9种常用含丹参中成药对人肝微粒体CYP3A的体外抑制作用_刘松灿

August 2013 Vol． 35 No． 8
子天平 （ 瑞士 Mettler Toledo 公司） ； Millpore 纯水系统 （ 美 国 Millipore 公 司） ； Thermo 超 低 温 冰 箱 （ 美 国 Thermo 公 司） ； 电热恒温振荡水槽 （ 上海一恒科技有限公司） 。 2 实验方法 2. 1 溶液的配制 2. 1. 1 供试药溶液的配制 取 9 种含丹参中成药分别刮除 包衣或去除胶囊外壳，研细，精密称取药粉适量 （ 同一制 剂，取 6 份混匀） ，置于 1. 5 mL 离心管中，加 DMSO 超声 30 min，分别制备成相当于含丹参成药 100 mg / mL，用 DMSO 横向稀释得 5 个梯度为 100、30、10、3、1 mg / mL，然 后用 PBS 溶 液 纵 向 稀 释 100 倍，制 备 质 量 浓 度 分 别 为 1 000、300、100、30、10 μg / mL 的 含 丹 参 成 药 贮 备 液 （ DMSO 体积比为 1% ） ，放置 4 ℃ 冰箱保存。 2. 1. 2 CYP3A 探针与代谢物溶液的配制 精密称取咪达 唑仑或睾酮对照品 1. 0 mg 和 1-羟基咪达唑仑或 6β-羟基睾 酮对照品 0. 5 mg，分置于 1. 5 mL 离心管中，分别精密加入 超纯水或甲醇 1 mL，涡旋 1 min，充分溶解，即得质量浓 度为 1 mg / mL 的咪达唑仑或睾酮贮备液和 0. 5 mg / mL 的 1羟基咪达唑仑或 6β-羟基睾酮贮备液，4 ℃ 冰箱中保存。临 用前配制 20 mmol / L 的 NADPH 溶液。 2. 2 人肝微粒体反应体系组成及孵育
1. 6β-羟基睾酮 3. 内标 （ 地西泮）
图 1 LC-MS / MS 测定微粒体 6β-羟基睾酮色谱图
取终止反应后含内标的人肝微粒体反应体系样品，旋 涡振荡混匀 3 min，12 000 r / min 离心 10 min，取上清液 200 μL，12 000 r / min 离心 10 min，吸取上清液适量，进样 5 μL，用 LC-MS / MS 法测定 1-羟基咪达唑仑或 6β-羟基睾酮 的生成量。 2. 4 LC-MS / MS 测定 1-羟基咪达唑仑 ( 6β-羟基睾酮)
张 亮 （ 1980—） ，男，硕士生，从 事 中 医 内 科 学 和 中 药 药 代 动 力 学 研 究。Tel： （ 021 ） 20256536，E-mail： Lzhang _ 2050 @ 126. com
* 通信作者： 裘福荣 （ 1966—） ，男，理 学 博 士， 副 主 任 药 师，硕 士 研 究 生 导 师，研 究 方 向： 中 药 药 代 动 力 学 研 究。Tel： （ 021 ） 20256536，E-mail： Furong_ qiu@ 126． com
实验数据均用 x ± s 表示，以对照组的代谢产物和内标 的峰面积比作为酶活性 100% ，其他组代谢产物和内标的 峰面积比与对照组的比值，计算 CYP3A 的酶相对活性百分 比，算得的相对酶活性对抑制剂浓度作图，求出抑制剂的 IC50 值。 3 结果 3. 1 1-羟基 咪 达 唑 仑 ( 6β-羟 基 睾 酮) 微 粒 体 检 测 方 法 考证 3. 1. 1 专属性 分别取空白微粒体、微粒体加入 1-羟基咪 达唑仑 （ 或 6β-羟基睾酮） 、微粒体加入咪达唑仑 （ 或睾 酮） 温孵后，按样品处理方法处理样品，进样测得典型色 谱质谱图 （ 图 1） 。1-羟基咪达唑仑 （ 或 6β-羟基睾酮） 和 内标分离良好。
摘要： 目的 评价 9 种临床常用含丹参中成药对人肝微粒体 CYP3A 活性的抑制作用。方法 利用人肝微粒体，以睾
酮及咪达唑仑作为评价 CYP3A 活性的体外探针，以高效液相串联质谱仪测定代谢产物 1-羟基咪达唑仑与 6β-羟基睾酮
生成量，评价 9 种常用含丹参中成药对 CYP3A 酶的抑制，计算 IC50 值。结果 丹参酮胶囊对人肝微粒体 CYP3A 酶活 性具有抑制作用，以咪达唑仑为探针的 IC50 为 7. 4 μg / mL，以睾酮为探针 IC50 为 32. 5 μg / mL； 其余 8 种含丹参中成药 对人肝微粒体 CYP3A 活性无抑制作用。结论 丹参酮胶囊可显著抑制 CYP3A 酶活性。
腈均为色谱纯 （ 美国 TEDIA 公司） ，甲酸、乙酸铵为分析 纯 （ 国药集团化学试剂有限公司） 。 1. 2 药 物 天 王 补 心 丹 （ 批 号： 101108，规 格： 0. 375 g /粒，河南省宛西制药股份有限公司） ； 心可舒片 （ 批号： 110213，规格： 0. 31 g / 粒，山东沃华医药科技股份有限公 司） ； 参松养心胶囊 批号： 20090904，规格： 0. 4g / 粒，石 家庄以岭药业股份有限公司； 心脉通片 （ 批号： 100404， 规格： 0. 31 g / 粒，广东邦民制药厂有限公司） ； 复方血栓 通胶囊 （ 批号： 110138，规格： 0. 5 g / 粒，广东众生药业 股份 有 限 公 司） ； 复 方 丹 参 片 （ 批 号： 10031701，规 格： 0. 31 g / 粒，上海雷 允 上 药 业 有 限 公 司） ； 丹 参 片 （ 批 号： 101118，规 格： 0. 31 g / 粒，上 海 雷 允 上 药 业 有 限 公 司） ； 复方丹参滴丸 （ 批号： 110211，规格： 27 mg / 粒，天津天 士力制药股份有限公司） ； 丹参酮胶囊 （ 批号： 20090904， 规格： 0. 25 g / 粒，河北兴隆希力药业有限公司） 。 1. 3 仪器 API 4000 型串联三重四极杆液相质谱联用仪 （ 美国 ABI / SCIEX 公司） ： 配有电喷雾离子化源 （ ESI） 以 及 Analyst 1. 4. 2 数据处理软件； Agilent 1200 高效液相色谱 仪 （ 美国 Agilent 公司） ： 配置四元梯度泵、在线脱气机、 自动进样器、柱温箱； Backman Allegra 64R 高速冷冻离心 机 （ 美国 Backman Coulter 公司） ； XS—105 十万分之一电
质谱条件为电喷雾离子源 （ ESI） ，正离子模式，离子 源喷雾电压 （ IS） 45. 00 V，离子化温度 （ TEM） 400 ℃ ， 喷雾气压 （ GS1 ） 50. 00 kPa，辅助气压 （ GS2 ） 55. 00 kPa； 多反应检测 （ MRM） 模式： 1-羟基咪达唑仑 m / z 342. 10→ m / z 324. 00、解簇电压 88. 08 V、碰撞能量 36. 52 V、碰撞 室 出 口 电 压 9. 07 V； 6β-羟 基 睾 酮 m / z 305. 20 → m / z 269. 30、解簇电压 79. 37 V、碰撞能量 18. 91 V、碰撞室出 口电压 8. 00 V； 地西泮 m / z 285. 20 →m / z 193. 10、解簇电 压 98. 06 V、碰撞能量 43. 00 V、碰撞室出口电压 11. 45 V。 2. 5 数据处理
收稿日期： 2012-07-30 基金项目： 国家自然科学基金 （ 81173118） ； “十二五” 创新药物研究开发技术平台建设 （ 2012ZX09303009-002） ； 上海市教委重点学 科中药临床药理学 （ J50303） 作者简介： 刘松灿、张亮为共同第一作者。刘松灿 （ 1982—） ，男，博 士 生，从 事 中 医 内 科 学 和 中 药 药 代 动 力 学 研 究。Tel： （ 021 ） 20256536，E-mail： liusongcan@ 126. com
①取 1. 5 mL 干净离心管若干，依次加入 1 mg / mL 微粒 体 40 μL （ 碎冰上解冻） ，咪达唑仑 （ 50 μmol / L） 20 μL 或 睾酮 （ 750 μmol / L） 20 μL，丹参制剂溶液 （ 或 1% DMSO 与 PBS 配制的对照组） 20 μL，用 PBS 溶液补足至 200 μL， 混匀 30 s，为人肝微粒体反应体系； 取另一 1. 5 mL 干净离 心管，加入 10 mmol / L 的 NADPH 若干。并将两离心管放入 37 ℃ 水浴中预温孵 5 min。②在人肝微粒体反应体系中加 入 37 ℃ 10 mmol / L 的 NADPH 20 μL 启动反应，于 37 ℃ 水 浴中继续孵育 5 min （ 咪达唑仑） 或 10 min （ 睾酮） ； ③加 入 － 20 ℃ 冰乙腈 200 μL （ 含内标地西泮 12. 5 ng / mL） 终 止反应。反应体系中 DMSO 体积比控制在 1‰以内。 2. 3 样品处理
蒋 健 （ 1956—） ，男，医学博士，主任医师床药理学。Tel： （ 021 ） 20256536，E-mail： jiangjiansg@ 126． com
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2013 年 8 月 第 35 卷 第 8 期
中成药 Chinese Traditional Patent Medicine
2013 年 8 月 第 35 卷 第 8 期
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August 2013 Vol． 35 No． 8
9 种常用含丹参中成药对人肝微粒体 CYP3A 的体外抑制作用
刘松灿， 张 亮， 裘福荣* ， 张新峰， 贺 敏， 蒋 健* （ 上海中医药大学附属曙光医院临床药理科，上海 201203）
液相条件为 Agilent C18 柱 （ 5 μm，150 mm × 4. 6 mm） ； 流动相为含 4 mmol / L 醋酸铵和 0. 08% 甲酸水溶液 （ A） － 甲醇 （ B） （ 20 ∶ 80） ； 体积流量 0. 8 mL / min，柱温30 ℃ ， 自动进样器温度 4 ℃ ，进样量 5 μL。
关键词： 丹参； 中成药； 细胞色素 P450 3A； 咪达唑仑； 睾酮； 人肝微粒体
中图分类号： R285. 5
文献标志码： B
文章编号： 1001-1528（ 2013） 08-1776-04
doi： 10. 3969 / j． issn． 1001-1528． 2013． 08． 046
细胞色素 P450 酶 （ Cytochrome P450，CYP） 为一类亚铁 血红素蛋白的超家族，它参与内源性物质和包括药物在内的 外源性物质的代谢。CYP 在哺乳动物主要存在于微粒体中， 是药物代谢过程中的关键酶，根据氨基酸序列的统一性分为 17 个家族和许多亚家族，其中 CYP3A 是 CYPs 的主要亚家 族，参与了近 50% 处方药的体内代谢［1］。中药成分复杂， 具有诱导或抑制 P450 酶活性可能性更大，与药物联用会导 致联用药物血药浓度的改变，影响其安全性和有效性。尤其 当抑制 CYP3A 中药与安全范围窄的 CYP3A 底物联用时，因 底物的代谢被抑制使其血药浓度升高，导致药物毒性反应增 加，甚至致死。含丹参中成药在临床上广泛应用［2-7］，多与 治疗心、脑血管疾病药物联用。本研究选用 9 种临床常用的 含丹参成方，采用人肝微粒体模型、以咪达唑仑和睾酮为探 药进行对 CYP3A 抑制作用的研究，发现抑制 CYP3A 的含丹 参成方，求算对 CYP3A 抑制程度 （ IC50 ） ，为临床合理使用 含丹参成方提供参考依据，避免不良的药物相互作用。 1 材料与仪器 1. 1 试剂 人肝微粒体 （ 上海瑞德公司） ； 还原型辅酶 II （ NADPH） 、1-羟基咪达唑仑、睾酮、6β-羟基睾 酮 对 照 品 （ ≥98% ） （ 美国 Sigma 公司） ； 马来酸咪达唑仑 （ ≥98% ） 与地西泮对照品 （ 中国药品生物制品检定所） ； 甲醇和乙