主动脉弓缩窄诱导大鼠心肌肥大RafMEKERK通路的变化

主动脉弓缩窄诱导大鼠心肌肥大Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ通路的变化
富丹婷１，屠　珏１，蔡月琴１，蔡兆伟１，张利棕１，刘景艳１，徐山春２，王德军１
Δ
（１．浙江中医药大学动物实验研究中心／比较医学研究所，杭州３１００５３；２．浙江中医药大学附属一院中内科，杭州３１０００６）
【摘要】　目的：通过观察心肌肥大大鼠加速纤维肉瘤／丝裂素活化蛋白激酶激酶／胞外信号调节蛋白激酶（Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ）通路关键因子的基因和蛋白表达及蛋白磷酸化修饰水平上的变化，了解Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ通路在心肌肥大调控中的作用。

方法：２
０只ＳＤ大鼠随机分为假手术组和模型组，通过主动脉弓缩窄（ＴＡＣ）法建立心肌肥大模型，
１２周后颌下静脉取血分离血清，检测氨基末端脑钠肽前体（ＮＴ ｐｒｏＢＮＰ）含量，之后进行超声心动图测定和麻醉下的血流动力学测定，收集心肌标本，观察心肌组织的病理学改变，检测心肌组织Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ通路的关键因子基因、蛋白表达水平及蛋白磷酸化水平的变化。

结果：与假手术组比较，ＴＡＣ模型组大鼠超声心动图的左室舒张末期室间隔厚度（ＩＶＳｄ）、左室收缩末期室间隔厚度（ＩＶＳｓ）、左室后壁舒张末期厚度（ＬＶＰＷｄ）、左室后壁收缩末期厚度（ＬＶＰＷｓ）显著增厚（Ｐ＜０．０５，Ｐ＜０．０１），左室收缩末期内径（ＬＶＩＤｓ）显著减小（Ｐ＜０．０１），左心室质量（ＬＶＭａｓｓ）、左心系数ＬＷ（ＬＶＭａｓｓ／Ｗｅｉｇｈｔ）比值显著增加（Ｐ＜０．０５，Ｐ＜０．０１）；大鼠心率（ＨＲ）、左心室最大收缩速率（＋ｄｐ／ｄｔｍａｘ）、左心室最大舒张速率（－ｄｐ／ｄｔｍａｘ）均显著降低（Ｐ＜０．０１），血清中ＮＴ ｐｒｏＢＮＰ含量显著增加（Ｐ＜０．０１）；心肌细胞排列杂乱，心肌细胞肥大、胞质明显增多，炎症细胞浸润，出现大量胶原纤维沉积，大面积心肌细胞呈现蓝色；大鼠心肌组织中ｃ Ｒａｆ在Ｓｅｒ２５９和Ｓｅｒ３３８上的磷酸化蛋白ｐｈｏｓｐｈｏ ｃ Ｒａｆ（Ｓｅｒ２５９）和ｐｈｏｓｐｈｏ ｃ Ｒａｆ（Ｓｅｒ３３８）表达水平显著升高（Ｐ＜０．０１），其下游ＭＥＫ１／２、ＥＲＫ１／２的磷酸化蛋白ｐｈｏｓｐｈｏ ＭＥＫ１／２（Ｓｅｒ２１７／Ｓｅｒ２２１）和ｐｈｏｓｐｈｏ ＥＲＫ１／２（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）表达水平也显著增高（Ｐ＜０．０１）。

结论：Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ通路在心肌肥大中的调控作用，可能通过激活关键因子ｃ Ｒａｆ、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２、ＥＲＫ１和ＥＲＫ２特异性位点的磷酸化实现的。

【关键词】　大鼠；Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ通路；心肌肥大；主动脉弓缩窄；调控机制
【中图分类号】Ｒ３３ 【文献标识码】Ａ 【文章编号】１０００ ６８３４（２０２０）０１ ０３３ ００７【ＤＯＩ】１０．１２０４７／ｊ．ｃｊａｐ．５８３４．２０２０．００７
ＴｈｅｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆＲａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫｐａｔｈｗａｙｏｎｔｈｅｒａｔｃａｒｄｉａｃｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙｉｎｄｕｃｅｄｂｙｔｒａｎｓｖｅｒｓｅａｏｒｔｉｃｃｏｎｓｔｒｉｃｔｉｏｎ
ＦＵＤａｎ ｔｉｎｇ１，ＴＵＪｕｅ１，ＣＡＩＹｕｅ ｑｉｎ１，ＣＡＩＺｈａｏ ｗｅｉ１，ＺＨＡＮＧＬｉ ｚｏｎｇ１，ＬＩＵＪｉｎｇ ｙａｎ１，
ＸＵＳｈａｎ ｃｈｕｎ２，ＷＡＮＧＤｅ ｊｕｎ
１Δ
（１．ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＡｎｉｍａｌＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒ／ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＣｏｍｐａｒａｔｉｖｅＭｅｄｉｃｉｎｅＺｈｅｊｉａｎｇＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ３１００５３；２．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＩｎｔｅｒｎａｌＭｅｄｉｃｉｎｅ，ｔｈｅＦｉｒｓｔＡｆｆｉｌｉａｔｅｄＨｏｓｐｉｔｉａｌｏｆＺｈｅｊｉａｎｇＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ３１０００６，Ｃｈｉｎａ）
【ＡＢＳＴＲＡＣＴ】Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＴｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｍＲＮＡ，ｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓａｎｄｔｈｅｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆｋｅｙｆａｃｔｏｒｓｉｎｒａｐｉｄｌｙａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄｆｉｂｒｏｓａｒｃｏｍａ／ｍｉｔｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅｋｉｎａｓｅ／ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｒｅｇｕｌａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅｓ（Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ）ｐａｔｈｗａｙ，ａｎｄｔｏｃｌａｒｉｆｙｔｈｅｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆＲａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫｐａｔｈｗａｙｉｎｍｙｏｃａｒｄｉａｌｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：ＴｗｅｎｔｙＳＤｒａｔｓｗｅｒｅｄｉｖｉｄｅｄｉｎ ｔｏｓｈａｍ ｏｐｅｒａｔｅｄｇｒｏｕｐａｎｄｍｏｄｅｌｇｒｏｕｐ．Ｔｈｅｍｙｏｃａｒｄｉａｌｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙｍｏｄｅｌｗａｓｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｂｙｔｒａｎｓｖｅｒｓｅａｏｒｔｉｃｃｏｎｓｔｒｉｃｔｉｏｎ（ＴＡＣ）．Ａｔ１２ｗｅｅｋｓａｆｔｅｒＴＡＣ，ｂｌｏｏｄｓａｍｐｌｅｓｗｅｒｅｃｏｌｌｅｃｔｅｄｆｒｏｍｔｈｅｓｕｂｍａｎｄｉｂｕｌａｒｖｅｉｎ，ａｎｄｔｈｅｓｅｒｕｍｗａｓｓｅｐａｒａｔｅｄｔｏｄｅｔｅｃｔｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆＮｔｅｒｍｉｎａｌｐｒｏＢｔｙｐｅｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃｐｅｐｔｉｄｅ（ＮＴ ｐｒｏＢＮＰ）．Ａｆｔｅｒｔｈａｔ，ｔｈｅｒａｔｓｗｅｒｅｓｕｂｊｅｃｔｅｄｔｏｅｃｈｏｃａｒｄｉｏｇｒａｐｈｙａｎｄｈｅｍｏｄｙｎａｍｉｃｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ．Ｔｈｅｎｔｈｅｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｎｇｅｓｏｆｍｙｏｃａｒｄｉａｌｔｉｓｓｕｅｗｅｒｅｏｂｓｅｒｖｅｄ．ＡｎｄｔｈｅｌｅｖｅｌｓｏｆｍＲＮＡ，ｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｔｈｅｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎｏｆｋｅｙｆａｃｔｏｒｓｉｎＲａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫｐａｔｈｗａｙｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｉｎｍｙｏｃａｒｄｉａｌｔｉｓｓｕｅ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｓｈａｍ ｏｐｅｒａｔｅｄｇｒｏｕｐ，ｌｅｆｔｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒｅｎｄ ｄｉａｓｔｏｌｉｃｉｎｔｅｒｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒｓｅｐｔａｌｔｈｉｃｋｎｅｓｓ（ＩＶＳｄ），ｌｅｆｔｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒｅｎｄ ｓｙｓｔｏｌｉｃｉｎｔｅｒｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒｓｅｐｔａｌｔｈｉｃｋ ｎｅｓｓ（ＩＶＳｓ），ｌｅｆｔｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒｅｎｄ ｄｉａｓｔｏｌｉｃｐｏｓｔｅｒｉｏｒｗａｌｌｔｈｉｃｋｎｅｓｓ（ＬＶＰＷｄ）ａｎｄｌｅｆｔｖｅｂｔｒｉｃｕｌａｒｅｎｄ ｓｙｓｔｏｌｉｃｐｏｓｔｅｒｉｏｒｗａｌｌｔｈｉｃｋｎｅｓｓ（ＬＶＰＷｓ）ｉｎＴＡＣｍｏｄｅｌｇｒｏｕｐｗｅｒｅｉｎｃｒｅａｓｅｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ（Ｐ＜０．０５，Ｐ＜０．０１），ｌｅｆｔｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒｅｎｄ ｓｙｓｔｏｌｉｃｄｉａｍｅｔｅｒ（ＬＶＩＤｓ）ｗａｓｄｅｃｒｅａｓｅｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ（Ｐ＜０．０１），ＬＶＭａｓｓａｎｄＬＷ（ＬＶＭａｓｓ／Ｗｅｉｇｈｔ）ｗｅｒｅｉｎｃｒｅａｓｅｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ（Ｐ＜０．０５，Ｐ＜０．０１）．Ｔｈｅｌｅｖｅｌｓｏｆｈｅａｒｔｒａｔｅ（ＨＲ），ｌｅｆｔｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒｐｒｅｓｓｕｒｅｍａｘｉｍａｌｒａｔｅｏｆｒｉｓｅ（＋ｄｐ／ｄｔｍａｘ），ｌｅｆｔｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒｐｒｅｓｓｕｒｅｍａｘｉｍａｌｒａｔｅｏｆｆａｌｌ（ ｄｐ／ｄｔ ｍａｘ）ｗｅｒｅｄｅｃｒｅａｓｅｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ（Ｐ＜０．０１）．ＴｈｅｓｅｒｕｍｌｅｖｅｌｏｆＮＴ ｐｒｏＢＮＰｉｎＴＡＣｒａｔｗａｓｉｎｃｒｅａｓｅｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ（Ｐ＜０．０１）．ＴｈｅｍｙｏｃａｒｄｉａｌｃｅｌｌｓｉｎＴＡＣｍｏｄｅｌｇｒｏｕｐｗｅｒｅａｒｒａｎｇｅｄｄｉｓｏｒｄｅｒｌｙ，ｍｙｏｃａｒｄｉａｌｃｅｌｌｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ，ｃｙｔｏｐｌａｓｍｗｅｒｅｉｎｃｒｅａｓｅｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ，ａｎｄｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｃｅｌｌｓｉｎｆｉｌｔｒａｔｅｄ．ＡｌａｒｇｅａｍｏｕｎｔｏｆｃｏｌｌａｇｅｎｆｉｂｅｒｓｗｅｒｅｄｅｐｏｓｉｔｅｄａｎｄｌａｒｇｅａｒｅａｏｆｍｙｏｃａｒｄｉａｌｃｅｌｌｓｗｅｒｅｓｔａｉｎｅｄｂｌｕｅｉｎＴＡＣｒａｔ．Ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆｐｈｏｓｐｈｏ ｃ Ｒａｆ（Ｓｅｒ２５９）ａｎｄｐｈｏｓｐｈｏ ｃ Ｒａｆ（Ｓｅｒ３３８）ｉｎｍｙｏｃａｒｄｉａｌｔｉｓｓｕｅｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎ
３
３中国应用生理学杂志，２０２０，３６（１）
ｃｒｅａｓｅｄ（Ｐ＜０．０１），ｍｅａｎｗｈｉｌｅｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆｐｈｏｓｐｈｏ ＭＥＫ１／２（Ｓｅｒ２１７／Ｓｅｒ２２１）ａｎｄｐｈｏｓｐｈｏ ＥＲＫ１／２（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）ｗｅｒｅａｌｓｏｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎｃｒｅａｓｅｄ（Ｐ＜０．０１）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ＴｈｅｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｒｏｌｅｏｆＲａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫｐａｔｈｗａｙｉｎｃａｒｄｉａｃｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙｍａｙｂｅｔｈｒｏｕｇｈｔｈｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎｏｆｃ ｒａｆ，ＭＥＫ１，Ｍｅｋ２，ＥＲＫ１ａｎｄＥＲＫ２ａｔｓｐｅｃｉｆｉｃｓｉｔｅｓ．
【ＫＥＹＷＯＲＤＳ】　ｒａｔ；　Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫｐａｔｈｗａｙ；　ｃａｒｄｉａｃｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ；　ｔｒａｎｓｖｅｒｓｅａｏｒｔｉｃｃｏｎｓｔｒｉｃｔｉｏｎ；　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｍｅｃｈａｎｉｓｍ
【基金项目】浙江中医药大学科研基金项目（国家自然科学基金
预研专项，２０１８ＺＧ３５）；浙江省中医药优秀青年人才基金项目（２０２０ＺＱ０１７）【收稿日期】２０１９ ０９ ０９【修回日期】２０１９ １２ １１　△【
通讯作者】Ｔｅｌ：０５７１ ８６６３３３９８；Ｅ ｍａｉｌ：ｗｄｊ０３６９＠１２６．ｃｏｍ 心肌肥大是心肌细胞对多种病理刺激因子的一种应答方式，是心脏对前后负荷增加等多种病理状
态的适应性反应［１］。

当前，心肌肥大已被公认为心
衰、猝死等心血管疾病的主要致病因素，早期具有代偿意义，后期可导致严重的心律失常和心力衰
竭［２，３］。

因此深入研究心肌肥大的病理机制具有重
要的理论和临床意义。

心肌肥大其主要病理特征包括心肌细胞肥大、
心肌间质增殖以及心肌细胞外基质重建等［４，５］。

目
前对于心肌肥大的分子机制尚未完全阐明，近年来的研究显示，促分裂原活化蛋白激酶（ｍｉｔｏｇｅｎ ａｃｔｉ ｖａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅ，ＭＡＰＫ）信号通路的激活与心肌肥大密切相关，而加速纤维肉瘤／丝裂素活化蛋白激酶激酶／胞外信号调节蛋白激酶（ｒａｐｉｄｌｙａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄｆｉｂｒｏｓａｒｃｏｍａ／ｍｉｔｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅｋｉｎａｓｅ／ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｒｅｇｕｌａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅｓ，Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ）信号转导途径是ＭＡＰＫ通路中的核心环节，Ｒａｆ作为ＭＡＰ ＫＫＫ，ＭＥＫ作为ＭＡＰ ＫＫ，ＥＲＫ作为ＭＡＰＫ，３种蛋白激酶构成了蛋白激酶反应链也就是Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ信号通路在心肌肥大的发生发展过程中起关键作用
［２，６］
，但是Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ信号通路
如何被激活以及该通路在心肌肥大中发挥的作用机制尚不清楚。

本文通过ＴＡＣ法建立心肌肥大模型，观察心肌肥大大鼠中超声心动图、血流动力学、心脏组织病理学、Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ通路关键因子的ｍＲＮＡ水平、蛋白表达水平及其蛋白磷酸化修饰水平上的差异，明确Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ通路在心肌肥大中的调控机制。

１　材料与方法
１．１　实验动物
ＳＰＦ级雄性ＳＤ大鼠２０只，６～８周龄，体重２２０ｇ～２５０ｇ，由中国科学院上海实验动物中心／上海斯莱克实验动物有限公司提供，许可证号：ＳＣＸＫ（沪）２０１７ ０００５。

饲养于浙江中医药大学动物实验研究
中心［
ＳＹＸＫ（浙）２０１８ ００１２］，环境温度２２±２℃，相对湿度５０％～６０％，光照：１２ｈ／１２ｈ明暗交替，噪声＜５０ｄＢ；在ＩＶＣ笼内饲养，自由饮食。

所有实验步骤均严格按照中国关于实验动物使用和护理的立法进行，并经浙江中医药大学动物福利与伦理审查委员会批准，决议编号：ＩＡＣＵＣ ２０１８０７１６ １０。

１．２　主要试剂及仪器
大鼠一抗ｐｈｏｓｐｈｏｐｌｕｓｐ４４／４２ＭＡＰＫ（ＥＲＫ１／２）（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）ａｎｔｉｂｏｄｙＤｕｅｔ、ｐｈｏｓｐｈｏｐｌｕｓＭＥＫ１／２（Ｓｅｒ２１７／Ｓｅｒ２２１）ａｎｔｉｂｏｄｙＤｕｅｔ、ｐｈｏｓｐｈｏ ｃ Ｒａｆ（Ｓｅｒ３３８）ａｎｔｉｂｏｄｙ、ｐｈｏｓｐｈｏ ｃ Ｒａｆ（Ｓｅｒ２５９）ａｎｔｉ ｂｏｄｙ、ｃ Ｒａｆａｎｔｉｂｏｄｙ抗体均购自美国ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ公司，内参ＧＡＰＤＨ抗体购自华安生物有限公司；ＯｄｙｓｓｅｙＩＲＤｙｅ６８０ＲＤ或ＩＲＤｙｅ７８０ＣＷ近红外荧光染料标记的羊抗兔二抗、羊抗鼠二抗均购自Ｌ
Ｉ ＣＯＲ公司，ＲＮＡｉｓｏｐｌｕｓ总ＲＮＡ提取试剂盒、ＲＴ ＰＣＲ反转录试剂盒、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ荧光定量试剂均购自Ｔ
ａＫａＲａ。

全蛋白提取试剂盒、ＢＣＡ蛋白含量检测试剂盒购自江苏凯基生物技术股份有限公司。

氨基末端脑钠肽前体（ＮｔｅｒｍｉｎａｌｐｒｏＢｔｙｐｅｎａｔｒｉ ｕｒｅｔｉｃｐｅｐｔｉｄｅ，ＮＴ ｐｒｏＢＮＰ）ＥＬＩＳＡ检测试剂盒，购自南京建成生物工程研究有限公司。

Ｍａｓｓｏｎ三色染色液购自珠海贝索生物技术有限公司，苏木色精购自上海伯奥生物科技有限公司。

小动物麻醉呼吸机（美国Ｈａｌｌｏｗｅｌｌ公司）；Ｖｅ ｖｏ２１００小动物超声影像系统（加拿大ＶｉｓｕａｌＳｏｎｉｃｓ公司）；ＡＬＣ—ＮＩＢＰ（８道）无创血压测定系统（上海奥尔科特生物科技有限公司）；Ｐｒｅｃｅｌｌｙｓ２４生物样品匀质机（法国Ｂｅｒｔｉｎ公司）；荧光定量ＰＣＲ仪（ＡＢＩＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ），Ｗｅｓｔｅｒｎ电泳及转膜系统（美国ＢＩＯ ＲＡＤ公司），近红外激光成像系统（美国ＬＩ ＣＯＲ）；Ｎａｎｏ ｄｒｏｐ微量核酸测定仪、ＶａｒｉｏｓｋａｎＦｌａｓｈ多功能酶标仪、冷冻台式离心机均购自美国Ｔｈｅｒｍｏ公司；ＡＳＰ２００Ｓ封闭式组织脱水机、包埋机均购自德国Ｍ
ｉｃｒｏｍ公司，半自动石蜡切片机、自动染色机均购自德国Ｍ
ｉｃｒｏｍ公司，数字病理切片（荧光）扫描分析仪（日本Ｏｌｙｍｐｕｓ公司）。

１．３　主动脉弓狭窄手术建立大鼠心肌肥大模型
雄性ＳＤ大鼠适应性饲养１周后，取１０只行主动脉弓狭窄手术（ｔｒａｎｓｖｅｒｓｅａｏｒｔｉｃｃｏｎｓｔｒｉｃｔｉｏｎ，
４３ＣｈｉｎＪＡｐｐｌＰｈｙｓｉｏｌ，２０２０，３６（１）
ＴＡＣ）。

术前禁食１０～１２ｈ（不禁水），将大鼠麻醉后，剃毛并固定于４５°斜式固定台，进行气管插管，将大鼠固定于保温台，接小动物麻醉呼吸机。

碘伏消毒术区，从大鼠左侧第二根肋骨处逐层开胸，撑开器撑开切口，依次分离胸腺、主动脉弓，用３ ０号线绕过主动脉弓后壁，从头臂干和左颈总动脉之间探出。

将外径为０．９ｍｍ的自制“Ｌ”型针平行置于主动脉弓上方，结扎后缓慢取出“Ｌ”型针，逐层关胸，碘伏消毒切口，将大鼠放入保温箱待其苏醒。

术后３ｄ肌注１０５Ｕ青霉素，并每天观察动物状况。

另取１０只大鼠行假手术，手术步骤相同但不缩窄主动脉弓。

１．４　大鼠超声心动图测定
术后１２周，将大鼠进行异氟烷吸入麻醉后，仰卧固定，用高分辨率小动物超声影像系统，在二尖瓣腱索水平记录Ｍ型超声心动图，分别测量左室舒张末期室间隔厚度（ｌｅｆｔｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒｅｎｄ ｄｉａｓｔｏｌｉｃｉｎｔｅｒ ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒｓｅｐｔａｌｔｈｉｃｋｎｅｓｓ，ＩＶＳｄ）、左室收缩末期室间隔厚度（ｌｅｆｔｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒｅｎｄ ｓｙｓｔｏｌｉｃｉｎｔｅｒｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒｓｅｐｔａｌｔｈｉｃｋｎｅｓｓ，ＩＶＳｓ）、左室舒张末期内径（ｌｅｆｔｖｅｎ ｔｒｉｃｕｌａｒｅｎｄ ｄｉａｓｔｏｌｉｃｄｉａｍｅｔｅｒ，ＬＶＩＤｄ）、左室收缩末期内径（ｌｅｆｔｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒｅｎｄ ｓｙｓｔｏｌｉｃｄｉａｍｅｔｅｒ，ＬＶＩＤｓ）、左室后壁舒张末期厚度（ｌｅｆｔｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒｅｎｄ ｄｉａｓｔｏｌｉｃｐｏｓｔｅｒｉｏｒｗａｌｌｔｈｉｃｋｎｅｓｓ，ＬＶＰＷｄ）、左室后壁收缩末期厚度（ｌｅｆｔｖｅｂｔｒｉｃｕｌａｒｅｎｄ ｓｙｓｔｏｌｉｃｐｏｓｔｅ ｒｉｏｒｗａｌｌｔｈｉｃｋｎｅｓｓ，ＬＶＰＷｓ）、左心室收缩末期容积（ｌｅｆｔｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒｅｎｄｓｙｓｔｏｌｉｃｖｏｌｕｍｅ，ＬＶＥＳＶ）、左心室舒张末期容积（ｌｅｆｔｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒｅｎｄｄｉａｓｔｏｌｉｃｖｏｌｕｍｅ，ＬＶＥＤＶ）、左心室质量（ｌｅｆｔｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒｍａｓｓ，ＬＶＭａｓｓ），计算射血分数（ｅｊｅｃｔｉｏｎｆｒａｃｔｉｏｎ，ＥＦ）、短轴率（ｆｒａｃｔｉｏｎｓｈｏｒｔｅｎｉｎｇ，ＦＳ）、左心系数ＬＷ（ＬＶＭａｓｓ／ｗｅｉｇｈｔ），测量连续３个心动周期的各指标并取平均值。

１．５　大鼠血流动力学测定
腹腔注射２０％乌拉坦麻醉大鼠（５ｍｇ／ｋｇ），固定大鼠进行插管。

微型导管充满含肝素的生理盐水（５００Ｕ／ｍｌ），排除气泡后连接压力换能器和生理信号记录仪。

碘伏消毒颈部被毛，自颈中线切开皮肤，使用镊子与止血钳钝性分离颈部肌肉，暴露右颈总动脉。

使用缝线和动脉夹分别结扎颈部动脉的远心端与近心端，动脉夹下方需结扎活结防止插管时大出血。

用微型剪剪出一“Ｖ”形开口，向近心端仔细轻柔插入微型导管，松开动脉夹使微型导管继续插入直至左心室。

稳定５ｍｉｎ后，再测量心率（ｈｅａｒｔｒａｔｅ，ＨＲ）、左室舒张末期压（ｌｅｆｔｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒｅｎｄ ｄｉ ａｓｔｏｌｉｃｐｒｅｓｓｕｒｅ，ＬＶＥＤＰ）、左室收缩末期压（ｌｅｆｔｖｅｎ ｔｒｉｃｕｌａｒｅｎｄ ｓｙｓｔｏｌｉｃｐｒｅｓｓｕｅ，ＬＶＥＳＰ）、左心室最大收缩速率（ｌｅｆｔｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒｐｒｅｓｓｕｒｅｍａｘｉｍａｌｒａｔｅｏｆｒｉｓｅ， ｄｐ／ｄｔｍａｘ）、左心室最大舒张速率（ｌｅｆｔｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒｐｒｅｓｓｕｒｅｍａｘｉｍａｌｒａｔｅｏｆｆａｌｌ， ｄｐ／ｄｔｍａｘ）等血流动力学指标。

１．６　大鼠血清ＮＴ ｐｒｏＢＮＰ含量测定
大鼠进行颌下静脉取血，分离血清备用，采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附法（ＥＬＩＳＡ）检测各组大鼠血清中ＮＴ ｐｒｏＢＮＰ的含量。

１．７　大鼠心脏病理学观察
取大鼠心肌组织，进行常规ＨＥ和Ｍａｓｓｏｎ染色。

将各组大鼠心肌组织，置于１０％中性甲醛溶液中固定２ｄ后，蒸馏水冲洗，经脱水，透明，浸蜡，常规石蜡包埋切片，每个样品制片两份，一份用于ＨＥ染色，另一份用于Ｍａｓｓｏｎ染色。

经二甲苯脱水，ＨＥ染色，２００倍光学显微镜下观察心脏病理学改变。

大鼠心肌组织石蜡切片置于６０℃烘箱１５ｍｉｎ脱蜡，ｗｅｉｇｅｒｔ铁苏木素染１０ｍｉｎ，１％盐酸分化１５ｓ，流水冲洗数分钟，丽春红酸性品红染液染１０ｍｉｎ，流水稍冲洗，磷钼酸溶液处理５ｍｉｎ，苯胺蓝染液复染１５ｍｉｎ，蒸馏水冲洗，１％冰醋酸分化３０ｓ，无水酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封固，用数字病理切片（荧光）扫描分析仪进行分析，观察心肌肥大等情况。

１．８　Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ通路的关键因子ｍＲＮＡ水平的测定
各组大鼠心肌组织，用Ｔｒｉｚｏｌ提取总ＲＮＡ，提取的总ＲＮＡ浓度和纯度用Ｎａｎｏｄｒｏｐ２０００微量核酸测定仪测定后，用逆转录试剂盒ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭＲＴｒｅａ ｇｅｎｔ逆转录为ｃＤＮＡ，将ｃＤＮＡ用实时荧光定量ＰＣＲ仪进行ＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ扩增，所有反应信息资料由ＡＢＩＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓＰＣＲ仪收集，以内参照作为标准进行相对定量，采用２ △△ＣＴ法计算大鼠心肌组织中ｃ Ｒａｆ、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２、ＥＲＫ１和ＥＲＫ２ｍＲＮＡ相对表达水平。

大鼠ｃ Ｒａｆ、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２、ＥＲＫ１、ＥＲＫ２和管家基因ＧＡＰＤＨ荧光定量ＰＣＲ引物序列均由生工生物工程（上海）有限公司设计并合成，各引物序列见表１。

１．９　Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ通路的关键因子总蛋白表达水平和磷酸化蛋白表达水平的测定
将大鼠心肌组织低温均质机匀浆裂解，用蛋白提取试剂盒提取总蛋白，样品浓度用蛋白含量检测试剂盒测定（ＢＣＡ法）后，加入５×ＳＤＳ变性剂，煮沸变性，ＳＤＳ ＰＡＧＥ凝胶分离，采用恒压湿转方法，１２０
５
３
中国应用生理学杂志，２０２０，３６（１）
Ｖ，转膜２ｈ，将凝胶上的蛋白条带转移到醋酸纤维素膜（ＮＣ膜）上。

ＮＣ膜在３％ＢＳＡ溶液中室温慢摇封闭２ｈ后，分别与ｃ Ｒａｆ、ＭＥＫ１／２、ＥＲＫ１／２总蛋白抗体４℃孵育过夜。

ＴＢＳＴ洗涤５次后，用ＩＲＤｙｅ６８０ＲＤ近红外荧光染料标记的二抗室温孵育１．５ｈ，用ＴＢＳＴ洗涤５次后，将ＮＣ膜在Ｏｄｙｓｓｅｙ近红外双色激光成像系统上扫描。

采集图像并进行蛋白定量分析，检测大鼠心肌组织中ｃ Ｒａｆ、ＭＥＫ１／２、ＥＲＫ１／２总蛋白的表达水平。

Ｔａｂ．１　ＰｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅｓｆｏｒｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲ
ｍＲＮＡｎａｍｅＴｈｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆｐｒｉｍｅｒｓｃ ＲａｆＦ５’ ＡＣＴＧＴＧＧＴＣＡＡＴＧＴＧＣＧＧＡＡＴＧＧ ３’
Ｒ５’ ＣＧＧＣＧＴＣＧＧＴＧＴＴＣＣＡＡＴＣＴＡＡＧ ３’
ＭＥＫ１Ｆ５’ ＧＧＡＴＧＡＧＣＡＧＣＡＧＣＧＧＡＡＧＣ ３’
Ｒ５’ ＡＣＣＴＴＧＡＡＣＡＣＣＡＣＴＣＣＡＣＣＡＴＴＧ ３’
ＭＥＫ２Ｆ５’ ＧＣＴＧＴＣＣＧＣＡＡＣＣＡＧＡＴＣＡＴＣＣ ３’
Ｒ５’ ＴＣＴＣＧＣＣＧＴＣＧＣＴＧＴＡＧＡＡＧＧ ３’
ＥＲＫ１Ｆ５’ ＣＧＣＡＡＧＡＣＣＡＧＡＧＴＧＧＣＴＡＴＣＡＡＧ ３’
Ｒ５’ ＴＣＣＧＴＣＴＣＣＡＴＧＡＧＧＴＣＣＴＧＡＡＣ ３’
ＥＲＫ２Ｆ５’ ＴＧＡＡＧＡＣＡＣＡＧＣＡＣＣＴＣＡＧＣＡＡＴＧ ３’
Ｒ５’ ＧＧＴＧＴＴＣＡＧＣＡＧＧＡＧＧＴＴＧＧＡＡＧ ３’
ＧＡＰＤＨＦ５’ ＧＧＣＡＣＡＧＴＣＡＡＧＧＣＴＧＡＧＡＡＴＧ ３’
Ｒ５’ ＡＴＧＧＴＧＧＴＧＡＡＧＡＣＧＣＣＡＧＴＡ ３’
将已转移蛋白的ＮＣ膜与ｐｈｏｓｐｈｏ ｃ Ｒａｆ（Ｓｅｒ３３８）、ｐｈｏｓｐｈｏ ｃ Ｒａｆ（Ｓｅｒ２５９）、ｐｈｏｓｐｈｏ ＭＥＫ１／２（Ｓｅｒ２１７／Ｓｅｒ２２１）、ｐｈｏｓｐｈｏ ＥＲＫ１／２（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）磷酸化抗体４℃孵育过夜。

ＴＢＳＴ洗涤５次后，用ＩＲＤｙｅ７８０ＣＷ近红外荧光染料标记的二抗室温孵育１．５ｈ，用ＴＢＳＴ洗涤５次后，近红外双色激
光成像系统进行扫描，检测大鼠心肌组织中磷酸化蛋白ｐｈｏｓｐｈｏ ｃ Ｒａｆ、ｐｈｏｓｐｈｏ ＭＥＫ１／２、ｐｈｏｓｐｈｏ ＥＲＫ１／２的表达水平。

１．１０　统计学处理
实验数据用ＳＰＳＳ１１．０软件进行统计分析，结果均采用以均数±标准差（珋ｘ±ｓ）表示，组间比较采用Ｏｎｅ ｗａｙＡＮＯＶＡ（ｐｏｓｔｈｏｃ）。

２　结果
２．１　心肌肥大大鼠的超声心动图变化
从图１和表２可以看出，与假手术组大鼠比较，ＴＡＣ模型组大鼠的ＩＶＳｄ、ＩＶＳｓ、ＬＶＰＷｄ、ＬＶＰＷｓ显著增厚（Ｐ＜０．０５，Ｐ＜０．０１），ＬＶＩＤｓ显著减小（Ｐ＜０．０１），根据ＬＶＭａｓｓ计算得到左心系数ＬＷ（ＬＶＭａｓｓ／体重），发现ＬＶＭａｓ和ＬＷ均显著增加（Ｐ＜０．０５，Ｐ＜０．０１），ＬＶＩＤｄ、ＬＶＥＤＶ和ＬＶＥＳＶ均呈不同程度的降低，但是无统计学差异（Ｐ＞０．０５），计算值ＥＦ、ＦＳ无统计学差异（Ｐ＞０．０５）。

Ｆｉｇ．１　ＥｃｈｏｃａｒｄｉｏｇｒａｐｈｙｏｆｓｈａｍａｎｄＴＡＣｒａｔｓ
Ａ：Ｓｈａｍｇｒｏｕｐ；Ｂ：ＴＡＣｍｏｄｅｌｇｒｏｕｐ
Ｔａｂ．２　ＴｈｅｃａｒｄｉａｃｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｐａｒａｍｅｔｅｒｓｏｆｓｈａｍａｎｄＴＡＣｍｏｄｅｌｒａｔｓ（珋
ｘ±ｓ，ｎ＝１０）ＧｒｏｕｐＩＶＳｄ（ｍｍ）ＩＶＳｓ（ｍｍ）ＬＶＩＤｄ（ｍｍ）ＬＶＩＤｓ（ｍｍ）ＬＶＰＷｄ（ｍｍ）ＬＶＰＷｓ（ｍｍ）ＥＦ（％）ＦＳ（％）ＬＶＥＤＶ（ｍｌ）ＬＶＥＳＶ（ｍｌ）ＬＶＭａｓｓ（ｍｇ）ＬＷ（ｍｇ／ｇ）
Ｓｈａｍ２．０６±０．２３２．９８±０．３１７．８８±０．３９５．２４±０．５９２．４５±０．１６３．３６±０．２６７１．３４±６．９４４２．５７±５．７９３７５．７７±２７．４９１０５．６１±２８．３５１１９３．２７±１３３．１５２．２９±０．２０
ＴＡＣ２．４８±０．２１ ３．９３±０．４２ ７．８１±０．７１４．３３±０．５６ ２．９９±０．４９ ４．２１±０．４４ ７４．６９±８．５９４５．７０±７．４４３３０．００±４４．１３７２．１０±２１．３０１６６１．７７±２４１．４７ ３．０８±０．５７
ＩＶＳｄ：Ｌｅｆｔｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒｅｎｄ－ｄｉａｓｔｏｌｉｃｉｎｔｅｒｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒｓｅｐｔａｌｔｈｉｃｋｎｅｓｓ；ＩＶＳｓ：Ｌｅｆｔｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒｅｎｄ－ｓｙｓｔｏｌｉｃｉｎｔｅｒｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒｓｅｐｔａｌｔｈｉｃｋｎｅｓｓ；ＬＶＩＤｄ：Ｌｅｆｔｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒｅｎｄ－ｄｉａｓｔｏｌｉｃｄｉａｍｅｔｅｒ；ＬＶＩＤｓ：Ｌｅｆｔｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒｅｎｄ－ｓｙｓｔｏｌｉｃｄｉａｍｅｔｅｒ；ＬＶＰＷｄ：Ｌｅｆｔｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒｅｎｄ－ｄｉａｓｔｏｌｉｃｐｏｓｔｅｒｉｏｒｗａｌｌｔｈｉｃｋｎｅｓｓ；ＬＶＰＷｓ：Ｌｅｆｔｖｅｂｔｒｉｃｕｌａｒｅｎｄ－ｓｙｓｔｏｌｉｃｐｏｓｔｅｒｉｏｒｗａｌｌｔｈｉｃｋｎｅｓｓ；ＥＦ：Ｅｊｅｃｔｉｏｎｆｒａｃｔｉｏｎ；ＦＳ：Ｆｒａｃｔｉｏｎｓｈｏｒｔｅｎｉｎｇ；ＬＶＥＤＶ：Ｌｅｆｔｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒｅｎｄｄｉａｓｔｏｌｉｃｖｏｌｕｍｅ；ＬＶＥＳＶ：Ｌｅｆｔｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒｅｎｄｓｙｓｔｏｌｉｃｖｏｌｕｍｅ；ＬＶＭａｓｓ：Ｌｅｆｔｖｅｎ ｔｒｉｃｕｌａｒｍａｓｓ；ＬＷ：ＬＶＭａｓｓ／Ｗｅｉｇｈｔ
Ｐ＜０．０５， Ｐ＜０．０１ｖｓｔｈｅｓｈａｍｇｒｏｕｐ
２．２　心肌肥大大鼠的血流动力学变化和血清ＮＴ ｐｒｏＢＮＰ的变化
与假手术组大鼠比，ＴＡＣ模型组大鼠的ＨＲ、 ｄｐ／ｄｔｍａｘ、 ｄｐ／ｄｔｍａｘ均显著降低（Ｐ＜０．０１），
ＬＶＥＳＰ、ＬＶＥＤＰ无显著差异（表３）。

从表３中看出，ＴＡＣ模型组大鼠血清中ＮＴ ｐｒｏＢＮＰ含量显著增加（Ｐ＜０．０１）。

Ｔａｂ．３　ＴｈｅｌｅｆｔｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒｆｕｎｃｔｉｏｎａｎｄｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆＮＴ ｐｒｏＢＮＰｉｎｓｈａｍａｎｄＴＡＣｍｏｄｅｌｒａｔｓ（珋
ｘ±ｓ，ｎ＝１０）ＧｒｏｕｐＨＲ（ｂｅａｔｓ／ｍｉｎ）ＬＶＥＳＰ（ｍｍＨｇ）ＬＶＥＤＰ
（ｍｍＨｇ） ｄ
ｐ／ｄｔｍａｘ（ｍｍＨｇ／ｓ） ｄｐ／ｄｔｍａｘ（ｍｍＨｇ／ｓ）ＮＴ ｐｒｏＢＮＰ
（ｐｇ／ｍｌ）Ｓｈａｍ４２５．７５±１２．３７１６６．６９±７．６０９．８３±２．５３
１１２９９．７３±７１２．４０６３６３．８９±５６２．３３
７５８．９０±１０６．３５
ＴＡＣ
３８６．６３±１９．５０
１
６８．８９±３１．２３８．２１±２．６３７７１６．７４±１１８０．６３ ４８２６．７０±１０７７．１６
１２２７．８７±１９０．９４
ＨＲ：Ｈｅａｒｔｒａｔｅ；ＬＶＥＳＰ：Ｌｅｆｔｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒｅｎｄ－ｓｙｓｔｏｌｉｃｐｒｅｓｓｕｒｅ；ＬＶＥＤＰ：Ｌｅｆｔｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒｅｎｄ－ｄｉａｓｔｏｌｉｃｐｒｅｓｓｕｒｅ； ｄｐ／ｄｔｍａｘ：Ｌｅｆｔｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒｐｒｅｓｓｕｒｅｍａｘｉｍａｌｒａｔｅｏｆｒｉｓｅ； ｄｐ／ｄｔｍａｘ：Ｌｅｆｔｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒｐｒｅｓｓｕｒｅｍａｘｉｍａｌｒａｔｅｏｆｆａｌｌ；ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰ：ＮｔｅｒｍｉｎａｌｐｒｏＢｔｙｐｅｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃｐｅｐｔｉｄｅ
Ｐ＜０．０１ｖｓｔｈｅｓｈａｍｇｒｏｕｐ６３ＣｈｉｎＪＡｐｐｌＰｈｙｓｉｏｌ，２０２０，３６（１）
２．３　心肌肥大大鼠心肌组织病理学变化
对大鼠的心肌组织进行ＨＥ和Ｍａｓｓｏｎ染色，观察大鼠心肌细胞肥大、炎症浸染、心肌纤维化等情况。

ＨＥ染色显示，假手术组的心肌细胞排列整齐清晰，细胞形态正常，心肌细胞之间有薄层结缔组织，ＴＡＣ模型组心肌细胞排列杂乱，心肌细胞肥大、胞质明显增多，心肌细胞之间无明显界限，心肌纤维外的成纤维细胞增多，炎症细胞浸润（图２Ａ、Ｂ）。

通过Ｍａｓｓｏｎ染色可见，假手术组心肌组织中未见胶原纤维着色，ＴＡＣ模型组大鼠心肌细胞出现大量胶原纤维沉积，大面积心肌细胞呈现蓝色（图２Ｃ、Ｄ）。

２．４　心肌肥大大鼠Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ通路的关键因子ｍＲＮＡ和蛋白水平的变化
从表４可见，与假手术组相比，ＴＡＣ模型组大鼠心肌组织中ｃ Ｒａｆ、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２、ＥＲＫ１、ＥＲＫ２ｍＲ ＮＡ水平变化无显著差异（Ｐ＞０．０５）；从表５，图３中可以观察到，ＴＡＣ模型组大鼠心肌组织中ｃ Ｒａｆ、ＭＥＫ１／２、ＥＲＫ１／２蛋白表达水平也无显著变化（Ｐ＞０．０５）。

Ｆｉｇ．２　ＴｈｅｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｎｇｅｓｉｎｔｈｅｍｙｏｃａｒｄｉｕｍｏｆｓｈａｍａｎｄＴＡＣｍｏｄｅｌｒａｔｓ（ＨＥａｎｄＭａｓｓｏｎ’ｓｓｔａｉｎｉｎｇ×４００）
Ａ：Ｓｈａｍｇｒｏｕｐ（ＨＥ）；Ｂ：ＴＡＣｇｒｏｕｐ（ＨＥ）；Ｃ：Ｓｈａｍｇｒｏｕｐ（Ｍａｓｓｏｎ）；Ｄ：ＴＡＣｇｒｏｕｐ（Ｍａｓｓｏｎ）
Ｔａｂ．４　ＦｏｌｄｃｈａｎｇｅｓｏｆｍＲＮＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆｃ Ｒａｆ，ＭＥＫ１，ＭＥＫ２，ＥＲＫ１
ａｎｄＥＲＫ２ｉｎｔｈｅｍｙｏｃａｒｄｉｕｍｏｆＴＡＣｒａｔｓｖｓｓｈａｍｒａｔｓ（珋ｘ±ｓ，ｎ＝１０）
Ｇｒｏｕｐｃ ＲａｆＭＥＫ１ＭＥＫ２ＥＲＫ１ＥＲＫ２
Ｓｈａｍ１．００６±０．１２０１．０１３±０．１７６１．０１８±０．１９７１．０１４±０．１８２１．００５±０．１０５ＴＡＣ１．１６０±０．２３３１．３４５±０．３９２１．３１５±０．３９６１．２２４±０．３１３１．２２５±０．３５９
Ｔａｂ．５　Ｆｏｌｄｃｈａｎｇｅｓｏｆｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆｃ Ｒａｆ，ＭＥＫ１／２ａｎｄＥＲＫ１／２ｉｎｔｈｅｍｙｏｃａｒｄｉｕｍｏｆＴＡＣｒａｔｓｖｓｓｈａｍ
ｒａｔｓ（珋ｘ±ｓ，ｎ＝１０）
Ｇｒｏｕｐｃ ＲａｆＭＥＫ１／２ＥＲＫ１／２
Ｓｈａｍ１．０００±０．０００１．０００±０．０００１．０００±０．０００
ＴＡＣ１．０２６±０．２８５１．０５４±０．２９００．９９６±０．１８８
Ｆｉｇ．３　ＴｈｅＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｂａｎｄｓｏｆｃ Ｒａｆ，ＭＥＫ１／２ａｎｄＥＲＫ１／２ｉｎｔｈｅｍｙｏｃａｒｄｉｕｍｏｆｓｈａｍａｎｄＴＡＣｍｏｄｅｌｒａｔｓ２．５　心肌肥大大鼠Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ通路的关键因子磷酸化蛋白表达水平的变化
分别检测了ｃ Ｒａｆ蛋白在Ｓｅｒ２５９和Ｓｅｒ３３８位点上的磷酸化水平，结果发现，ＴＡＣ模型组大鼠心肌组织中磷酸化蛋白ｐｈｏｓｐｈｏ ｃ Ｒａｆ（Ｓｅｒ２５９）和ｐｈｏｓｐｈｏ ｃ Ｒａｆ（Ｓｅｒ３３８）的表达水平显著升高（Ｐ＜０．０１），我们进一步检测了ｃ Ｒａｆ的下游ＭＥＫ１、ＭＥＫ２及ＥＲＫ１、ＥＲＫ２蛋白的磷酸化水平，结果发现，ＴＡＣ模型组大鼠心肌组织中磷酸化蛋白ｐｈｏｓ ｐｈｏ ＭＥＫ１／２（Ｓｅｒ２１７／Ｓｅｒ２２１）和ｐｈｏｓｐｈｏ ＥＲＫ１／２（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ
２０４）的表达水平均显著增高（Ｐ＜０．０１，
表６，图４）。

Ｔａｂ．６　Ｆｏｌｄｃｈａｎｇｅｓｏｆｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆｐｈｏｓｐｈｏ ｃ Ｒａｆ（Ｓｅｒ２５９），ｐｈｏｓｐｈｏ ｃ Ｒａｆ（Ｓｅｒ３３８），ｐｈｏｓｐｈｏ ＭＥＫ１／２，ｐｈｏｓｐｈｏ ＥＲＫ１／２ｐｒｏｔｅｉｎｉｎｔｈｅｍｙｏｃａｒｄｉｕｍｏｆＴＡＣｒａｔｓｖｓｓｈａｍｒａｔｓ（珋ｘ±ｓ，ｎ＝１０）
Ｇｒｏｕｐｐｈｏｓｐｈｏ ｃ Ｒａｆ（Ｓｅｒ２５９）ｐｈｏｓｐｈｏ ｃ Ｒａｆ（Ｓｅｒ３３８）ｐｈｏｓｐｈｏ ＭＥＫ１／２ｐｈｏｓｐｈｏ ＥＲＫ１／２
Ｓｈａｍ１．０００±０．０００１．０００±０．０００１．０００±０．０００１．０００±０．０００
ＴＡＣ２．７４２±０．７３７ ３．７３３±０．８２４ １．５２４±０．２８７ ２．７４６±０．５３７
Ｐ＜０．０１ｖｓｔｈｅｓｈａｍｇｒｏｕｐ
Ｆｉｇ．４　ＴｈｅＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｂａｎｄｓｏｆｐｈｏｓｐｈｏ ｃ Ｒａｆ（Ｓｅｒ２５９），
ｐｈｏｓｐｈｏ ｃ Ｒａｆ（Ｓｅｒ３３８），ｐｈｏｓｐｈｏ ＭＥＫ１／２，ｐｈｏｓｐｈｏ
ＥＲＫ１／２ｉｎｔｈｅｍｙｏｃａｒｄｉｕｍｏｆｓｈａｍａｎｄＴＡＣｍｏｄｅｌｒａｔｓ
Ｐ＜０．０１ｖｓｔｈｅｓｈａｍｇｒｏｕｐ
３　讨论
ＴＡＣ致左心室肥厚模型是一种较为理想的心
肌肥大动物模型，造模时间可控，存活率较高，且
ＴＡＣ诱发的左室肥厚病理生理与人类情况较为一
致［７，８］。

在评价心肌肥大动物模型中，左心系数ＬＷ
（左心室重量与体重比例）是判定心肌肥大的一个
７
３
中国应用生理学杂志，２０２０，３６（１）
重要指标，ＬＷ越大，心肌肥厚状况越明显［９，１０］。

本研究中，大鼠行ＴＡＣ术后１２周，通过超声心电图发现ＴＡＣ模型组大鼠的左心室系数ＬＷ、ＬＶＭａｓｓ均显著增加，同时ＩＶＳｄ、ＩＶＳｓ、ＬＶＰＷｄ和ＬＶＰＷｓ等左室壁厚度等指标均显著增厚，提示通过ＴＡＣ术已成功建立心肌肥大模型。

ＮＴ ｐｒｏＢＮＰ来源于心室的心肌细胞，以ｐｒｏ ＢＮＰ的形式存在于心肌细胞的分泌颗粒中，其释放与心室扩张和压力超负荷相关联，当心室壁的压力发生变化时，ｐｒｏ ＢＮＰ裂解为ＮＴ ｐｒｏＢＮＰ和ＢＮＰ［１１］。

因此，ＮＴ ｐｒｏＢＮＰ与心脏的收缩舒张功能密切相关，现作为心脏功能不全的标志物［１２］。

血流动力学中的＋ｄｐ／ｄｔｍａｘ、 ｄｐ／ｄｔｍａｘ分别反映了心脏收缩和舒张功能。

本研究发现，ＴＡＣ心肌肥大模型大鼠出现心功能受损的症状，具体表现在ＴＡＣ大鼠血清中ＮＴ ｐｒｏＢＮＰ含量显著升高，且血流动力学指标ＨＲ、 ｄｐ／ｄｔｍａｘ、 ｄｐ／ｄｔｍａｘ均显著降低。

同时从病理ＨＥ和Ｍａｓｓｏｎ染色结果来看，ＴＡＣ模型组大鼠出现心肌细胞肥大、胞质明显增多、心肌纤维外的成纤维细胞增多、炎症细胞浸润、大量胶原纤维沉积的现象，符合病理性心肌肥大的特征。

丝裂原活化的蛋白激酶ＭＡＰＫ信号转导途径，将细胞外刺激信号转导至细胞及核内，对心肌细胞肥大的发生发展起到重要作用［１３］。

Ｒａｆ是一类丝氨酸苏氨酸蛋白激酶，属于ＭＡＰＫ通路中的信号转导级联的第一步，当心肌细胞面临压力刺激或ＧＰＣＲ激动剂时则会导致小Ｇ蛋白的激活如Ｒａｓ、Ｒａｆ，激活后的Ｒａｆ进而活化下游相应的ＭＥＫ［１４］。

ＥＲＫ１和ＥＲＫ２是ＭＥＫ１和ＭＥＫ２对应的下游底物，ＥＲＫ１和ＥＲＫ２被磷酸化激活后由细胞质移位到细胞核内，并最终引起一系列的细胞质、细胞核调节蛋白参与心肌肥大过程中，发挥生物学效应［６，１５］。

本次研究，我们分别检测了Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ通路关键因子的ｍＲＮＡ转录水平、蛋白表达水平和磷酸化水平，实验中发现，与假手术组相比，ＴＡＣ模型组大鼠心肌组织中Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ通路关键因子ｃ Ｒａｆ、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２、ＥＲＫ１和ＥＲＫ２在ｍＲＮＡ水平和蛋白表达水平上均无显著变化，但是ｃ Ｒａｆ蛋白在Ｓｅｒ２５９和Ｓｅｒ３３８位点上的磷酸化蛋白ｐｈｏｓｐｈｏ ｃ Ｒａｆ（Ｓｅｒ２５９）和ｐｈｏｓｐｈｏ ｃ Ｒａｆ（Ｓｅｒ３３８）在ＴＡＣ模型组大鼠心肌组织中的表达水平显著升高，并且ｃ Ｒａｆ的下游蛋白ＭＥＫ１／２及ＥＲＫ１／２的磷酸化水平均显著增高。

由此我们推断Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ通路在心肌肥大中的调控机制可能为：大鼠进行主动脉弓缩窄手术后，形成压力超负荷心肌肥大模型，ＴＡＣ大鼠心肌细胞内的ｃ Ｒａｆ蛋白激酶在压力负荷的刺激下在Ｓｅｒ２５９和Ｓｅｒ３３８位点被磷酸化而激活，它的Ｃ端催化区与ＭＥＫ结合，从而激活下游相应的ＭＥＫ１／２的Ｓｅｒ２１７／Ｓｅｒ２２１磷酸化位点，活化的磷酸化蛋白ＭＥＫ１／２（Ｓｅｒ２１７／Ｓｅｒ２２１）表达水平增高，进而磷酸化并激活其下游底物ＥＲＫ１／２蛋白的苏氨酸／酪氨酸残基（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４），导致磷酸化蛋白ＥＲＫ１／２（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）表达水平大幅上升，被磷酸化激活的ＥＲＫ１／２由细胞质移位到细胞核内，引起下游相关肥大分子表达从而促进了心肌肥大的发生以及后期的心功能受损。

根据以上结果，我们得出结论，Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ通路在心肌肥大中的调控作用，可能通过激活关键因子ｃ Ｒａｆ、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２、ＥＲＫ１和ＥＲＫ２特异性位点的磷酸化，而非通过调节Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ通路关键因子的基因和蛋白表达来实现。

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ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃｄｒｕｇ，ｍａｙａｔｔｅｎｕａｔｅｃａｒｄｉａｃｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙｖｉａｔａｒｇｅｔｉｎｇｔｈｅｅｒｋｐａｔｈｗａｙ［Ｊ］．ＰＬｏＳＯｎｅ，２０１６，１１（７）：ｅ０１５９０７９．
早期跑步运动对大鼠脑缺血／再灌注损伤后神经行为与神经元凋亡的影响
彭志锋１△
，张继红１，杨德兵２
（１．山西大同大学医学院生理教研室，２．解剖教研室，山西大同０３７００９）
【摘要】　目的：探讨早期跑步运动对大鼠脑缺血后神经行为与神经元凋亡的影响。

方法：雄性ＳＤ大鼠随机分为４组：假手术＋安静组（Ｓｈａｍ Ｓｔ、假手术＋运动组（Ｓｈａｍ Ｅｘ）、缺血（大脑中动脉闭塞（ＭＣＡＯ）＋运动组（（ＭＣＡＯ Ｅｘ）和缺血＋安静组（ＭＣＡＯ Ｓｔ），每组１５只。

ＭＣＡＯ Ｅｘ和ＭＣＡＯ Ｓｔ组大鼠行ＭＣＡＯ６０ｍｉｎ，再灌注２ｄ后，ＭＣＡＯ Ｅｘ和Ｓｈａｍ Ｅｘ大鼠在跑步机上进行５ｄ的３０ｍｉｎ／ｄ跑步运动（１５ｍ／ｍｉｎ），之后进行神经行为学评价，最后大鼠断头取脑进行ＴＴＣ方法染色，评估各组大鼠梗死体积以及缺血半影Ｃ
ａｓｐａｓｅ ３和ＴＵＮＥＬ阳性细胞表达水平。

结果：与Ｓｈａｍ Ｓｔ相比，ＭＣＡＯ Ｓｔ和ＭＣＡＯ Ｅｘ大鼠缺血半影区Ｃａｓｐａｓｅ ３表达均显著升高（Ｐ＜０．０５）；与ＭＣＡＯ Ｓｔ组大鼠相比，ＭＣＡＯ Ｅｘ组大鼠脑梗死体积明显减少，大鼠神经功能评分明显改善，大鼠缺血半影区Ｃａｓｐａｓｅ ３和ＴＵＮＥＬ阳性细胞表达水平显著降低（Ｐ＜０．０５）。

结论：早期运动可能通过抑制大鼠脑缺血后神经元凋亡发挥神经保护作用。

【关键词】缺血／再灌注损伤；早期运动；凋亡；大鼠；脑
【
ＫＥＹＷＯＲＤＳ】　ｉｓｃｈｅｍｉａ／ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎｉｎｊｕｒｙ；　ｅａｒｌｙｅｘｅｒｃｉｓｅ；　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ；　ｒａｔｓ；　ｂｒａｉｎ【中图分类号】Ｒ７４３．３ 【文献标识码】Ａ 【文章编号】１０００ ６８３４（２０２０）０１ ０３９ ００４【ＤＯＩ】１０．１２０４７／ｊ．ｃｊａｐ．５８５７．２０２０．００８
【基金项目】山西大同大学博士科研启动经费（２０１４ Ｂ ０１）；山
西省基础研究项目（２０１５０２１１７８）【收稿日期】２０１９ ０４ ０１【修回日期】２０１９ １１ ０７　△【通讯作者】Ｔｅｌ：１８７３４２３９７５０；Ｅ ｍａｉｌ：ｐｚｆ１８１＠１２６．ｃｏｍ
缺血性脑卒中是由血管阻塞引起的大脑供血不足，是导致身体残疾主要原因。

许多临床实践指南建议在脑卒中后
尽早开始运动，以促进身体残疾恢复［１］。

根据神经元损伤模式，大脑缺血区域可分为缺血核心区和半影区。

由于缺血半影区神经元损伤较轻，有恢复的可能，因而成为各种干预治疗的靶点［２］。

此外，在急性缺血性
损伤后，缺血区神经元可通过激活凋亡途径发生再一步损
伤
［３］。

因而保护缺血半影区神经元凋亡是一种潜在改善缺血性脑卒中后恢复的策略。

因此，在本研究目的是观察早期跑步运动是否通过调节缺血半影区神经元凋亡在大鼠缺血／再灌注损伤模型中发挥神经保护作用。

１　材料与方法
１．１　实验动物及分组
雄性ＳＤ大鼠（２４０ ２８０ｇ），购于山西医科大学实验动物中心（动物许可证号：ＳＣＸＫ（晋）２００９ ０００１）。

室内温度保持在（２３±２）℃左右，明暗周期１２ｈ，自由饮水和进食。

在研究过程中对大鼠处理均按照国家颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》和山西大同大学医学研究伦理委员会的要求严格执行。

将ＳＤ大鼠随机分成４组：假手术＋安静组（Ｓｈａｍ Ｓｔ，ｎ＝１５）（２４０～２８０ｇ）、假手术＋运动组（Ｓｈａｍ Ｅｘ，ｎ＝１５）（２４０～２８０ｇ）、缺血＋运动组［大脑中动脉闭塞（Ｍｉｄｄｌｅｃｅｒｅ ｂｒａｌａｒｔｅｒｙｏｃｃｌｕｓｉｏｎ，ＭＣＡＯ） Ｅｘ，ｎ＝１５）（２４０～２８０）ｇ和缺血＋安静组（ＭＣＡＯ Ｓｔ，ｎ＝１５）（２４０～２８０）ｇ。

１．２　实验仪器和试剂
显微镜（日本Ｏｌｙｍｐｕｓ公司）；电动跑步机（安徽正华生物仪器设备有限公司）；２，３，５ 氯化三苯基四氮唑（２，３，５ ｔｒｉ ｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍｃｈｌｏｒｉｄｅ，ＴＴＣ）染料（美国Ｓｉｇｍａ公司）；
９
３中国应用生理学杂志，２０２０，３６（１）。