不同培养条件对黄檗快速繁殖的影响

摘要：以黄檗幼嫩的茎尖和茎段为材料建立外植体，以MS培养基为基本培养基进行黄檗的组培快繁，研究不同培养条件对黄檗快速繁殖的影响。

结果表明：75%的酒精消毒8s+0.1%HgCl
2
消毒4min对外植体消毒效果最好；以6-BA0.7mg/L+NAA1.0mg/L的MS培养基对黄檗茎段的诱导效果最好；以NAA浓度为0.7mg/L的MS培养基生根效果最好；黄檗组培苗在培养30d后进行转培对黄檗组培苗的生长最好。

关键词：黄檗；培养条件；快速繁殖
黄檗（Phellodendron amurense Rupr.）又名黄菠萝，芸香科，落叶乔木，是国家二级珍贵树种，也是我国三大珍贵阔叶树种之一。

黄檗具有深根性、抗风力强、生长快等特点，对气候适应性强，苗期稍能耐荫，成年树喜阳光。

主要分布在我国的黑龙江、吉林、辽宁、河北等省[1]。

黄檗树皮木栓层很发达且其中含有一些生物碱，具有重要的经济和药用价值。

黄檗树叶随季节而变化，也可用于园林[2]。

该树种在新疆各地城市绿化生态园林中得到广泛应用，目前已推广到博乐、奎屯、克拉玛依、乌鲁木齐及和田等地。

目前，黄檗已经被列为国家二级保护植物和重点植物保护资源，在《中国植物红皮书》中，将其列为渐危种。

黄檗种皮坚硬，透水和透气性较差，所以种子发芽率较低。

扦插繁殖，黄檗不易生根，成活率低，繁殖系数低[3]。

组织培养可在短期内得到大量、优质、整齐的组培苗，有可能是解决种苗短缺的有效途径之一。

本项目的研究旨在找寻黄檗快速繁殖的最适条件。

1材料与方法1.1试验材料
黄檗的繁殖材料于2019年5月17日至2019年6月7日采自石河子大学农学院实验站黄檗树上的新鲜幼嫩的茎尖和茎段。

1.2试验方法
1.2.1外植体的选择与消毒
于生长期分别采取黄檗幼嫩的茎尖和茎段（长2cm左右），采用75%的酒精和0.1%的HgCl2进行消毒，经不同时间的消毒灭菌后，建立外植体。

本实验采用75%的酒精（消毒时间：3s、5s和8s）和0.1%的HgCl2（消毒时间：2min、4min和6min）进行消毒，共设9组实验方案。

1.2.2外植体的接种与培养
首先用自来水将黄檗茎段冲洗干净，再放少许洗衣粉继续冲洗，直到不再产生泡沫；然后将外植体转移至无菌操作台上，先浸入75%的乙醇，然后用无菌水冲洗3~5遍，再用0.1%的HgCl2消毒之后再用无菌水冲洗3~5遍，用无菌滤纸吸干水分；将外植体接种在基本培养基上进行组织培养。

在离体培养条件下，由于各种植物的生物学特性、遗传特性和生态学特性的不一致，它们对营养的要求也不同，因此选择适宜的培养基对黄檗组培至关重要[4]。

本实验设置不同6-BA浓度（0.5mg/L、1.0mg/L）和NAA浓度（0.5mg/L、1.0mg/L）配比的4组MS基本培养基，基本培养基各500mL。

培养条件为：蔗糖为30g/L，琼脂为7g/L，pH为5.8，温度介于20~25℃之间，光暗周期为16/8h。

培养30d后，观察并统计9组消毒方案下黄檗组培苗的褐变率、污染率及成活率，通过对比分析，以确定最佳的消毒时间组合。

此外，通过统计黄檗组培苗的芽丛数、株高，并观察组培苗长势，以确定最佳6-BA浓度和NAA浓度配比的基本培养基。

1.2.3腋芽初始培养
利用第一次初始培养得到的黄檗组培苗进行
不同培养条件对黄檗快速繁殖的影响
刘娜1，范香香2，丁俊杰3*
（1.中国科学院新疆生态与地理研究所《干旱区地理》编辑部，新疆乌鲁木齐830011；
2.蒲城县退耕还林事务中心；
3.新疆农垦科学院）
——————
收稿日期：2022—12—19
*通讯作者：丁俊杰（1988.11-），男，汉族，助理研究员，研究方向
为林学。

E-mail：****************。

芽的诱导实验。

制作不同6-BA 浓度（0.5mg/L 、1.0mg/L ）和NAA 浓度（0.2mg/L 、0.6mg/L 、1.0mg/L 、1.4mg/L ）配比的8组MS 培养基，各250mL 。

对基本培养基培养得到的黄檗组培苗进行腋芽的初始诱导培
养到8组激素配比的MS 培养基中。

培养条件为：蔗糖为30g/L ，琼脂为7g/L ，pH 为5.8，温度介于20~25℃，光暗周期为16/8h 。

培养30d 后，观察并统计组培苗的腋芽数、株高及长势，以确定用于腋芽诱导的最佳6-BA 浓度和
NAA 浓度配比。

1.2.4
腋芽增殖培养
腋芽的增殖培养是通过施用外源激素打破顶端优势、激发腋芽增殖为基础的再生方式。

选取含腋芽结构的黄檗茎段，在诱导培养基上培养10d 左右，使其在腋芽处分化新芽，降低细胞分裂素后经一个继代就能萌出新枝、形成小苗。

腋芽增殖途径不经过脱分化，再生植株的变异最小，因此这是繁殖优良品种、濒危物种和药用植物的首选方法。

利用第一次腋芽初始诱导得到的黄檗组培幼苗进行腋芽的增殖培养。

制作不同6-BA 浓度（0.5mg/L 、0.7mg/L 、0.9mg/L 、1.2mg/L ）和NAA 浓度（0.5mg/L 、1.0mg/L ）配比的8组MS 培养基，各250mL 。

对第一次腋芽初始诱导得到的黄檗组培苗的芽丛进
行增殖培养到8组激素配比的MS 培养基中。

培养条件为：蔗糖为30g/L ，琼脂为7g/L ，pH 为5.8，温度介于20~25℃之间，光暗周期为16/8h 。

培养30d 后，观察并统计组培苗的腋芽增殖数、株高及长势，以确定用于腋芽增殖培养的最佳6-BA 和NAA 浓度配比。

1.2.5
试管苗生根培养
试管苗的生根培养是组织培养中的重要环节，是快速繁殖幼苗的有力保证[5]。

目前，对于组织培养试管苗生根的研究，国内外针对不同植物做了大量的研究。

将外植体培养在4组不同NAA 浓度（0.1mg/L 、0.4mg/L 、0.7mg/L 、1.0mg/L ）的MS 培养基中。

培养条件为：蔗糖为30g/L ，琼脂为7g/L ，pH 为5.8，温度介于20~25℃，光暗周期为16/8h 。

培养30d 后，观察并统计组培苗的生根数、生根率及根的长势，以确定黄檗组培苗生根的最佳NAA 浓度。

1.2.6
黄檗组培苗转培
在组织培养中，不同转培时间对黄檗组培苗的影响也很大。

本实验共设立了4组转培时间，分别是在接种后的20d 、25d 、30d 、35d 和40d ，将继代培
养中的黄檗组培苗分别经不同时间将进行转培，并观察组培苗的株高和生长状态，以确定其最适宜的转培时间。

2结果与分析
2.1
不同消毒方法对黄檗茎段培养的影响
通过对比发现75%的酒精消毒时间为8s 、
0.1%HgCl 2的消毒时间为4min 时的消毒效果最好
（表1），污染率仅为1.2%，褐变率为1.0%，外植体的成活率高达93.1%。

从实验可知，当75%的酒精杀毒
时间为3s 时，褐变率很低，但是污染率却升高了。

当75%的酒精杀毒时间为5s 时，褐变率和污染率都不是很低，外植体的成活率也不高。

0.1%HgCl 2的消毒方法对实验的影响较小。

由此可见，酒精消毒时间过长会引起褐变的数量增加，但是杀菌效果较好；如果酒精消毒时间过短，虽然褐变率降低，但是杀菌效果不是很好。

表1
不同消毒时间对黄檗茎段培养的影响
%
消毒实验方案75%酒精3s +0.1%HgCl 26min 75%酒精3s +0.1%HgCl 24min 75%酒精3s +0.1%HgCl 22min 75%酒精5s +0.1%HgCl 26min 75%酒精5s +0.1%HgCl 24min 75%酒精5s +0.1%HgCl 22min 75%酒精8s +0.1%HgCl 26min 75%酒精8s +0.1%HgCl 24min 75%酒精8s +0.1%HgCl 22min 褐变率1.00.70.91.21.70.91.71.01.3
污染率9.18.78.45.64.95.61.81.23.1
外植体成活率
88.287.685.390.189.788.690.093.191.4
2.2最佳基本培养基的筛选
经过一段时间的培养，不同激素浓度对黄檗组
培苗壮苗的影响效果显著（表2），在第4组培养基中，黄檗幼苗生长极其缓慢，平均株高只有2.7cm 。

而第1组和第3组培养基中的黄檗幼苗长势均良好，株高在3.2cm 左右。

只有第2组培养基中的黄檗幼苗长势最好，平均株高达到了4.8cm 。

因此，在6-
BA0.5mg/L+NAA1.0mg/L培养基中黄檗组培幼苗生长迅速且状态最好。

2.3腋芽的初始诱导
在所有的组合中，6-BA0.6mg/L+NAA1.0 mg/L的培养基对黄檗茎段腋芽的诱导效果最好（表3）。

在这种培养基中，腋芽数量较多且黄檗组培苗长势较好。

研究发现生长素NAA浓度一定时，芽的抽芽增殖率并不随着细胞分裂素浓度的升高而增大，高浓度的6-BA反而抑制细胞的分化和生长。

2.4腋芽的增殖培养
在培养基的各种成分中，植物激素的影响最大。

在木本植物的组织培养中，常用BA诱导腋芽增殖途径得到无菌苗。

在6-BA0.7mg/L+NAA1.0 mg/L的培养基中，黄檗腋芽增殖倍数最大，达到6倍每株（表4）。

组培苗的生长状态也最好，植株生长最高，叶片伸展而且大。

由此可见，该浓度适合愈伤组织培养和遗传转化的研究。

虽然黄檗在6-BA0.7mg/L+NAA1.0mg/L培养基中，腋芽的增殖数最大，达到每株6个。

但是，腋芽的增殖率并不随着激素浓度的增加而增加，高浓度的激素浓度反而抑制了组培苗的生长。

因此，通过本实验，确定了6 -BA0.7mg/L+NAA1.0mg/L为黄檗腋芽增殖的最佳激素浓度。

2.5诱导生根途径
当NAA浓度为0.7mg/L时处理效果最好，生根的平均条数为4条，根呈绿色且粗壮。

而当NAA浓度达到1.0mg/L时，黄檗的生根率明显降低，根的颜色也由绿色变成黄白色（表5）。

这说明较高或者较低的生长素浓度都不利于黄檗再生苗的生根。

由此，可以确定黄檗最佳生根激素为NAA0.7mg/L。

2.6继代培养中不同转培时间对组培苗的影响
黄檗组培苗在培养20d后，组培苗长势一般，平均株高只有3.1cm；黄檗组培苗在培养25d后，组培苗长势较好，叶片也变的伸展了，平均株高为3.4cm；黄檗组培苗在培养30d后，组培苗长势最好，叶片大而伸展且颜色翠绿，平均株高为3.8cm；黄檗组培苗在培养35d后，组培苗较30d时长势下降，叶片大但是开始卷曲，平均株高为3.9cm；黄檗组培苗在培养40
d后，组培苗长势一般，叶片卷曲严重且开始发黄，平均株高为3.9cm（表6）。

所以，黄檗组培苗在培养30d后进行转培对黄檗组培苗的生长最好。

3结论
本实验分别采用了6-BA和NAA研究不同激素组合对黄檗愈伤组织诱导和分化的影响。

在接种
表2基本培养基对黄檗组培苗的影响
培养基1 2 3 46-BA浓度
（mg/L）
0.5
0.5
1.0
1.0
NAA浓度
（mg/L）
0.5
1.0
0.5
1.0
芽丛数
（丛）
2
1
1
2
平均株高
（cm）
3.3
4.8
3.1
2.7
组培苗状态
长势较好，叶片稍小，伸展，颜色淡绿，愈伤组织良好
长势极好，叶片大而伸展，颜色淡绿，愈伤组织较膨大
长势良好，叶片细长，向下卷，颜色偏绿，愈伤组织一般
长势一般，叶片细长，颜色淡绿，愈伤组织良好
表3不同6-BA、NAA浓度下黄檗茎段腋芽生长状态
6-BA浓度（mg/L）1.4 1.0 0.6
0.2
1.4 1.0 0.6 0.2NAA浓度
（mg/L）
0.5
0.5
0.5
0.5
1.0
1.0
1.0
1.0
腋芽数
（个）
1.0
1.5
2.0
1.5
1.5
2.0
3.0
2.0
平均株高
（cm）
1.0
1.2
2.0
2.5
1.4
2.5
3.5
2.0
组培苗状态
长势一般，叶细长，发黄
长势较好，叶较宽伸展，浅绿色
长势一般，叶细长扭曲，发黄
长势较好，叶细长伸展，黄绿色
长势较好，叶细长卷缩，淡绿色
长势一般，叶小，绿色
长势极好，叶片较大伸展，绿色
长势较好，叶片较大伸展，翠绿色
的最初一周内，外植体开始膨大，膨大到外植体最初体积的2倍；两周左右，外植体开始从切口的边缘分化出愈伤组织。

研究发现，不同激素浓度对外植体愈伤组织诱导和再生均有一定的影响。

本实验研究结果表明：（1）消毒时间：75%的酒精消毒时间为8s、0.1%HgCl2的消毒时间为4min时的消毒效果最好。

（2）基本培养基的确定：6-BA0.5mg/L+
NAA1.0mg/L的培养基中黄檗组培幼苗生长迅速且状态最好。

（3）腋芽的初始诱导：6-BA0.6mg/L+ NAA1.0mg/L的培养基对黄檗茎段腋芽的诱导效果最好。

（4）腋芽的增值培养：6-BA0.7mg/L+NAA 1.0mg/L的培养基中黄檗腋芽增殖倍数最大，组培苗的生长状态也最好，植株生长最高，叶片伸展而且大。

由此可见，该浓度适合愈伤组织培养和遗传转化研究。

（5）诱导生根途径：当NAA浓度为0.7mg/L时诱导生根的效果最好，根呈绿色且粗壮。

（6）继代培养中，黄檗组培苗在培养30d后进行转培对黄檗组培苗的生长最好。

参考文献
[1]李文远.黄檗组织培养及其生物碱含量研究[D].河北科技大学，2013.
[2]王高鹏，王瑶瑶，程超民，等.黄菠萝树栽培技术及开发利用初探[J].安徽农学通报，2020，26（8）：59-60.
[3]唐学利，韩美娜，张宝海，等.黄菠萝实生育苗技术研究[J].内蒙古林业调查设计，2020，43（3）：26-27，48.
[4]张俊，程广有，刘岩.黄檗生长性状氮磷钾响应模型[J].北华大学学报（自然科学版），2021，22（2）：182-186. [5]赵瑞喜，李春晓，孙美欧，等.黄檗优选树嫁接技术[J].林业勘查设计，2020，49（1）：137-139.
表4不同6-BA、NAA浓度对黄檗茎段腋芽增殖的影响
6-BA浓度（mg/L）0.5 0.7
0.9
1.2 0.5 0.7
0.9
1.2NAA浓度
（mg/L）
0.5
0.5
0.5
0.5
1.0
1.0
1.0
1.0
腋芽增殖数
（个）
2
4
3
1
4
6
5
3
平均株高
（cm）
2.8
3.7
2.5
2.5
3.4
5.0
3.5
2.0
组培苗状态
长势差，叶细长，发黄
长势较好，叶较宽伸展，浅绿色
长势一般，叶片较宽，伸展
长势一般，叶片细长，向下卷
长势较好，叶细长伸展，黄绿色
长势极好，叶片较大伸展，绿色
长势较好，叶片较细，翠绿色
长势一般，叶片伸展
表5不同NAA浓度对黄檗生根的影响
NAA浓度（mg/L）
0.1
0.4
0.7
1.0
平均生根数（条）
1
2
4
3
生根率（%）
9
23
52
21
根的状态
黄绿色，细嫩
淡绿色，粗壮
绿色，粗壮
黄白色，卷曲表6不同转培时间对黄檗组培苗的影响
接种后天数（d）
20
25
30
35
40
组培苗状态
长势一般，叶片细长，颜色淡绿
长势较好，叶片细长伸展，颜色淡绿
长势极好，叶片大而伸展，翠绿色
长势很好，叶片大但卷曲，颜色浅绿
长势一般，叶片向下卷曲，发黄
平均株高（cm）
3.1
3.4
3.8
3.9
3.9。