荧光PCR探针熔解曲线法检测结核分枝杆菌对利福平、异烟肼、喹诺酮及卡那霉素耐药性的评价

肺结核专题
荧光PCR探针熔解曲线法检测结核分枝杆菌对
利福平、异烟肼、喹诺酮及卡那霉素耐药性的评价$
刘春平\谭耀驹2,苏碧仪2，马品云2
^广州医科大学附属第一医院广州呼吸健康研究院呼吸病理中心（广东广州510180); 2广州市胸科医院医学检验
科（广东广州510095)
【摘要】目的利用荧光PC R探针熔解曲线方法检测涂阳患者痰标本中结核分枝杆菌对利福平、异烟
肼、喹诺酮及卡那霉素耐药性，并与表型药敏试验结果比较，评价其应用价值,：方法收集216株痰涂片阳性
患者的痰标本，行BACTEC MGIT960液体培养、菌种鉴定、DNA提取及荧光PC R探针熔解曲线检测。

经菌种
鉴定的182例结核杆菌临床分离株行表型药敏试验。

其中174份标本同时获得表型药敏试验和荧光PC R探
针熔解曲线方法检测利福平、异烟肼、喹诺酮及卡那霉素耐药性的结果，以表型药敏试验结果为标准，评价荧
光PC R探针熔解曲线检测方法检验效能t结果174份标本中，以表型药敏试验结果为标准，PC R探针熔解
曲线法检测利福平敏感度、特异度和符合率分别为93. 75%(95%C/:79.丨9%~99. 23%)、97. 18%(95%C7:
92.94%~99.23%)和96. 55%;对异烟肼敏感度、特异度和符合率分别为76.00%(95%C/:61.83%~
86.94% )、W. 19%(95%C/:95. :59% ~ 98% )和91 «% ;对喹诺酮敏感度、特异度和符合率分别为
85.00%(95%(：/:62.11%〜96.79%)、100.00%(95%(：/:97.63%~100.00%)和98.28%;对卡那霉素敏感
度、特异性和符合率分别为 50.00%(95%(：/:6.76%〜93.24%)、100.00%(95%(：/:97.85%〜100.00%)和
98. 85%。

荧光P C R探针熔解曲线法与表型药物敏感度试验检测结核分枝杆菌对利福平耐药性的值
为0. 89，对异烟肼耐药性的AVippa值为0. 81，对查诺自同耐药性的尺值为0. 91，对卡那霉素耐药性的尺appa
值为0.66。

结论荧光P C R探针熔解曲线方法检测结核分枝杆菌利福平、异烟肼和喹诺酮耐药性，具有较高
的敏感度和特异度，与表型药敏试验检测结核分枝杆菌对福平、异烟肼和唆诺酮耐药性高度一致性，在耐药
结核病的早期快速诊断上具有一定的应用价值。

【关键词】结核分枝杆菌；耐药；利福平；异烟肼；喹诺酮；卡那霉素
【中图分类号】R446.19;R-331【文献标志码】A
D O I：10. 13820/j. cnki. gdyx. 20193543
The value of fluorescent PCR probe melting curve analysis in detection of Mycobacterium tuberculosis for rifam-
picin, isoniazid, fluoroquinolone and kanamycin resistance. LIU Chun - ping, TAN Yao -ju, SU Bi - yi, MA
Pin - yun. Respiratory Pathology Centre, the First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, Guangzhou Insti­
tute of Respiratory Health, Guangzhou510180, Guangdong, China
【Abstract 】Objective To evaluate the efficacy of fluorescent PCR probe melting curve analysis on detecting the resistance of Mycobacterium tuberculosis rifampicin, isoniazid, fluoroquinolone and kanamycin. Methods A total of 216
sputum samples with sputum smear positive had been collected in Guangzhou Chest Hospital from December 2013 to April
2014. BECTEC MGIT 960 liquid culture, strain identification, DNA extraction and fluorescent PCR probe melting curve analysis were applied. The 182 identified Mycobacterium tuberculosis strains were tested with phenotypic drug susceptibili­
ty testing, among which 174 samples also had fluorescent PCR probe melting curve analysis for testing drug resistance to rifampicin, isoniazid, fluoroquinolone and kanamycin. Test efficiency of fluorescent PCR probe melting curve analysis was analyzed using phenotypic drug susceptibility testing as gold standard. Results Of the 174 samples, the sensitivity, spe-
cificity and coincidence rate of rifanipicin resistance were 93. 75% (95% C/: 79. 19% ~ 99. 23% )，97. 18% (95% C7:
92. 94% ~99. 23% ) and 96. 55%，respectively, by fluorescent PCR probe melting curve analysis based on phenotypic
drug susceptibility testing as the standard. The sensitivity, specificity and coincidence rate of isoniazid resistance were *
*基金项目：广东省科技创新战略专项基金（基础与应用基础的研究方向）（2018A030313992);广州市卫生计生科技一般引导
项目（20181 A010035)
76.00% (95%C/:61.83% 〜86. 94%)，99. 19%(95%C7:95.59% ~99.98%)ancl 92.53%，respectively，by fluores- cent PCR probe melting curve analysis based on phenotypic drug susceptibility testing as the standard. The sensitivity, specificity and coincidence rate of fluoroquinolone resistance were 85.00% (95% C7: 62. 11% 〜96. 79% )，100. 00% (95% C/:97. 63% 〜100. 00% ) and 98. 28%，respectively，by fluorescent PCR probe melting curve analysis based on phenotypic drug susceptibility testing as the standard. The sensitivity, specificity and coincidence rate of kanamycin resist- ance were 50. 00% (95%C/:6. 76% 〜93. 24% )，100. 00% (95%C7: 97. 85% 〜100. 00% )and 98. 85% , respectively，by fluorescent PCR probe melting curve analysis based on phenotypic dmg susceptibility testing as the standard. The Kap­pa values of fluorescent PCR probe melting curve analysis and phenotypic drug susceptibility testing for rifampicin resist­ance was 0. 89 for isoniazid resistance in MTBC；0. 91 for fluoroquinolone resistance and 0. 66 for kanamycin resistance. Conclusion Fluorescent PCR probe melting curve analysis has high sensitivity and specificity in detecting drug resistance of Mycobacterium tuberculosis to rifampicin, isoniazid and fluoroquinolone；and it has good consistent with phenotypic drug susceptibility testing. Itis helpful for early detection of drug - resistant tuberculosis.
【K eyw ords】mycobacterium tuberculosis; drug - resistant; rifampicin；isoniazid；fluoroquinolone；kanamycin
结核病是全球范围内一种重要的传染病，严重 危害人类的生命健康。

耐多药结核是指同时对利福 平和异烟肼产生耐药，广泛耐药结核在耐多药结核 基础上，对二线药物喹诺酮类以及3种二线注射药 物（卷曲霉素、卡那霉素和阿米卡星）中的至少一种 产生耐药。

据世界卫生组织估计，2017年全球约有 55. 8万例耐多药结核患者，1.08万例广泛耐药结核 患者[1]。

耐多药结核和广泛耐药结核逐年增加，给 结核病的预防和控制带来了严峻的挑战。

耐药结核 病治疗时间长，治愈率低，传播风险高，早期快速的 诊断是合理治疗的基础，也是耐药结核病防治的关 键所在。

目前确诊耐多药结核需要分离结核分枝杆 菌进行培养、菌种鉴定及药敏试验，传统的表型药敏 试验耗时长、操作复杂，延误患者的诊断和治疗时 间，因此，建立快速准确检测结核杆菌耐药性的方法 才能满足临床耐多药结核诊断的需求。

随着分子生 物学技术的飞速发展，耐药结核病的相关基因快速 诊断技术也随之被使用。

2011年WHO推荐Xpert MTB/R IF技术用于结核的快速诊断和利福平耐药 性检测[21 ,但成本高且只能检测利福平单一耐药性。

本研究采用荧光PC R熔解曲线方法检测治疗 结核分枝杆菌一线药物利福平和异烟肼以及二线药 物喹诺酮和卡那霉素的耐药突变，并与表型药敏试 验方法比较，以评价该方法在早期快速诊断耐多药 结核和广泛耐药结核中的应用价值。

1资料与方法
1.1 一般资料收集2013年12月至2014年3月广州市胸科医院216例涂阳肺结核患者的痰标本。

男161例，女55例，年龄（50. 56 ±17. 43)岁。

1.2 方法
1.2.1标本收集和培养经金胺0染色证实为阳 性的痰标本，加人2 ~3倍体积的4%N -乙酰半胱氨酸-氢氧化钠（NALC - NaOH)，液化15min。

将 液化后的痰标本分成两份，一份用于DNA提取，一
份用于分离培养。

分离培养按照中国防痨协会《结 核病诊断实验室检验规程》使用BACTEC MGIT960
全自动分枝杆菌培养仪进行[3]。

1.2.2结核分枝杆菌菌种鉴定和药敏试验对分离培养出的阳性产物按照中国防痨协会《结核病诊 断实验室检验规程》实验操作方法进行结核分枝杆 菌菌种鉴定和利福平、异烟肼、喹诺酮和卡那霉素药 敏试验[3]。

1.2.3结核分枝杆菌DNA的提取取1m L液化 后的痰标本，12 000 x g离心10 min，弃上清液。

重 悬于250 |jl L TB DNA提取液中，涡旋振荡混匀。

封 口膜封口，99丈加热 10 min,12 000 x g离心 10 min,转移上清液至半自动核酸提取仪（厦门致善生物科 技股份有限公司）进行核酸提取，提取液作为DNA 模板。

1.2.4荧光P C R熔解曲线法检测利福平、异烟肼、喹诺酮和卡那霉素耐药性采用荧光P C R熔解曲 线法（结核分枝杆菌利福平耐药突变检测试剂盒、异 烟肼耐药突变检测试剂盒、喹诺酮耐药检测试剂盒和 卡那霉素耐药检测试剂盒，均为厦门致善生物科技股 份有限公司）检测利福平、异烟肼、唼诺酮和卡那霉素 的耐药性。

利福平耐药突变检测结核分枝杆菌复合 群rp〇B507 -534核心区位点的突变。

异烟肼耐药 突变检测ahPC启动子区（-44~ - 30、-15 ~3位 点）、inhA94密码子、inhA启动子区（-17 ~ -8位 点）以及k atG315密码子的突变。

喹诺酮耐药突变 检测gyrA基因88 ~94位密码子的突变。

卡那霉素 耐药突变检测rrs基因的4个位点（1401、1402、1473 和1484位点）和e i s基因启动子区（-10、- 14和-37位点）的3个突变位点。

所有的P C R反应体 系均为25 (xL。

实验操作步骤严格按照说明书进
行，并参照试剂盒说明书进行结果判读。

利福平、异 烟肼和卡那霉素的每个标本有两个反应管，每种突 变检测FA M和T E T两个通道荧光信号，即每个标 本有4个通道的检测结果。

而喹诺酮每个标本有一 个反应管，只检测FAM —个通道荧光信号，每个标 本有2个检测结果。

操作流程简述如下：配制PCR 反应液:取 n x19.6 |xL PCR Mix A 和n x0.4 |xLTB 酶混合液加人至1.5 m L离心管内，混匀，向每支 PCK反应管内分装20 再加人5斗相应提取样品或阳/阴性对照，P C R扩增仪上进行PCR扩增和 熔解分析。

1.3统计学方法用SPSS21.0统计软件，以表型 药敏试验为标准，计算荧光PCK探针熔解曲线法的 敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、符合率和 Kappa 值0
2结果
2.1液体培养和菌种鉴定结果金胺0染色结果 为阳性患者的痰标本共216份进行分离培养，7份(
3. 24%)污染，培养阴性的标本有12份(5.56%), 获得阳性培养菌株有197份（91. 20%h后经菌种 鉴定15份（7.61 %)为非结核分枝杆菌，最终获得 182份(92. 39%)结核分枝杆菌临床分离株。

见 表1〇
表I216份痰标本液体培养、菌鉴及熔解曲线法检测结果份
液体培养和菌种鉴定结果
检测结核分枝
杆菌
非结核
分枝杆菌
污染
培养
阴性
合计
有效17411511201
无效842115
合计182********
2.2药敏试验结果182份临床结核杆菌分离株 中，其中34份（18.68%)为利福平耐药株，敏感株 为148株(81.32% );53份(29. 12%)为异烟肼耐药 株，丨29份（70. 88%)为敏感株；22份（12.09%)为喹诺酮耐药株，160份（87. 91%)为敏感株；5份 (2. 75%)为卡那霉素耐药株，177份(97. 25%)为敏 感株。

其中同时对利福平和异烟肼耐药者有33株 (18. 13% )，同时对利福平、异烟肼和喹诺酮耐药者 有17株（9.34%),同时对利福平、异烟肼、喹诺酮 和卡那霉素4种均耐药者有1株(0.55%)。

2.3 荧光P C R熔解曲线法结果荧光PCR探针 熔解曲线法检测216份痰标本结核杆菌耐药性，15 份(6. 94%)检测无效，其中1份对利福平无效、1份 对异烟肼无效、3份对卡那霉素无效;2份同时对利 福平和异烟肼无效;2份对利福平、异烟肼和卡那霉素3种均无效;6份对利福平、异烟肼、喹诺酮和卡 那霉素同时无效。

检测有效的201份（9
3. 06%)痰 标本中，40份（19.90%)对利福平耐药，161份 (80. 10% )对利福平敏感;46份(22. 89%)对异烟肼 耐药，155份（77. 11% )对异烟肼敏感；23份 (11. 44%)对喹诺酮耐药，178份（88. 56%)对喹诺 酮敏感；3份（1.49%)对卡那霉素耐药，198份 (98. 51%)对卡那霉素敏感。

其中检测出36份 (17. 91%)同时对利福平和异烟肼耐药，15份 (7. 46%)同时对利福平、异烟肼和喹诺酮耐药，2份 (0. 99%)同时对4种抗结核药物耐药。

2.4 荧光P C R熔解曲线法敏感度、特异度、阳性预 测值、阴性贞测值、符合率及值174份标本 同时获得药敏试验及荧光PC R探针熔解曲线法检 测利福平、异烟肼、喹诺酮和卡那霉素的耐药性结 果，以表型药敏试验结果为标准，荧光PC R熔解曲
线法分别检测利福平、异烟肼、喹诺酮和卡那霉素耐
药的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值及符
合率结果见表2。

荧光PCR探针熔解曲线法与表型 药物敏感度试验检测结核分枝杆菌对利福平、异烟 肼、哇诺酮和卡那霉素耐药性的值分别为0.89、0.81、0.91 和 0.66。

3讨论
结核分枝杆菌具有特有的、高疏水性的细胞壁 保护、外排泵以及产生(3 -内酰胺酶的降解酶等功 能，降低某些药物的渗透而表现天然抗性[4]。

它不 同于其他的细菌借助质粒、转座子和整合子产生耐 药，其耐药性的产生主要是由于染色体上编码药物 靶点的基因或药物活性有关的酶基因特定区域的碱 基突变所致。

随着对耐多药结核病耐药机制的认 识，各种检测结核分枝杆菌耐药基因突变的试验方 法正在得到积极研制和应用。

荧光P C R探针熔解 曲线法是P C R和熔解曲线分析方法的结合，由于野 生型序列具有自身特定的熔点，当基因突变时探针 结合力下降导致熔点下降，通过监测荧光杂交信号 区分出野生型与突变型。

约95%的利福平耐药菌株是由rpoB基因上81
l>P的耐药决定区突变所致，突变后利福平不能与细 菌RNA聚合酶的(3-亚基结合，出现耐药[5]。

几乎
所有的利福平耐药株同时也对异烟肼耐药，因此 rpoB基因的突变是耐多药结核菌株的标志，单独对 利福平敏感度分析可作为耐多药的筛选指标[6]。

本研究药敏试验仅发现1株利福平耐药，而异烟肼 敏感现象。

以表型药敏试验为标准，荧光PCR熔解 曲线检测结核分枝杆菌对利福平耐药的敏感度、特
•380 •广东医学2021 年4 月第 42 卷第4 期Guangdong Medical Journa丨Apr. 202丨，Vol. 42, No. 4表2结核分枝杆菌对利福平、异烟肼、喹诺酮及卡那霉素药物的耐药效能
熔解曲线表型药敏试验（例）合计敏感度特异度阳性预测值阴性预测值符合率Kappa 法检测耐药敏感(例）[% (95% CI)][%(95%C/)][% (95% C1)][%(957c CI)](%)值
利福平
93.75
(79. 19 -99.23)
97.18
(92.94-99.23)
88.24
(72.55〜96.7)
98.57
(94.93-99.83)
96.550.89
耐药30434敏感2138140合计32142174
异烟胼
76.00
(61.83-86.94)
99.19
(95.59〜99.98)
97.44
(86.52-99.94)
91.11
(84.99-95.32)
92.530.81
耐药38139敏感12123135合计50124174
喹诺酮
85.00
(62.11 -96.79)
100.00
(97.63-100.00)
100.00
(80.49-100.00)
98.09
(94.52〜99.6)
98.280.91
耐药17017敏感3154157合计20154174
卡那霉素
50.00
(6.76-93.24)
100.00
(97.85〜100.00)
100.00
(15.81 -100.00)
98.84
(95.86-99.86)
98.850.66
耐药202敏感2170172合计4170174
异度和符合率与以往文献报道相一致。

与WHO推荐的Xpert MTB/RIF技术检测利福平耐药 性的敏感度和特异度["]相比较，该方法具有同等的 检验效能。

异烟肼结构虽然简单，但耐药却是一个非常复 杂的过程，约80%以上的异烟肼耐药结核杆菌发生 在katG 315密码子、in h A启动子的-15和-8位或 ahPC启动子区域的-6〜-47位点的碱基突变[|2]。

以表型药敏试验为参照，荧光P C R熔解曲线检测结 核分枝杆菌对异烟肼耐药的敏感度为76. 00%。

虽 然本研究使用的试剂盒涵盖80%以上的常见结核 分枝杆菌异烟肼突变位点，但仍有20%突变位点不 能检测，或存在其他耐药机制以及所用的临床菌株 存在差异等，这些可能是造成敏感度略低于文献报 道的主要原因。

荧光P C R探针熔解曲线法检测 异烟肼耐药的值为0.81,表明该方法与表型 药敏试验具有高度的一致性。

此外本研究发现荧光 P C R探针熔解曲线法检测利福平或异烟肼为耐药 突变，而药敏试验结果却为敏感，可能与荧光PCR 探针熔解曲线法过于敏感、低水平耐药基因突变后 仍对药物敏感或药敏操作中出现失误相关，但最终 还需基因测序进一步验证。

目前针对一线抗结核药物利福平和异烟肼的耐 药基因的研究较多，而针对二线抗结核药物唾诺酮和卡那霉素耐药分子诊断相对较少。

左氧氟沙星和 莫西沙星已被WHO推荐为治疗耐多药结核病的核 心药物。

因此针对喹诺酮耐药的检测亦很重要。

喹 诺酮耐药结核杆菌多发生在DNA旋转酶的gyrA基 因保守区67〜106位的密码子区发生突变，常见的 突变有 94 位 GAC—GCC/CAC/TAC 及 90 位 GCC— GTG W]。

本研究采用的荧光PCR探针熔解曲线法 试剂盒涵盖约70% ~ 90%的喹诺酮突变位点，以药 敏试验为参照，其敏感度为85.00% ,特异度为100.00% ,与文献[|5]报道基本一致。

与药敏试验方 法具有高度一致性，因此该方法在快速检测喹诺酮 耐药性上具有重要的应用价值。

本研究以药敏试验为参考，荧光PCR探针熔解 曲线法检测卡那霉素的特异度和符合率均很高，但 敏感度和一致性均明显低于使用同样试剂盒的文献 报道[16]。

分析敏感度和一致性低的原因可能是本 研究中182份结核分枝杆菌临床分离株中卡那霉素 耐药率仅有2.75%，阳性样本数太少以及荧光PCR 探针熔解曲线法检测卡那霉素无效率占66. 67%，使检验效率存在严重偏倚，在今后的研究中还需扩 大阳性样品数和优化该检测方法进一步评估其检验 效能。

另外本研究发现液体培养污染和培阴的19例 标本中，16份荧光PCR 熔解曲线法检测有效。

菌种
广东医学2021 年4 月第42 卷第4 期Guangdong Medical Journal Apr. 2021, Vol. 42, No. 4•381 •
鉴定为非结核分枝杆菌的15份标本中，11份荧光 PCR熔解曲线法判定为有效检测，而182份检测出 表型药敏试验结果的标本中有8份荧光PCK熔解 曲线法却存在无效检测现象。

由此可见，虽然在一 定程度上荧光PCK熔解曲线法可弥补培养过程中 的污染和培阴造成耐药性的漏检，但同时自身也存 在一定的漏检和误判情况。

综上所述，虽然荧光PCR熔解曲线技术存在一 定的局限性，但总体来讲此方法在检测结核分枝杆 菌利福平、异烟肼和喹诺酮耐药性方面具有较高的 敏感度和特异度，与药敏试验具有高度的一致性，并 且简单快速，仅需要2 ~3 h即可检出多种抗结核药 物的耐药性，扩增和结果判读在一个反应管内进行, 成本低，生物安全性较好。

因此，该方法在快速诊断 耐药结核病上具有良好的应用前景，可以及时治疗 和管理结核病患者，对控制耐多药结核和广泛耐药 结核具有重要意义。

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