痰标本的前处理

痰标本的前处理方法
消化—除菌（美国CDC建议方法）
1.N-乙酰-L-半胱胺酸-氢氧化钠法（NALC-NaOH）(使用3D培养仪，推荐)
N-乙酰-L-半胱胺酸是一种黏液溶解剂，可用来快速地将痰标本消化，并除去杂菌， NaOH在痰标本中的最终浓度为1% 。

在标本处理液中乙酰半胱胺酸会很快地失去活性，因此消化液应每日新鲜配制。

消化液中会含有吸附了重金属离子的柠檬酸钠，它可以使乙酰半胱胺酸失去活性。

*所需材料
N-乙酰-L-半胱胺酸-氢氧化钠溶液（NALC-NaOH）
离心管，50ml
培养基：琼脂培养基，参阅书中7H-10或7H-11；蛋黄培养基，查阅 Lowentein-Jensen(LJ) 或美国Trudeau学会
0.067M磷酸缓冲液，pH6.8 或无菌蒸馏水。

0.2%牛白蛋白盐水溶液
试剂准备
1）将NaOH和柠檬酸钠混合均匀（见表一）放带有螺旋盖子的烧瓶中储存备用，当加入乙酰半胱胺酸后，此标本处理液应于24小时内使用，因为乙酰半胱胺酸久置后会失去液化活性。

表一 NALC-NaOH消化处理液的配制
消化液体积 4%NaOH * 柠檬酸钠 2H2O ** NALC
(ml) (ml) (ml) (克)
50 25 25 0.25
100 50 50 0.5
200 100 100 1
500 250 250 2.50
1000 500 500 5.00
* 4.0克NaOH加到100ml蒸馏水中
** 2.9克柠檬酸钠 2H2O(或2.6克无水柠檬酸钠)加到100ml蒸馏水中
2)0.067M磷酸缓冲液，pH6.8
储存液：(a ) 磷酸氢二钠：将9.47克无水Na2HPO4溶解于1升蒸馏水中。

(b) 将9.07克KH2PO4溶解于1升蒸馏水中。

pH6.8缓冲液：将50ml (a) 液与50ml (b)液混合，调整pH至6.8。

加入(a)液或b液可分别增加或降低溶液的pH值。

3)0.2%牛白蛋白液(使用3D培养瓶培养无须此试剂)
2%储存液：将0.85克NaCL溶解在100ml蒸馏水中，加入2克牛白蛋白片断V，用旋涡
振荡混匀，或用磁性搅拌器轻轻搅拌混匀。

用4%NaOH调整pH为 6.8，用过滤膜或
Seitz过滤除菌。

0.2%应用液：将上述储存液用0.85%无菌盐水作1：10的稀释。

痰标本的处理过程
1．将不超过10ml的痰标本加入到50ml的塑料离心管内，加入等体积的NALC-NaOH溶液。

可使用同一台离心机处理多个标本（例如，同时处理8个标本）。

2．加入消化液后，旋紧离心管的盖子，用搅拌器充分混匀至标本液化为止（约5-20秒/管），颠倒混匀离心管，以确保NALC-NaOH溶液与管内标本充分接触。

注意：避免极剧烈的震动，以减少乙酰半胱胺酸的氧化及失活。

3．将离心管放室温15分钟除菌。

为达到更佳的除菌效果，可将NaOH的浓度增加至5%-6%，而不是增加标本消化处理时间。

4．用无菌蒸馏水或无菌磷酸缓冲液 (pH6.8) 将已消化—除菌的标本稀释至离心管上50ml的标志处，在标本离心之前减少NaOH的继续作用，防止分支杆菌被破坏。

5．盖紧盖子，旋涡震荡或颠倒混匀。

6．3000×g离心15分钟（适当RCF结合时间可获得95%的沉淀）,最好使用能密封的离心杯，以防止气溶胶播散。

如无这种可密封的离心杯，可适当调整离心过程，可参照Hall的方法。

7．离心后，将上清液倒入盛有消毒剂的容器内，用侵过消毒剂的纱布擦净试管的边缘，再盖上试管盖子。

8，在沉淀物中加入1-2ml的磷酸缓冲液（用于3D培养）或0.2%的牛白蛋白溶液（用于涂片）混匀备用。

Petroff's氢氧化钠法（NaOH）
NaOH不仅对非抗酸菌有毒性，而且对分枝杆菌也具有毒性；因此整个消化过程应严格按照要求进行。

消化液NaOH的浓度应为2%-4%，这样才能更有效的将痰标本消化及除菌。

·所需材料
NaOH溶液（2%-4%）
2N盐酸（HCl）溶液或盐酸-酚红指示剂（HCl-phenol red）
·试剂准备
NaOH
将2克NaOH（或4克）溶解在100ml蒸馏水中，使之成为2%（或4%）的浓度，高压灭菌。

2N HCl
将33ml浓HCl缓缓加入到200ml水中（注意应将酸加到水中，无将水往酸中加），高压灭菌。

酚红指示剂
将20ml 酚红溶液（4%NaOH中加0.4）和85ml浓HCl加入到蒸馏水中，使最终体积为1000ml. 注意：酚红溶液也可单独使用。

·痰标本处理过程
1）将10ml标本加到50ml刻度的带螺旋盖子的试管中。

加入等体积的上述NaOH溶液。

2）用振荡仪充分振摇15分钟，如果同时能进行搅拌以利于消化，则效果更好，然后放置15分钟。

3）3000×g离心15分钟。

4）离心沉淀后，将上清液弃去，再加盐酸。

可以先加1滴指示剂溶液，再一滴一滴的加盐酸；也可以直接加盐酸—酚红指示剂，当指示剂的颜色由红变为稳定的黄色时，即可停止加盐酸。

5）将沉淀混匀后即可接种在适当的培养基上。

6）涂片、自然干燥、加热固定、染色，然后进行镜检。

注意：1，对于任何消化除菌过程，允许的污染率为5%-3%。

如果污染率明显地高于5%，则应检查消化过程，消化不足培养物会被高度污染。

消化过度会使得污染率低于3%，并有可能影响培养的阳性率。

当这两种情况出现时，最好是对NaOH的浓度进行调整，而不是延长或减少标本消化的时间。

当某个病人的标本总是被污染（表明正常的消化除菌过程效果不佳），则有必要采用特殊的方法。

2，为了避免污染，在前处理过程中所有应用的试剂和器皿都需要消毒灭菌。