茯苓质量评价余生兰

第六章茯苓质量评价第一节概述近年来，中药以其独特而显著的疗效越来越受到世界各国的青睐和重视⑴，但是由于中药材所含化学成分的复杂性、技术条件、研究思路和方法等因素的局限②，使得中药质量评价成为制约中药现代化与产业化的主要障碍［3］。

为了保证中药在临床上用药安全、合理、有效，我们必须将中药质量的评价在中药研究、生产及临床应运过程中贯彻和落实。

茯苓来源于多孔菌科Poria cocos （schw.）W的干燥菌核，又名茯兔、茯灵、松薯、松苓等，首次记载于《神农本草经》，并列为上品。

茯苓味甘、淡、性平；归心、肺、脾、肾经；具有利水渗湿、健脾安神等疗效。

在临床常用于水肿尿少、痰饮眩悸、脾虚食少、心神不安、便溏泄泻、惊悸失眠等病症的治疗。

现代医学研究发现茯苓具有抗肿瘤，镇静、免疫调节、利尿和保肝等方面的活性，已越来越引起人们的青睐和关注。

我国茯苓主产于湖北、安徽（习称“安苓”）、云南（习称“云苓”）等地。

长期以来，茯苓药材主要来自人工栽培。

不同产地、不同生长期的茯苓中各种化学成分的有很大差异，其药理作用也存在显著差别。

由于茯苓药材在中医临床及人民生活中有着广泛的应用价值，所以其质量评价的重要性不言而喻。

近年来，国内外的学者在其化学、药理及临床应用方面颇有成就。

茯苓的商品质量评价方面文献记载多采用基源鉴别、性状、显微鉴别、理化鉴别、薄层色谱鉴别、高效液相色谱等方法进行正伪品的鉴别并对其进行品质评定。

2015年《中国药典》记载了性状鉴别、理化鉴别、有效成分的定性鉴别及含量测定方法。

由此可见，茯苓的质量评价已广受人们的的关注和重视。

综上所述，本章节旨在对茯苓的质量标准规范化进行系统深入研究，以期保证茯苓用药安全、合理和有效。

第二节茯苓质量评价
药品质量标准是一种技术规定，主要针对药品的质量规格及其检测方法，是药品生产、使用、供应、检验和管理部门所必须共同遵守的法定依据，来确保用药安全有效。

而根据我国法定生药质量标准《中国药典》，其内容主要包括:名称、来源、性状、鉴别、检查、浸出物、含量测定、性味与归经、功能与主治、用法与用量、注意、贮藏等。

一、化学成分
1.多糖类
茯苓药材中茯苓多糖（Pachymose）为其主要活性成分，前人研究报道多糖含量占84.2%，其中硬肮占0.68%，纤维素含量为2.84%；另有报道，茯苓中B -茯苓聚糖（B -pachyman）为茯苓多糖中的主要成分，占干燥品93%⑷左右。

2.三萜类
到目前为止，中外学者从茯苓干燥菌核、茯苓皮或菌株培养液中分离共得到35中四环三菇化合物，可分为三种类型⑸：羊毛甾-7,9 （11）-二烯型三菇（lanosta-7,9-diene type triterpenes)、羊毛甾-8-烯型三萜(1290$=2-8-6底 type triterpenes)和 3,4-开环-羊
毛甾烷三萜烯型(3,4-$6。

0-1290$=29-7,9-心6底type triterpenes)。

除此之外，学者王
利亚等⑹研究发现，可以从茯苓乙醚萃取相中分离得到B -香树脂醇乙酸酯；李典鹏等研究发现，从云南茯苓皮中分离在经13C-NMR，1H-NMR,MS确认得到齐墩果酸⑺.
3.脂肪酸
中外学者从白茯苓中研究发现，白茯苓中含有的脂肪酸主要含有辛酸(caprylicacid)、十一酸(undecanoic acid)、月桂酸(lauric acid)、十二酸(dodecanoic acid)、棕榈酸(palmitic acid)⑻。

4.其它成分
学者郑虎占⑼研究发现，茯苓中除了含有多糖、三萜和脂肪酸类成分，还含有麦角甾醇，树胶，甲壳质，蛋白质，脂肪，甾醇，卵凝脂，右旋葡萄糖，腺嘌吟，组氨酸，胆碱，无机成分SiO2, Mg，P,Fe，Ca，S，Na，K，Mn，Cl，此外还含有［3 -茯苓聚糖酶，以及微量蛋白酶；江成萍等口0］通过茯苓多糖中微量及常量元素的分析，发现Ca，Mg，Co, Fe，Zn，P 等营养元素比其它保健品中高，同时还含有抗癌症对硒元素及人体必需微量元素Sr、Mn、Cr、Co、 Cu、V等，一些非必需的和重金属元素As、Pb、Cd，均未检出，医疗所用微量元素Al含量较高。

5、性状［11］
茯苓个：采挖于7月至8月间，药材除去泥沙后，经“发汗”摊开晾干至表面被干燥，“发汗”后的茯苓药材再经反复几次晾晒至表面出现皱缩,药材内部的湿气在背阴处干燥后，称作为“茯苓个”。

呈类球形、椭圆形、扁圆形或不规则团状，大小不一。

表皮薄且粗糙，呈棕褐色至黑褐色，有明显的皱缩纹理。

茯苓皮为菌核的外表皮；赤茯苓为近外表皮淡红色的部分；白茯苓为中间白色部分；茯神为中间抱有松根部分。

茯苓体重，质坚实，断面呈颗粒性，有的具有裂隙。

气微，味淡，嚼之黏牙。

茯苓块：呈立方块状或立方块状厚片，大小不一。

为去皮后切制的茯苓颜色多为为白色、淡棕色或淡红色。

茯苓片：呈不规则厚片，厚薄不一。

为去皮后切制的茯苓，颜色多为为白色、淡棕色或淡红色。

三、鉴别
1.理化鉴别
①药典［12］鉴别：常通过观察茯苓粉末灰白色，不规则颗粒状团块及分枝状团块，无色，遇水合氯醛液渐溶化。

菌丝无色或淡棕色，细长，稍弯曲，有分枝，直径38 |im，少数至16gm o
②药典［12］鉴别：取粉末1g，加丙酮10mL，水浴中边加热边振摇，加热10分钟，滤过。

滤液蒸干，残渣加1mL冰醋酸溶解，再加浓硫酸1滴，显淡红色，后变淡褐色。

③药典［12］鉴别：取本品片或粉末少许，加碘化钾碘试液1滴，显深红色。

④杨启德［13］报导通过采用茯苓中茯苓酸和麦角甾醇的李伯曼反应(冰醋酸-浓硫酸反应)来鉴别茯苓，结果发现反应液由淡红色变为暗绿色。

⑤阎文玫［14］通过测定茯苓中活性成分在200-320nm的紫外吸收情况，来对茯苓的正伪品进行鉴别。

2.薄层鉴别
①药典鉴别［12］：取本品粉末1g,加乙醚50mL,超声处理10分钟，放冷；过滤，挥干溶剂；残渣加甲醇1mL使溶解，作为供试品溶液。

另取茯苓对照药材1g同法制成对照药材溶液。

照薄层色谱法《中国药典》（2015年版四部通则0502）实验，吸取上述溶液各2］iL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（20:5:0.5）为展开剂，展开，取出，晾干，喷洒2%香草醛硫酸-乙醇溶液（4:1）混合溶液，在105c使显色完全。

供试溶液薄层色谱中，在与对照品溶液薄层色谱相应的位置上，显相同的紫红色斑点。

②肖培根等人［15］采用薄层色谱法，以0.5%CMC硅胶G板为吸附剂，石油醚-醋酸乙酯
（1:1）为展开剂，4%磷钼酸乙醇溶液100℃加热显色，以麦角甾醇、供谷甾醇为对照品来鉴别。

结果显示供试溶液在与对照品溶液薄层色谱相应的位置上，显相同的颜色斑点。

四、含量测定
1.茯苓多糖含量测定
①照分光光度法（《中国药典》2015年版四部通则0401）测定［a。

对照品溶液的制备
精密称取干燥至恒重的葡萄糖标准品10.00mg,置于100mL容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度线，即得0.1g/L的葡萄糖标准品溶液，放置于4℃条件下保存。

供试品溶液的制备
精密称取过60目筛的茯苓样品粉末1.0 g于具塞锥形瓶中，加
入50mL纯水，超声30min后用0.45 〃m微孔滤膜过滤，取续滤液10mL定容至50mL容量瓶，即得供试品溶液。

标准曲线的制备
分别精密移取葡萄糖标准品溶液0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL于10mL试管中，补加纯水至1mL,再加入5%苯酚溶液1mL,浓硫酸4mL,沸水浴25min,冰水浴15min。

取出后，补足减失体积，在490nm处测定其吸光度。

测定法
取茯苓样品，配制供试品溶液。

分别精密移取各供试品溶液0.5mL,加纯水至1mL加入5%苯酚溶液1mL,浓硫酸4mL,沸水浴25min，冰水浴15min。

取出后，补足减失体积，在490nm 处测定其吸光度，根据标准曲线计算不同仿野生栽培茯苓样品中茯苓多糖的百分含量。

本品含多糖不得少于0.418%。

②苯酚-硫酸法测定茯苓中多糖的含量［16］
茯苓多糖的提取与精制
取茯苓粉末11.59g,经120mL石油醚（60-90C）于索氏器中加热回流四小时，消除单糖及低聚糖。

将药渣放入2000mL烧杯中。

加入1000mL16mol/L尿素溶液，再与70℃下搅拌24小时，滤去残渣，滤液经减压浓缩至250mL,加750mL甲醇，析出对沉淀依次用甲醇，乙醚和丙酮洗涤三次，最后干燥，即得无定形粉末状的茯苓多糖。

标准曲线的绘制
取新蒸馏得到的苯酚（182℃下的馏分）8g,然后加入蒸馏水120mL，置于棕色瓶中，充分混合即得苯酚试液。

精称葡萄糖标准品100.0mg于105℃下干燥至恒重，置于100mL容量瓶中，后加入蒸馏水制成1mg/mL的标准溶液。

精密吸取0,10,20,40,60,80,100uL于具刻度比色管中，各加蒸馏水至体积为2.0mL,再各加苯酚试液1.0mL,摇匀，迅速滴加浓硫酸5.0mL,摇匀后再静置5min,最后沸水浴25min,取出放冷至室温，用空白对照管校零，再于490nm波长测定吸光度。

以吸光度为纵坐标，葡萄糖含量为横坐标，绘制出标准曲线。

求得回归方程为 A=6.788XX 10-3C+1.551 X 10-3, r=0.9986。

换算因子的确定
精称茯苓多糖50.0mg,加蒸馏水溶解，并定容至100mL得到贮备液。

精密吸取贮备液200uL （内含多糖W=100ug）按照标准曲线绘制项的方法测定其吸光度，并由线性回归方程求出相应的葡萄糖的含量C,最后按照f=W/C，测得换算因子为3.25。

样品溶液的制备
精称茯苓样品粉末1.000g，用滤纸包好，用80%乙醇100mL于索氏器中加热回流提取四小时，获得的残渣转移至洁净对烧杯中，加50mL6mol/L的尿素溶液，80℃下搅拌5h，减压过滤得到残渣，残渣用尿素溶液依同法处理三次，合并滤液，最后用蒸馏水稀释，并定容至1000mL。

测定法
精密吸取样品溶液100UL,按照标准曲线绘制项下测定吸光度，再由线性回归方程求出样品中葡萄糖含量C,最后由公式：多糖含量（％）:f-c/G,其中f为换算因子，G为相同体积的样品溶液对应的茯苓质量。

本品含多糖大于80%。

2.茯苓三萜的含量测定
①茯苓总三萜的含量测定[13]
照分光光度法（《中国药典》2015年版四部通则0401）测定。

显色条件5%香草醛-冰醋酸0.4mL、高氯酸1.8mL为显色剂，70℃水浴恒温20min。

对照品溶液的制备
精密称取茯苓酸对照品14.8mg,置于50mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，备用。

供试品溶液的制备
称取茯苓药材粉末（40目）约2g,精密称定，置100mL具塞三角瓶中，加入甲醇30mL, 冷浸30分钟，超声提取90分钟（用甲醇补足失重），滤过，减压回收溶剂；残渣用10mL
水捏溶，用乙酸乙酯振摇提取4次，每次10mL,合并乙酸乙酯液，减压蒸干；残渣用甲醇
溶解并转移到25mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

测定法
分别精密吸取对照品溶液200p L, 600p L和供试品溶液300p L,分别置具塞试管中，水浴挥去溶剂，冷却，准确加入0.4mL5%香草醛-冰醋酸溶液和1.8mL高氯酸，混匀，密塞。

置70℃恒温水浴中加热20min,取出，冷却至室温，加冰醋酸5mL,摇匀，以试剂为空白，在540nm 处测定吸光度。

本品含总三菇类成分（以茯苓酸计）的含量不得少于0.3%。

②茯苓酸的含量测定
照高效液相色谱法《中国药典》（2015年版四部通则0512）测定。

色谱条件用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-水-乙酸（700 : 300 :为流动相）；检测器波长210nm。

标准曲线的制备
精密称取取茯苓酸对照品适量，加甲醇溶解并制成每1mL含
0.76mg的溶液，作为对照品溶液。

分别取2、4、6、8、10|J L注入高效液相色谱仪。

以进样量和峰面积进行回归，计算标准曲线的回归方程。

供试品溶液的制备
取茯苓粉末（40目）约2g,精密称定，置100m L具塞锥形瓶中，加入甲醇30mL,超声处理90分钟（中途补充损失的甲醇），取出，放冷，过滤，滤液减压蒸干，残渣用甲醇溶解并转移到10mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀；用微孔滤膜（0.45R m）滤过，即得。

测定法
分别精密吸取对照品溶液5p L, 10p L和供试品溶液20p匚注入高效液相色谱仪。

测定，即得。

本品含茯苓酸不得少于0.035%
③茯苓皮中总三菇的含量测定
按照董红敬的分光光度法测定［17］。

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈"0.1%甲酸水溶液（梯度洗脱）为流动相；检测波长540nm。

标准品溶液的制备：精密称取1.12mg齐墩果酸置于10mL容量瓶中，加甲醇超声溶解，再用甲醇定容，摇匀，备用。

供试品溶液的制备：分别精密称取茯苓皮95%乙醇提取物和乙酸乙酯提取物26.72mg和25.26mg置于锥形瓶中，精密移取20mL甲醇，超声15min使样品溶解。

待冷却至室温后，作为母液；再分别取1mL母液于10mL量瓶中，定容，备用。

标准曲线的制备：精密吸取0.2,0.4,0.6,0.8,1.0mL标准品溶液分别置于具塞试管中，水浴挥干溶剂，冷却至室温，精密加入5%香草醛-冰醋酸溶液0.4mL和1.8mL高氯酸溶液，摇匀，密塞，置于70℃恒温水浴锅中加热20min，取出并冷却至室温，再加5mL冰醋酸，摇匀后，在540nm处测定吸光度。

以吸光度为纵坐标，齐墩果酸的质量（|J g）为横坐标做标准曲线。

测定法：分别精密移取1mL两种供试品溶液定容于10mL容量瓶中，从中取出1mL，测定其吸光度。

将所得吸光度代入标准曲线方程，即可计算含量。

本品按干燥品计算，95%乙醇提取物中三菇含量不得少于43.5%，乙酸乙酯提取物中三菇含量不得少于50.3%。

④去氢茯苓酸和茯苓酸含量的同时测定
照高效液相色谱法测定［18］。

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键和硅胶为填充剂；以乙腈-0.1%磷酸溶液（75:25）为流动相；检测波长210nm。

理论塔板数按茯苓酸峰计算不低于3000。

对照品溶液的制备:精密称定适量的茯苓酸和去氢茯苓酸对照品于同一10mL量瓶中，加氯仿-甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得到混合对照品溶液。

精密移取该混合溶液1.0mL 置10mL量瓶中，用甲醇稀释，配制成去氢茯苓酸和茯苓酸分别均含0.1g-L-1对照溶液。

供试品溶液的制备：取本品粉末约2.0g,精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入10mL 甲醇，超声处理（功率250W,频率为33KHZ）30分钟，滤过，滤液蒸干。

残渣加水溶解，乙酸乙酯萃取2次，每次10mL,合并乙酸乙酯层，蒸干，残渣用甲醇溶解定容至10mL量瓶中，摇匀，滤过即可。

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10p L/主入液相色谱仪，测定，即得。

本品按干燥品计算，含去氢茯苓酸（C33H50O4）不得少于2.13%,茯苓酸（C33HJ）不得少于3.155。

⑤去氢土莫酸、猪苓酸C、3-差向去氢土莫酸和去氢茯苓酸含量的同时测定
按照沈玉萍等人的反相高效液相色谱法测定［19］。

色谱条件与系统适用性试验:以十八烷基硅烷键和硅胶为填充剂;以乙腈-0.05%磷酸水溶液（梯度洗脱）为流动相；检测波长243nm。

对照品溶液的制备：分别取7.17mg去氢土莫酸、2.21mg猪苓酸C、5.12mg3-差向去氢土莫酸和12.35mg去氢茯苓酸，精密称定后置于25的容量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，备用。

以二倍稀释法制得6份混合对照品溶液，待测。

供试品溶液的制备：取本品粉末（过50目筛）1.00g,精密称定，加入50mL具塞锥形瓶中，精密加入20ml甲醇后，精密称重，超声30分钟（功率250W，频率50kHz），冷却至室温，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，滤过，取续滤液即得供试品溶液，备用。

标准曲线的制备：取6份混合对照品溶液20p L进样，以峰面积为纵坐标，混合对照品溶液质量浓度（%・mL-i）为横坐标进行线性拟合，得标准曲线的线性方程。

测定法：精密移取供试品溶液20p L进样，测定峰面积，代入线性方程，即可计算出百分含量（％）。

⑥去氢±莫酸、土莫酸、猪苓酸C、3-表去氢土莫酸、去氢茯苓酸和茯苓酸含量的同时测定
按照张靓琦等人摸索的超高液相色谱法测定［25。

色谱条件及系统适用性试验:以十八烷基键合硅烷为填充剂；乙腈-0.05% （梯度洗脱）的磷酸水溶液为流动相；检测波长210nm。

对照品溶液的制备：取对照品约4mg 士莫酸、10mg猪苓酸C、10mg去氢茯苓酸，精密称定，分别置于10mL容量瓶中；取对照品5mg去氢土莫酸、2mg3-表去氢土莫酸和5mg茯苓酸，精密称定，分别置于5mLml容量瓶中；各对照品用甲醇溶解并稀释至刻度，作为对照品溶液，备用。

分别吸取适量各对照品溶液于同10mL容量瓶中，加甲醇稀释并定容，摇匀，即得去氢土莫酸、土莫酸、猪苓酸C、3-表去氢土莫酸、去氢茯苓酸和茯苓酸的质量浓度分别为 0.1080,0.0408，0.1004,0.0424,0.1012 和 0.1020mg - mL-1 的混合对照品溶液。

供试品溶液的制备：取本品粉末约0.5mg （过60号目筛，40℃干燥12h），精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入10mL甲醇，称定质量，超声处理（功率250W，频率33kHz） 30 分钟，冷却至室温，称定质量，用甲醇补足减失质量，摇匀，用！22|j m微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液，备用。

标准曲线的制备：精密移取0.25,0.5, 1.0，2.0和3.8混合对照品溶液分别置于5mL 容量瓶中，加甲醇稀释并定容，摇匀。

第6点即用混合对照品溶液，进样20p L，以峰面积为纵坐标，质量浓度（|J g-mL-1）为横坐标，绘制标准曲线。

测定法：精密移取供试品溶液20p L进样，测定峰面积，代入标准曲线即可计算出去氢土莫酸等6种三萜酸的百分含量（％）。

⑦茯苓皮中松苓新酸的含量测定
按照闫雪生等人摸索的高效液相色谱条件测定［21］。

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键和硅胶为填充剂；以乙腈-0.5%磷酸水溶液（80:20）为流动相；检测波长242nm。

对照品溶液的制备：精密称取2.28mg松苓新酸对照品于10ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，制成228p g - mL-1的松苓新酸对照品溶液，备用。

供试品溶液的制备:约取1.0g茯苓皮粗粉，精密加入50ml甲醇，称定质量后加热回流，冷却，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过。

初滤液弃去，精密量取2mL续滤液，蒸干溶剂转移至10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，0.45R m微孔滤膜过滤，取续滤液，备用。

测定法：精密移取对照品溶液和供试品溶液各10p L进样，用外标法以峰面积计算茯苓皮中松苓新酸的含量。

⑧去氢土莫酸的含量测定
照高效液相色谱法测定［22,-23］。

色谱条件与系统适用性试验:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以乙腈-四氢呋喃-5% 醋酸（65:3:32）为流动相；检测波长242nm。

理论塔板数不得低于3000。

对照品溶液的制备：精密称取适量的去氢土莫酸对照品，置于10mL的容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，即可得浓度为0.04mg - mL-1的对照品溶液，备用。

供试品溶液的制备：取本品粉末（过3号筛）约2g,精密称定后置于50mL锥形瓶中，精密移取20mL甲醇，密塞，浸泡1h，超声处理40min后，取出。

冷却至室温，滤过，初滤液弃去，取续滤液作为供试品溶液。

测定法:分别精密移取对照品溶液和供试品溶液各10p L进样，用外标法以峰面积［in
计算样品中去氢土莫酸的含量。

本品按干燥品计算，含去氢土莫酸（C31H5004）不得少于0.0096%。

⑨猪苓酸C和去氢土莫酸的含量测定3……
按照金晓勇等人摸索的高效液相色谱条件测定［24］。

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键和硅胶为填充剂；以乙睛■水-磷酸（70:29.85:0.15）为流动相；检测波长244nm。

对照品溶液的制备：精密称定4.48mg猪苓酸C，3.43mg去氢土莫酸对照品分别置于两个10mL的容量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，得到0.448mg mL-1猪苓酸C和0.343mg «mL-1 去氢土莫酸对照品溶液，备用。

精密移取猪苓酸C、去氢土莫酸对照品溶液1ml至同一10ml 容量瓶中，加乙腈定容至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液，备用。

供试品溶液的制备：取0.4g本品粉末（过60目筛），精密称定，加入20mL甲醇-0.5% 乙酸溶液，超声提取30min,称定质量后用提取液补足减失的质量，滤过，减压蒸干，残渣用乙腈溶解，定容于5mL容量瓶中，用微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液，备用。

测定法：精密移取对照品溶液和供试品溶液各20p L进样，用外标法以峰面积计算猪苓酸C和去氢土莫酸的含量。

3.茯苓超高效液相色谱特征指纹图谱
按照张琦等人摸索的超高效液相色谱条件进行测定防
标准品溶液的制备
取3-酮基-6-羟基土莫酸、去氢土莫酸、猪苓酸C、3-表去氢土莫酸、3B - （4-羟基苯甲酰氧基）-土莫酸、去氢茯苓酸、30 -羟基苯甲酰氧基-土莫酸适量，先精密称定，加甲醇溶解，制成含有3-酮基-6-羟基土莫酸0.03g ・L-1、去氢土莫酸0.1g ・L-1、猪苓酸C0.1g -L-1、 3-表去氢土莫酸0.04g ・L-1、30 - （4-羟基苯甲酰氧基）-土莫酸0.004g -L-1、去氢茯苓酸0.1g・L-1、30 -羟基苯甲酰氧基-土莫酸0.004g - L-1的标准品溶液，最后经过0.22p m微孔滤膜滤过，于低温下冷藏下备用。

供试品溶液的配制
精密称取茯苓药材粉末约0.5g,后经十万分之一天平精密称定，置具塞锥形瓶中，精
密移取甲醇10mL,称定，超声（选用功率为250w,频率为33kHZ） 30min,放置冷却，最后
用甲醇补足失重，摇匀，过0.22p m微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。

测定法
取15批不同产地的样品，按上述方法配制供试品溶液，然后按上述已确定对色谱条件进样分析，记录色谱图，结果共获得20个色谱峰，并最终确认其中7个共有峰，分别为3- 酮基-6-羟基土莫酸（5号峰）、去氢土莫酸（10号峰）、猪苓酸C （13号峰）、3-表去氢土莫酸（14号峰）、30 - （4-羟基苯甲酰氧基）-土莫酸（16号峰）、去氢茯苓酸（17号峰）、3 0 -羟基苯甲酰氧基-土莫酸（18号峰）。

4.茯苓中重金属的含量测定［13］
照电感耦合等离子体质谱法（《中国药典》2015年版四部通则0412）测定。

4.1供试品溶液的制备
精密称取样品粉末0.1g,分别置于聚四氟乙烯消解罐中，加入6mL优级纯硝酸浸泡样品1h,再加入3mL氢氟酸和2mL30%过氧化氢，封罐，置于微波消解仪内进行消解。

消解程序结束后，待罐内温度稍降，将消解罐取出置于微机控温加热板上120c进行赶酸，待酸挥发至约1mL时取下稍冷，将消解液转移至10mL容量瓶内，用1%硝酸少量多次润洗消解罐内壁，再用1%硝酸溶液定容，将定容好的母液转移至15mLEP管内，置于4℃保存备用。

同法制备对应的空白对照溶液。

4.2标准曲线的制备
将Cu、As、Pb、Cd标准品溶液用1%硝酸溶液按梯度稀释为浓度0.1，0.2, 1，2, 5, 10, 20, 50p g・L-1的标准品待测液，按此法稀释内标元素（5R g-L-1）,测定得到校准曲线。

4.3测定法
将供试品溶液按适当倍数进行稀释，通过ICP-MS法进行测定。

药典规定中药材中，铅不得超过105mg • kg-1、镉不得超过15mg • kg-1、砷不得超过55mg , kg-1。

5.茯苓中微量元素含量的测定
①王德淑等人加利用PEA100原子吸收光谱仪测定茯苓中微量元素的含量：
样品制备：采用切片晒干的块状茯苓样品，首先在烘箱中于100c左右烘2h,接着在玛瑙研钵中磨碎，最后过100目筛，装瓶备用。

样品消解：精密称定2.000g左右以上制备的样品置于一只洁净干燥的200mL烧杯中，先加入浓硝酸10mL,接着用少量去离子水冲洗杯壁，盖上表面皿，静置于第二天早上，在电热上低温加热至干，接着补加5mL浓硝酸、1mL浓高氯酸和5mL左右的去离子水，继续加热，直至溶液开始产生高氯酸白烟，此时应当取下表面皿，同时加热赶净高氯酸。

最后用1%的硝酸定容至10mL,待测。

同时做全程序空白，并用国家环境监测总站的标样进行标准曲线质量控制。

测定法：茯苓药材中钾的含量最高，高达8005mg -kg-1；钠、铁、镁的含量都在1005mg ・kg-1 附近；铜、镒含量在105mg-kg-1；锌、铬含量在1-25mg-kg-1范围内；钻和镍的含量均低于 1-25mg • kg-1.
②季怀萍等人利用电感耦合等离子体原子发射光谱法切同时测定茯苓药材中多种微量元素: 标准曲线的制备
将Ca、Cu、Fe、Mg、Mn、Zn标准品溶液用1%硝酸溶液依次按梯度稀释为浓度0, 5, 50, 100； 0, 0.1, 1, 2； 0,1,10,20； 0, 5, 50, 100； 0,1,10,20； 0,1,10,20 的R
g • mL-1 的标准品待测液，并进行测定得到校准曲线。

供试品溶液的制备
将处理好的茯苓样品于80℃的条件下烘干，粉碎。

研磨，混匀后放入称量瓶中备用。

精密称定上述制备的茯苓粉末样品0.1000g置于四氯乙烯坩埚中，接着各加入5.0mL硝酸和0.5mL高氯酸，盖上坩埚盖浸泡过夜。

消解前先将坩埚盖取下，将坩埚置于可控恒温电热板，加热至120℃消化溶解。

待试样溶解完全呈透明液体时，加压浓缩至体积为1.0mL取下，冷却后将试液转入10.0mL的容量瓶中，并用去离子水定容至刻度，即得。

测定法
将供试品溶液按适当倍数进行稀释，通过ICP-AES法进行测定。