南洋楹溃疡病菌巢式PCR快速检测

南洋楹溃疡病菌巢式PCR快速检测
随着全球范围内农业的发展，农作物是人类生计的重要组成部分，其中水稻、小麦等粮食作物及蔬菜、水果等也被广泛种植，但是各种病害的出现让农作物产量下降，受到了极大的威胁。

因此，对农作物病害的快速检测和准确诊断显得非常重要。

其中，南洋楹溃疡病是一种严重的病害，对果树和蔬菜的生长发育造成很大的影响。

该病的造成来源于一种叫做南洋楹溃疡病菌（Ralstonia solanacearum）的细菌，在不同的病原区域和生态环境中发生频率很高。

因此，南洋楹溃疡病菌的快速检测非常有必要。

1.实验目的
2.实验材料与方法
2.1.1 南洋楹溃疡病菌纯培养物
2.1.2 PCR试剂盒：包括引物、Buffer、聚酰胺酶、dNTPs等
将南洋楹溃疡病菌纯培养物进行裂解，采用闪电式破碎法将菌细胞破碎，并通过琼脂糖凝胶电泳的方法对DNA进行分离纯化。

最终得到DNA样品，用0.8%琼脂糖凝胶电泳鉴定DNA的质量、浓度和完整性。

2.2.2 引物设计
参考相关文献，根据南洋楹溃疡病菌的完整基因组序列，在其16S rRNA基因上设计一组扩增引物（R16S-F, R16S-R），引物序列如下：
R16S-F：5’-ATGACGGTATGAGCTACACC-3’
2.2.3 PCR体系的制备
PCR体系总量为50 μL，包括10 μL 5×Buffer、0.5 μL rTaq、1 μL dNTPs、2 μL 引物（R16S-F, R16S-R）、2 μL 模板DNA，以及纯水补至总反应体积。

2.2.4 PCR反应条件
初步PCR反应条件：95℃预变性2 min；95℃变性1 min；58℃退火1 min；72℃链延伸2 min；30个循环；72℃链延伸5 min；4℃保持。

所得PCR产物作为巢式PCR的模板，分别采用与初始扩增引物同样位置上的两个内部引物，进行两轮内部扩增反应。

巢式PCR反应条件：同上；内部引物序列如下：
2.2.5 PCR产物电泳检测
将巢式PCR扩增后的产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，利用UV激光贴膜进行成像
（Figure 1）。

3.结果与分析
初步PCR反应检测结果表明，南洋楹溃疡病菌模板DNA可以被引物扩增（Figure 2）。

巢式PCR扩增后的产物与初始PCR相比较，产物明显增多；同时，内部引物的设计有效地
减少了非特异性扩增。

3.2 确认扩增产物的特异性
通过序列分析，巢式PCR扩增后的产物可与南洋楹溃疡病菌的16S rRNA基因序列高
度一致（Figure 3），并与其他细菌的16S rRNA序列具有较高的特异性识别度。

4.总结
南洋楹溃疡病菌是植物病原细菌，其在种植业上的危害越来越严重，对其的快速、准
确检测变得越来越重要。

本文介绍了一种基于巢式PCR技术的南洋楹溃疡病菌快速检测方法，该方法利用引物的设计和PCR扩增反应高效准确地检测了南洋楹溃疡病菌的存在。

这
种灵敏度高、特异性强的检测方法有望为农业环境中南洋楹溃疡病的快速检测提供更加便
捷的手段，从而保护了农渔业及食品安全。