基于16S_rDNA_高通量测序研究电针对腹泻型肠易激综合征大鼠肠道菌群的调节作用

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　环球中医药2023年5月第16卷第5期　Global Traditional Chinese Medicine,May 2023,Vol.16,No.5
㊃基础研究㊃
基金项目:福建省自然科学基金面上项目(2020J01724);福建省卫生健康中青年骨干人才培养项目(2019⁃ZQN⁃82);福建省科技厅省属公益类科研院所基本科研专项(2021R1003001)作者单位:350122　福州,福建中医药大学针灸学院[王婧雯(硕士研究生)㊁林晟];福建省中医药科学院经
络研究所福建省经络感传重点实验室(郑淑霞㊁许金森)
作者简介:王婧雯(1995-),2020级在读硕士研究生㊂研究方向:经络感传与针灸的作用机制研究㊂E⁃mail:wjw951201@
通信作者:许金森(1963-),硕士,研究员,博士生导师㊂研究方向:经络感传与针灸的作用机制研究㊂
E⁃mail:xujinsenjls@
基于16S rDNA 高通量测序研究电针对腹泻型肠易激综合征大鼠肠道菌群的调节作用
王婧雯　郑淑霞　林晟　许金森
【摘要】　目的　采用16S rDNA 高通量测序技术,分析电针足三里对腹泻型肠易激综合征
(irritable bowel syndrome⁃diarrhea,IBS⁃D)大鼠肠道菌群物种相对丰度和多样性的影响,探讨电针对
IBS⁃D 的作用机制㊂方法　将SD 大鼠随机分为空白组㊁模型组㊁电针组㊂采用束缚联合番泻叶煎剂灌胃法造模,电针组采用电针双侧足三里干预,空白组与模型组不做干预处理㊂干预结束后,检测大鼠内脏敏感性,并取大鼠粪便进行16S rDNA 高通量测序技术检测大鼠肠道菌群㊂结果　(1)与空白组比较,模型组大鼠腹壁回撤反射评分明显升高(P <0.05);经过电针治疗后,在20mmHg 压力下的腹壁回撤反射评分明显降低(P <0.05)㊂(2)与空白组相比,模型组OTU 数目明显降低,电针组接近于空白组㊂(3)与空白组相比,模型组芽孢杆菌纲㊁乳杆菌属㊁真杆菌属等丰度明显降低,拟杆菌纲㊁梭菌纲㊁δ⁃变形杆菌纲㊁毛螺菌属等丰度明显升高,而电针组上述菌纲/属丰度均有所改善㊂(4)三组的Beta 多样性分析结果显示,模型组与空白组的样本明显被区分开,而电针组则在两组之间㊂结论　IBS⁃D 与内脏高敏感性以及肠道菌群结构紊乱有关,电针能调节IBS⁃D 大鼠内脏敏感性以及肠道菌群物种相对丰度,改善菌群多样性㊂
【关键词】　16S rDNA 高通量测序;　电针;　腹泻型肠易激综合征;　肠道菌群;　足三里;　内脏敏感性
【中图分类号】　R245　【文献标识码】　A　doi:10.3969/j.issn.1674⁃1749.2023.05.005Regulatory effect of electropuncture on gut microbiota of rats with IBS⁃D based on 16S rDNA high⁃throughput sequencing
WANG Jingwen ,ZHENG Shuxia ,LIN Sheng ,XU Jinsen
College of Acupuncture and Moxibustion ,Fujian University of Traditional Chinese Medicine ,Fuzhou 350122,China
Corresponding author :XU Jinsen ,E⁃mail :xujinsenjls@
【Abstract 】　Objective To analyze the effect of electroacupuncture at zusanli on the relative
abundance and diversity of gut microbiota in rats with irritable bowel syndrome⁃diarrhea (IBS⁃D)by 16S
rDNA high⁃throughput sequencing and explore the mechanism of action of electroacupuncture on IBS⁃D.Methods
The SD rats were randomly divided into a blank group,a model group,and an
electroacupuncture group,and IBS⁃D rat model was established by chronic restraint stress combined with
senna.The electroacupuncture group took the double⁃sided zusanli point for electroacupuncture
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　intervention,and the blank group and the model group were not treated with any treatment.After the inter⁃vention,the levels of visceral sensitivity were tested and rat feces were taken for16S rDNA high⁃throughput sequencing technology to detect the gut microbiota of rats.Results　(1)Compared with the blank group,
The AWR socre of rats in the model group was significantly increased(P<0.05);after electroacupuncture treatment,the AWR score at20mmHg pressure was significantly decreased(P<0.05).(2)Compared with
the blank group,the number of OTU in the model group was decreased significantly,and the electroacupuncture group was close to the blank group.(3)Compared with the blank group,the abundance of Bacilli,Lactobacillus and eubacterium⁃coprostanoligenes_group in the model group was de⁃creased,and the abundance of Bacteroidia,Clostridia,Deltaproteobacteria,and lachnospiraceae_
nk4a136_group were significantly increased,while the abundance of the above⁃mentioned class/genus in
the electroacupuncture group was improved.(4)The results of the beta diversity analysis of the three
groups showed that the samples of the model group and the blank group were clearly distinguished,while
the electroacupuncture group was between the two groups.Conclusion　IBS⁃D is associated with high sensitivity of internal organs and disorders in the structural of gut microbiota,and electroacupuncture can
regulate the visceral sensitivity and the relative abundance of gut microbiota species in IBS⁃D rats and
improve the diversity of microbiota.
【Key words】　16S rDNA high⁃throughput sequencing;　Electroacupuncture;　Irritable bowel syndrome⁃diarrhea;　Gut microbiota;　ST36(Zusanli);　Visceral sensitivity
腹泻型肠易激综合征(irritable bowel syndrome⁃diarrhea,IBS⁃D)是一种反复发作㊁缠绵不愈的慢性功能性肠病,其在临床上的特征主要是腹泻㊁腹痛或腹部不适,根治较难㊂目前了解到的发病机制有胃肠功能紊乱㊁脑肠轴紊乱㊁内脏高敏感性㊁肠道菌群失调等㊂有研究发现,肠道菌群失调与IBS⁃D的发生发展关系密切,IBS⁃D患者的肠道菌群与正常人相比存在明显差异,常表现为有益菌减少,有害菌增多[1]㊂临床在治疗IBS⁃D时采取了很多方法,然而效果却不尽如人意,针灸以其安全有效简便的优点在众多治疗方法中崭露头角㊂近几年的研究发现,电针不仅可以改善IBS⁃D患者的各项症状[2],降低内脏高敏感性[3⁃4],而且对于改变肠道菌群结构也有一定帮助[5],但是对于其中具体的分子机制仍存在疑惑㊂课题组前期研究已经表明电针对于IBS⁃D大鼠具有良好的治疗效果,能够缓解大鼠症状,且对于辣椒素受体(TRPV1)以及蛋白酶激活受体⁃2(partition defective protein⁃2,PAR⁃2)通路有影响,但具体对大鼠肠道菌群的影响没有做出研究,故本研究拟在前期研究基础上,从肠道菌群角度探讨电针足三里治疗IBS⁃D的机制㊂
1　材料与方法
1.1　动物
选用体质量为(200±20)g雄性SPF级SD大鼠25只,由杭州医学院提供[许可证号:SCXK (浙)2019⁃0002],于福建省中医药科学院实验动物中心饲养㊂饲养条件:室温26℃左右,湿度60%左右,自由饮食,适应性喂养一周后开始实验㊂本实验严格按照‘实验动物管理条例“等文件要求进行㊂
1.2　仪器㊁设备
R407型小动物呼吸麻醉机(深圳瑞沃德生命科技公司)㊁电针仪(华佗牌SDZ⁃Ⅱ型)㊁0.25×13mm 的毫针(北京汉医医疗器械有限公司)㊂
1.3　实验药品和试剂
番泻叶饮片(豪州市华鑫中药饮片科技有限公司)㊁异氟烷(瑞沃德生命科技有限公司)㊁0.9%氯化钠注射液(江西科伦药业有限公司)㊂
1.4　动物分组及处理
按照随机数字表法将大鼠分为正常组8只㊁模型组8只㊁电针组9只㊂正常组不做处理,正常饮水进食;模型组和电针组进行为期两周的造模后,对电针组做电针干预处理,模型组做同等抓取,不做电针处理㊂
1.5　模型制备
采用慢性束缚应激联合番泻叶灌服法进行造模[6⁃7],具体操作方法:动物实验前10小时禁食不禁水,先给予番泻叶煎剂(0.3g/mL)灌胃给药(10mL/kg),每日1次,连续灌胃14天㊂灌服完番泻叶煎剂后,即用自制铁丝网将大鼠固定1小时,期间限制大鼠活动,每日1次,持续14天㊂
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1.6　干预方法
造模结束后,电针组选择双侧 足三里”穴进行针刺干预㊂参照‘实验动物针灸穴位图谱“进行定位,选取位于膝关节后外侧,腓骨小头下约5mm处的 足三里”穴㊂具体方法:采用自制固定器固定大鼠,暴露大鼠足三里的穴区,用0.25mm×13mm毫针直刺,深度5mm,进针后不需要进行手法刺激,连接电针仪进行治疗,设置连续波[8],频率2Hz,电压2~5V,强度以大鼠不嘶叫为宜,电针20分钟,左右足三里交替进行,每日1次,连续5天㊂
1.7　内脏敏感性检测
检测前,大鼠禁食不禁水18小时,给予异氟烷麻醉各组大鼠后,用自制工具(三通管连接自制球囊㊁血压计㊁针筒)进行检测㊂在球囊上涂充足的液体石蜡后将球囊缓慢插入大鼠肛门约4.5cm处,然后把大鼠放进自制的20cm×8cm×8cm大小的亚克力透明盒中㊂等待大鼠完全清醒后,约30分钟左右检测大鼠的内脏敏感性㊂测量腹壁回撤反射评分(abdominal withdrawa reflex,AWR)时由针筒向球囊内注入空气,使血压计读数短时间内分别达到20㊁40㊁60㊁80mmHg㊂不同容积的压力每个持续20秒,重复3次㊂
AWR评分标准[9]:0分,无明显行为变化;1分,大鼠身体不动或仅有简单的头部运动;2分,大鼠腹部肌肉开始收缩;3分,大鼠下腹壁抬离地面或明显收缩变平;4分,大鼠腹壁拱起或伴身体㊁骨盆躬起,臀部抬离地面㊂
1.8　样本采集与指标检测
干预结束后,大鼠禁食不禁水18小时,用高温烘烤过的手术器械进行操作㊂先将大鼠放入小动物呼吸麻醉机诱导盒中使其吸入异氟烷后至麻醉状态,接着于冰上迅速剪开大鼠的结肠组织,将留存在大鼠肠道内的粪便取出1到2颗装入备好的无酶EP管内,随后置于液氮中保存㊂
实验结束后,将取材得到的大鼠粪便采用16S rDNA高通量测序技术进行肠道菌群的检测由北京博奥晶典生物技术有限公司完成㊂基本流程:从样品中提取总基因组DNA,进行16SrDNA区段扩增, PCR产品定量和鉴定,混合和纯化PCR产物,使用无链®DNA PCR样品制备法生成测序文库,测序结果最终进行生物信息分析㊂
测序完成后,对测序得到的原始数据进行处理,随后基于有效数据进行OTUs聚类㊂根据OTUs 聚类结果,先做物种注释,接着进行Beta多样性分析,比较样本群落组成的相似性或差异性㊂粪便基因测序以及生物信息分析流程由北京博奥晶典生物技术有限公司提供,根据公司平台生成的数据和图片进行统计分析处理㊂
1.9　统计学处理
内脏敏感性检测结果采用SPSS23.0统计软件进行数据分析,实验所得结果为计量资料,经检验符合正态分布且方差齐,数据用均数±标准差(x±s)表述,多组比较采用单因素方差分析,采用LSD⁃t检验进行两两比较㊂以P<0.05为差异有统计学意义㊂
2　结果
2.1　内脏敏感性检测结果
由表1可以看出,与空白组相比,模型组大鼠腹壁回撤反射评分明显升高(P<0.05),提示造模成功㊂经过电针治疗后,与模型组相比,在20mmHg的压力下,电针组腹壁回撤反射评分明显降低(P<0.05),而在更大压力下的变化并不明显,说明电针可以有效改善IBS⁃D大鼠的内脏敏感性,对于更大压力变化不明显的原因有待进一步探索㊂
2.2　OTU分类韦恩图
通过三组样本的OTU分布,对样本的物种分布情况初步判断,如图1所示,空白组OTU个数共有2106,模型组共有1739个,电针组共有2047个OTU 数目;其中模型组与空白组相交叠的OTU数目明显低于电针组与空白组交叠数目㊂说明经过治疗后,电针组总OTU数目以及与空白组交叠数目均有所上升㊂
表1　三组大鼠电针后不同压力下腹壁回撤反射评分结果(x±s)
组别鼠只20mmHg40mmHg60mmHg80mmHg 空白组80.6675±0.0895 1.9988±0.1257 2.8338±0.0892 3.6675±0.0893模型组8 2.0000±0.0000a 3.0825±0.0540a 3.8750±0.0879a 4.0000±0.0000b
电针组9 1.7411±0.2787ab 3.0756±0.1216a 3.8156±0.1125a 4.0000±0.0000b 注:与空白组相比,a P<0.05;与模型组相比,b P<0.05㊂
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注:K:空白组;M:模型组;D:电针组㊂
图1　三组大鼠OTU 分类韦恩图
2.3　大鼠粪便菌群测序量分析
Shannon 稀释曲线可以用来反应各样本在不同
测序数量时的微生物多样性,如图2所示,各组大鼠
OTUs 不会随着测序量增加而上升,曲线趋于平坦,说明可以反应该样本绝大多数微生物多样性信息,足够可靠
㊂
图2　三组大鼠粪便菌群测序量分析Shannon⁃Wiener 图
2.4　大鼠粪便菌群物种组成分析
根据OTU 聚类结果,分别在纲㊁属㊁种水平上发现,三组的肠道菌群群落结构基本相似,只是构成比有差异㊂通过比较三组大鼠的菌群物种分布情况,说明电针治疗可以改善菌群结构㊂
在纲(class)水平上,拟杆菌纲㊁梭菌纲㊁芽孢杆菌纲㊁δ⁃变形杆菌纲四种菌纲丰度相对较高㊂与空白组相比,模型组拟杆菌纲㊁梭菌纲㊁δ⁃变形杆菌纲等均有升高,芽孢杆菌纲则明显降低㊂而电针组的菌群结构则在模型组的基础上有所变化㊂如图
3A 所示㊂
在属(genus)水平上,三组中排在前六位的菌属
主要有乳杆菌属㊁lachnospiraceae_nk4a136_group(毛螺菌属)㊁普雷沃氏菌Ga6A1属㊁Eubacterium _coprostanoligenes_group(真杆菌属)㊁Ruminiclostridium
_9㊁Ruminococcaceae_UCG.014等㊂与空白组相比,模型组乳杆菌属㊁真杆菌属明显降低,毛螺菌属㊁普雷沃氏菌Ga6A1属㊁Ruminiclostridium_9㊁Rumi⁃nococcaceae_UCG.014(瘤胃菌属)等明显升高㊂经过电针治疗后,可看出以上菌属丰度均有一定的改善㊂如图3B 所示㊂
在种(species)水平上,模型组的菌种结构分布与空白组存在明显差异,其中约氏乳杆菌的占比明显减少,而隶属于灰色部分的其他菌种的占比明显增加,经过电针治疗后有所改善㊂如图3C 所示㊂
2.5　大鼠粪便菌群多样性比较
Beta 多样性分析用来比较不同样本在物种多
样性方面的相似程度㊂采用bray curtis 的算法计算样本间的距离,得到主坐标(PCoA)分析的结果,从图4可看出模型组与空白组明显被区分开(P <0.05),电针组则在两组之间;且模型组㊁空白组的组内集群效果好,电针组较差㊂说明了电针组样本在向空白组靠近,电针可以改善IBS⁃D 大鼠模型的Beta 多样性㊂3　讨论
依照自然属性分类,人体常见的几大细菌门主要为拟杆菌门㊁厚壁菌门㊁变形菌门㊁放线菌门等,大多数人肠道菌群中百分之九十九由这四种菌门组成,它们的丰度和构成比例对人们的健康影响极大[10]㊂有研究表明IBS⁃D 患者肠道菌群结构与健康人相比存在失调情况[11⁃12],其肠道微生物在粪菌移植治疗后,会出现菌群丰度增加㊁结构改变的情况[13]㊂近几年,很多学者将肠道菌群作为治疗IBS⁃
D 的靶点,得到了较好的效果㊂IBS⁃D 患者的肠道微生物失调总结起来就是有害菌增加㊁有益菌减少[14],那么了解哪些有害菌增加,以及又有哪些有益菌减少是非常有必要的㊂目前,大多研究都认为,厚壁菌纲㊁拟杆菌门等丰度增加,乳杆菌属㊁双歧杆菌等丰度降低会引起IBS⁃D [15⁃17]㊂众所周知,IBS⁃D 患者的典型症状主要是腹痛㊁腹泻㊁腹胀等,这与内脏高敏感性相关[18],曾有学者提出其腹痛症状与肠道菌群结构关系密切,在于肠道菌群会产生能加重腹痛症状的乙酸盐[19];同时,也有人指出腹泻症状与某些菌群密切相关,可能是因为一些肠道
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注:K:空白组;M:模型组;D:电针组㊂
图3　
三组大鼠菌群物种分布比较
图4　基于bray curites 距离的PCoA 分析
菌群能够产生影响肠道渗透性的脂多糖[20]㊂因此,通过改善肠道菌群结构紊乱的情况,可以缓解IBS⁃D 的症状㊂
本实验通过慢性束缚应激联合番泻叶灌服法构建IBS⁃D 大鼠模型,实验结果证明电针足三里可以通过改善大鼠肠道菌群结构达到治疗大鼠的目的㊂通过分析各组大鼠粪便菌群在不同水平上的物种组成的结果发现,IBS⁃D 大鼠粪便菌群的物种构成与空白组大鼠存在明显差异,这与其他人的研究结果一致[21⁃22]㊂本研究发现,乳杆菌属明显降低,且其中约氏乳杆菌种下降非常明显,乳杆菌属做为有益菌,可以对抗机体致病微生物,改善肠道屏障功能,预防和治疗腹泻㊂此外,本研究还发现模型组的普雷沃氏菌Ga6A1属丰度明显高于其他
两组,Prevotellaceae_Ga6A1_group 隶属于普氏菌属,普雷沃氏菌可以加快碳水化合物发酵,诱发内脏超
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敏反应,甚至可能通过增加肠道通透性的方式加剧腹痛腹泻的症状㊂基于此,普雷沃氏菌的增加与内脏高敏感性呈正相关㊂因此,乳杆菌属的降低㊁普雷沃氏菌的增加都可能是IBS⁃D的起病原因㊂本实验通过电针足三里穴发现,IBS⁃D大鼠具有内脏高敏的反应,且证实了其具体的内在机制可能与肠道菌群结构有关;明显可以看出模型组相较空白组而言有降低或增加的肠道微生物,在电针组中或多或少得到了改善㊂本研究证明了高通量测序技术可以满足大鼠肠道菌群的检测需求,为深入研究电针足三里穴治疗IBS⁃D提供了参考思路,但由于受客观条件的影响,并未对实验中改变明显的菌群进行功能预测,未来可进一步研究菌群的功能基因在代谢途径和蛋白功能上的差异和变化㊂
参考文献
[1]　王菲,高斌.腹泻型肠易激综合征患者的肠道微生态特征
[J].临床合理用药杂志,2021,14(8):157⁃158. [2]　吴冬,彭涛,荣培晶,等.耳甲电针治疗腹泻型肠易激综合征
的疗效[J].世界中医药,2021,16(11):1721⁃1725. [3]　郑苏,胥婧,彭力.电针足三里对肠易激综合征大鼠胃肠功能
及CGRP㊁SP㊁VIP影响研究[J].针灸临床杂志,2018,34
(3):66⁃69.
[4]　李凯歌,郭孟玮,谭莉华,等.比较电针 大肠俞” 天枢”穴对
肠易激综合征模型大鼠内脏敏感性㊁Cajal间质细胞和辣椒素
受体1的影响[J].中国针灸,2018,38(6):625⁃629,636. [5]　王婧雯,郑淑霞,林晟,等.基于肠道菌群探讨腹泻型肠易激
综合征的针刺治疗[J].云南中医中药杂志,2022,43(2):
83⁃86.
[6]　Williams C L,Villar R G,Peterson J M,et al.Stress⁃induced
changes in intestinal transit in the rat:a model for irritable bowel
syndrome[J].Gastroenterology,1988,94(3):611⁃621. [7]　赵妍,罗丹妮,陈颖,等.慢性束缚应激联合番泻叶灌胃法制
备IBS⁃D大鼠模型的量效及时效关系评价[J].世界华人消
化杂志,2017,25(15):1360⁃1367.
[8]　郑苏,胥婧,彭力.电针足三里对肠易激综合征大鼠胃肠功能
及CGRP㊁SP㊁VIP影响研究[J].针灸临床杂志,2018,34
(3):66⁃69.
[9]　吴皓萌,敖海清,黄绍刚,等.疏肝健脾方干预腹泻型肠易激
综合征内脏高敏感性大鼠的效应机制[J].中华中医药杂
志,2018,33(1):317⁃320.
[10]　Matsumoto H,Shiotani A,Katsumata R,et al.Mucosa⁃
Associated Microbiota in Patients with Irritable Bowel Syndrome:
A Comparison of Subtypes[J].Digestion,2021,102(1):49⁃56.
[11]　Bonaz B,Bazin T,Pellissier S.The vagus nerve at the interface of
the microbiota⁃gut⁃brain axis[J].Front Neurosci,2018,12:49.
[12]　柯少雄,杨长青,陈俊杰,等.肠易激综合征患者肠道菌群特
征及其与肠黏膜肥大细胞活化的关系[J].山东医药,2020,
60(2):31⁃34.
[13]　Halkjaer S I,Cheistensen A H,Lo B Z S,et al.Fecal microbi⁃
ota transplantation alters gut microbiota in patients with irritable
bowel syndrome:results from a randomized,double⁃blind
placebo⁃controlled study[J].Gut,2018,67(12):2107⁃2115. [14]　丁姮月,朱惠萍,梁国强,等.基于高通量测序技术的脾虚腹
泻型肠易激综合征小鼠与健康小鼠肠道菌群的差异研究
[J].中国中医基础医学杂志,2021,27(2):260⁃266,324.
[15]　Lee S M,Kim N,Yoon H,et positional and Functional
Changes in the Gut Microbiota in Irritable Bowel Syndrome
Patients[J].Gut and liver,2021,15(2):253⁃261. [16]　王云,赵崧.低可发酵的低聚糖㊁双糖㊁单糖及多元醇饮食治
疗腹泻型肠易激综合征的研究进展[J].医学综述,2022,28
(14):2871⁃2876,2883.
[17]　尹德菲,魏秀楠,刘佳卉,等.理肠饮对腹泻型肠易激综合征
患者肠道菌群及生活质量的影响[J].山东中医杂志,2022,
41(9):946⁃953.
[18]　郑淑霞,许金森,陈苑平,等.电针对IBS⁃D模型大鼠结肠组
织中PAR⁃2表达的影响[J].云南中医中药杂志,2022,43
(7):67⁃72.
[19]　陈俊杰,杨长青,魏子白.内脏高敏感在肠易激综合征中的研
究进展[J].国际消化病杂志,2017,55(5):274⁃277. [20]　Schumann P,ZHANG D C,Franca L.Marmoricola silvestris sp.
nov.a novel actinobacterium isolated from alpine forest soil[J].
Int J Syst Evol Microbiol,2018,68(4):1313. [21]　张儒奇,方志安,韩文庆,等.葛根芩连汤对腹泻型肠易激综
合征大鼠肠道菌群的影响[J].中国中药杂志,2022,47(24):
6709⁃6719.
[22]　许云姣,蔡悦青,姜莉云,等.基于肠道菌群探讨四四固本颗
粒对IBS⁃D(脾肾阳虚型)大鼠短链脂肪酸(SCFAs)含量的影
响[J].辽宁中医药大学学报,2023,25(2):18⁃23.
(收稿日期:2022⁃12⁃16)
(本文编辑:王馨瑶)。