｉｎ，酶吸附率达９８．２％。采用ｐＨ６．０，０．４ｍｏｌ／Ｌ的柠檬酸缓冲液作 为洗脱液洗脱３０ｍｉｎ，酶回收率达７９．３％。对洗脱液进行超滤，利用４０ＫＤ 和２０ＫＤ的超滤膜两级截留超滤可有效的浓缩菠萝蛋白酶，去除杂蛋白， 操作过程中，压力差保持在２．５ｘ１０５～３ｘ１０５ Ｐａ，酶回收率６４．７％，纯化倍 数５．２９倍。
ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｐｉｎｅａｐｐｌｅ ｐｕｌｐ，ｓｋｉｎ，ａｎｄ ｓｔｅｍ．Ｐｉｎｅａｐｐｌｅ ｓｔｅｍ ｈａｄ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｔｈａｎ ｐｕｌｐ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｋｉｎ ｉｎ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｓａｍｐｌｅ． Ｋａｏｌｉｎ ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ． ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ ａｎｄ ｏｒｇａｎｉｃ ｓｏｌｖｅｎｔ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｎａｎｏ．Ｔｉ０２ ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔｅｍ ｂｒｏｍｅｌａｉｎ．Ｔｈｅ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ
３·Ｆｕｒｔｈｅｒ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ Ｉｏｎ．ｅｘｃｈａｎｇｅ ｅｈｒｏｍａｔｏｇｒａ 。ｐｈｙ Ｆｕｒｔｈｅｒ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｒｏｍｅｌａｉｎ ｗａｓ ｏｐｅｒａｔｅｄ ｂｙ
１
菠萝蛋白酶提取、分离纯化及稳定性研究