蛋白质组双向电泳原理及实验步骤ppt课件.ppt

中国历史上吸烟的历史和现状、所采 取的措 施以及 由此带 来的痛 苦和灾 难，可 以进一 步了解 吸烟对 人民健 康的危 害，提 高师生 的控烟 意识
• 最高电压10,000 V • 10–25C 温度控制 • 7, 11, 17, 18, 和 24 cm的聚
焦盘，可以各放12根胶条 • 可以储存10个程序，每个程序有
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实验操 作
Method
原理
Theory
应用
Application
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二维SDS-PAGE
• 同普通SDS-PAGE类似。
• 但一般在垂直电泳系统中无需浓缩胶，因 为在IPG胶条中蛋白质区域已得到浓缩， 可以认为非限制性IEF胶（低浓度丙烯酰胺 胶）充当了浓缩胶。
l 设置等电聚焦时的温度。（17℃）
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配制SDS-PAGE凝胶
配制12%的丙烯酰胺凝胶，直接用双向电 泳专用梳子；或在上部留0.5cm的空间， 用MilliQ水、乙醇或水饱和正丁醇封胶。 聚合30分钟。
第
一
向
：
+
等
pH 3
电
聚
焦
pH 7.5
–
pH 10
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第
+
二
pH 3
向：
SDS-
PAGE
电
泳
pH 7.5
charge
–
pH10
size
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双向电泳样品的溶解
• 是成功进行双向电泳的最关键因素之一 • 溶解的目标：
– 样品中非共价结合的蛋白质复合物和聚积体完全 破坏，从而形成各个多肽的溶解液；
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SDS-PAGE电泳
在低熔点琼脂糖封胶液完全凝固后。将凝胶转移至电 泳槽中。
在电泳槽加入电泳缓冲液后，接通电源，起始时用的 低电流（5mA/gel/7cm），待样品在完全走出IPG胶条， 浓缩成一条线后，再加大电流（15-20mA/gel/7cm）， 待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。
配制胶条平衡缓冲液 I 。
吸去胶条上的矿物油及多余的样品。
第一次平衡。振荡15分钟。
配制胶条平衡缓冲液 II 。
第二次平衡 ，振荡15分钟。
吸去玻璃板中液体。将玻璃板倒扣在桌面上。
琼脂糖封胶液进行加热溶解。配制1×电泳缓冲液。
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– 必须允许可能干扰2-DE分离的盐、脂类、多糖和 核酸等物质的去除；
– 保证样品在电泳过程中保持溶解状态。
• 溶解的手段：
离液剂、去垢剂、还原剂、两性载体电解质
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聚焦时间的优化
• 要获得高质量的图谱以及很好的试验重复性，所需的最佳 时间即为等电聚焦达到稳定态所需的时间。
• 聚焦最佳时间由不同蛋白样品、上样量、pH范围和胶条长 度通过经验来确定。
• 聚焦时间太短，会导致水平和垂直条纹的出现。 • 过度聚焦虽然不会导致蛋白质向阴极漂移，但会因为活性
水转运而导致过多水在IPG胶表面渗出（电渗）而造成蛋 白图谱变性，在胶条碱性端产生水平条纹以及蛋白丢失。
等 电 聚 焦 程 序 的 设 置
7cm胶条
水化
12小时（17℃） 被动水化
S1
250V 慢速 30分钟
除盐
S2
1000V 快速 60分钟
除盐
S3
4000V 线性 3小时
升压
S4
4000V 快速 24,000伏小时 聚焦
~28,000伏小时
S5
500V 快速 任意时间
保持
l 选择所放置的胶条数。
l 设置每根胶条的极限电流。（30-50A/根）
10步 • 程序可进行时时编辑 • 可供选配的打印机
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等电聚焦的 操作
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操作
Method
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Broad Range Separations
pH 3 - 10 pH 3-10
pH 3 - 6
pH 5 - 8
pH 7 - 10
pH 3- 6
pH 5- 8
pH 7-10
More Data with Narrow Range IEF
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待凝胶凝固后，拔去梳子，用MilliQ水冲 洗；或倒去分离胶表面的乙醇或水饱和正 丁醇，用MilliQ水冲洗，备用。
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胶条的平衡
冰箱中取出的胶条，于室温放置10分钟。
• 水洗3次，5min/ 次。
• Bio-Safe染色1小 时。
• 水洗30min.
Bio-Safe染 色法
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图像扫描及 软件分析
Molecular mass (kD)
保证待研究蛋白的可检测性。
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不同样品的基本处理方法
可溶性样品 固体组织样品
细胞
样品的分级处理
通过采用亚细胞分级、液相电泳和选择性沉淀 等方法对蛋白质样品进行分级处理，可降低样 品的复杂性并富集低丰度蛋白质。当前最简单 有效的处理是采用分级抽提，按样品溶解度不 同进行分离。
胶条的转移
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样品制备基本原则：
• 使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态，制 备方法应具有可重现性。
• 防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。 • 防止样品制备过程中发生样品抽提后的化学修饰。 • 完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。 • 尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而
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电泳结束后，轻轻撬开两层玻璃，取出凝胶，并切角 以史上吸烟的历史和现状、所采 取的措 施以及 由此带 来的痛 苦和灾 难，可 以进一 步了解 吸烟对 人民健 康的危 害，提 高师生 的控烟 意识
凝胶染色
• 考马斯亮兰染色 • Bio-Safe染色
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• 蛋白质组（Proteome）：
在一种细胞内存在的全部蛋白质。
• 蛋白质组研究中主要应用的技术包括：
双向电泳(2-DE)、 新型质谱(MS)技术、 数据库设置与检索系统等。
双向电泳实验流程
➢ 样品制备（Sample preparation） ➢ 固相预制胶条的水化（IPG strip rehydration） ➢ 第一向等电聚焦（IEF） ➢ 胶条的平衡（IPG strip equilibration） ➢ 第二向SDS-PAGE电泳（SDS-PAGE electrophresis） ➢ 凝胶的染色及检测（Detection/Staining） ➢ PDQuest软件分析（Software analysis） ➢ 质谱鉴定（Protein identification）
双向电泳实验流程
➢ 样品制备（Sample preparation） ➢ 固相预制胶条的水化（IPG strip rehydration） ➢ 第一向等电聚焦（IEF） ➢ 胶条的平衡（IPG strip equilibration） ➢ 第二向SDS-PAGE电泳（SDS-PAGE electrophresis） ➢ 凝胶的染色及检测（Detection/Staining） ➢ PDQuest软件分析（Software analysis） ➢ 质谱鉴定（Protein identification）
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两维间的平衡
• 等电聚焦电泳结束后可马上进行第二向电 泳，也可于－80°保存数月。
• 但在第二向电泳前一定要进行胶条的平衡， 以便于被分离的蛋白质与SDS完整结合， 从而使SDS-PAGE电泳能顺利进行。