农杆菌介导的氮高效利用转基因水稻植株的获得

农杆菌介导的氮高效利用转基因水稻植株的获得
查中萍;万丙良;殷得所;杜雪树;戚华雄
【摘要】NAT3 gene coding protein with high nitrate combining ability cloned from Cylindrotheca fusiformis was transmitted into rice ' zhonghua 11' via Agrobacterium-mediated transformation. 456 regenerated rice plants with resistance were obtained by screening on the culture medium with 30 mg/L basta. 313 positive transgenetic plants were gained by PCR amplification analysis targeting at NA T3 gene. It was confirmed that NA T3 gene had been integrated into the genome of ' zhonghua 11'.%将从深海硅藻中克隆的与氮具有高度亲和性的硝酸盐转运蛋白基因NAT3通过农杆菌介导的遗传转化方法,转入水稻品种中花11,在含30 mg/L Basta的选择培养基上筛选,获得456棵抗性植株,对NAT3目标基因检测,获得313棵阳性植株,初步证明目标基因已整合到中花11基因组中.
【期刊名称】《湖北农业科学》
【年(卷),期】2011(050)024
【总页数】3页(P5247-5249)
【关键词】转基因水稻;硝酸盐转运蛋白;氮高效利用
【作者】查中萍;万丙良;殷得所;杜雪树;戚华雄
【作者单位】湖北省农业科学院粮食作物研究所,武汉 430064;湖北省农业科学院粮食作物研究所,武汉 430064;湖北省农业科学院粮食作物研究所,武汉 430064;湖
北省农业科学院粮食作物研究所,武汉 430064;湖北省农业科学院粮食作物研究所,武汉 430064
【正文语种】中文
【中图分类】S511;Q78
植物的生长需要合适的氮量，氮是限制植物生长的重要因素［1］。

硝酸盐
（NO3－）是植物主要氮源之一，硝酸盐供应量的不足经常成为限制作物生长的
因素［2－4］。

但过量硝酸盐如果没有被植物吸收，极易通过淋失、渗透等途径
转移到水环境中，造成水体硝酸盐污染的潜在危险，对生态环境和人体健康产生极为不利的影响［5］。

氮肥施用量对晚稻产量和氮肥利用效率有影响，采用氮素运筹可影响免耕移植水稻产量及氮素利用率［6，7］。

因此，提高氮肥的利用效率，对于促进氮肥的高效利用和减轻环境污染具有重要的意义。

水稻是最早通过基因工程手段进行品种改良的作物之一，我国的转基因生物新品种培育重大专项也已实施，但提高水稻氮素利用率，培育氮高效利用的转基因水稻研究方面的研究不多［8］，因此迫切需要利用新的基因工程策略，培育氮高效利用的转基因水稻新种质。

该研究通过农杆菌介导的遗传转化方法，将从深海硅藻中克隆的与氮具有高度亲和性的硝酸盐转运蛋白基因NAT3导入中花11中，旨在培育氮肥高效利用的转基因水稻，减少氮肥施用量，节约水稻生产成本，从而降低环境污染，促进农业高效节能、可持续发展。

1 材料与方法
1.1 材料
用于研究的水稻材料为中花11，植物表达载体由中国农业科学院生物技术所刘昱
辉博士惠赠，根癌农杆菌菌株为EHA105。

1.2 方法
1.2.1 水稻胚性愈伤组织的获得将成熟种子剥壳后放在50或100 mL三角瓶中进行常规消毒，接种于诱导培养基中，每皿约35～40粒，封口膜封好后于28℃暗培养。

1.2.2 农杆菌介导的遗传转化农杆菌在LA培养基上28℃培养2 d后，用药勺刮取少量菌斑悬浮于含有100 μmol／L的乙酰丁香酮的LB培养基，调整菌液浓度至OD600nm＝0.6左右。

将经过预培养的水稻成熟胚诱导的胚性愈伤组织置于农杆菌悬浮液中，略微摇动后静置5 min，然后将愈伤组织置于培养皿中无菌滤纸上，在超净工作台中吹干。

最后将愈伤组织转入添加有100 μmol／L的乙酰丁香酮的共培养基上，18℃暗培养3 d。

1.2.3 抗性愈伤组织的筛选待愈伤组织共培养2～3 d，取出愈伤组织，用无菌水冲洗3～5次，每次摇动数次，直至水中不见丝状菌体。

然后用含250 mg／L羧苄青霉素的无菌水再清洗一遍，置于无菌滤纸上吹干后，转移至选择培养基（添加250 mg／L羧苄青霉素以及30 mg／L Basta）筛选抗性愈伤组织。

每两周将愈伤组织转移至新选择培养基上，约需3次继代培养获得抗性愈伤组织。

1.2.4 抗性植株的获得将抗性愈伤组织转移到分化培养基上进行分化培育，每一瓶中可放置3～4块不同克隆的愈伤组织。

1周后愈伤组织开始转绿，3周后幼苗长到5 cm时，可进行生根培养。

1.2.5 转基因植株的PCR检测 CTAB法提取水稻总DNA。

PCR扩增NAT3基因片段的引物序列为NATF：5′-GGTCCTCTTATGGAATCGTC-3′，NATR：5′-GACATCTTGAGTCTTCTCGG-3′。

扩增目标片段大小为 296bp，PCR 反应条件为：94℃、5 min；94℃、30 s，58 ℃、30 s，72 ℃、1 min，35 个循环；72 ℃、10 min，4℃保存。

以表达载体质粒、中花11基因组DNA分别作为阳性及阴性对照。

2 结果与分析
2.1 抗性植株的获得
中花11成熟种子在诱导培养基上培养1周，即可看到盾片处有愈伤组织形成，继续在原培养基上培养1个月，即可获得颜色鲜黄、质地紧实的颗粒状胚性愈伤组织（图1a），诱导率达97.0%。

愈伤组织与农杆菌共培养2～3 d后，经脱菌进行选择培养。

约继代培养3次后，获得抗性愈伤组织（图1b），抗性愈伤组织获得率为73.4%。

抗性愈伤组织经分化培养3～4周可获得抗性植株（图1c），分化率为28.0%。

抗性植株在1／2MS生根培养基上生根率达到94.5%，共获得抗性植株456棵。

2.2 转基因植株的PCR检测结果
根据NAT3基因的序列设计一对特异性引物，对获得的所有抗性植株进行NAT3阳性检测。

有313棵检测到296 bp目的基因片段，阳性率为68.6%，部分植株检测结果见图2。

3 讨论
图1 农杆菌介导的转NAT3基因抗性植株的获得
图2 再生植株NAT3基因检测
1）中国的水稻氮肥施用量占全球水稻施用量的37%，氮肥利用率远远低于全球的平均水平；中国水稻种植施用的氮肥占氮肥总使用量的24%［9］。

过量施用氮肥导致环境污染，降低了农民的收入。

研究将从海藻中克隆的硝酸盐转运蛋白NAT3基因，通过农杆菌介导的遗传转化方法转化水稻品种中花11中，对获得的再生植株NAT3基因PCR检测表明目标基因NAT3已整合到中花11基因组中。

2）为了明确NAT3基因在转基因水稻中能否提高氮素利用率，对部分目标基因阳性单株进行Southern杂交，以期检测目标基因单拷贝整合的转基因植株，目前该工作正在进行。

并将进一步利用RT－PCR对单拷贝转基因株系中NAT3基因的表
达进行分析，筛选出NAT3基因不同表达水平的转基因株系，并对不同株系的节
氮效果进行试验，从而为NAT3转基因水稻的氮素利用效率做出科学评价，为进
一步培育氮高效利用新品种奠定基础。

参考文献：
［1］MATTSON W J，HAACK R A，LAWRENCE R X，et al.Considering the nutritional ecology of the spruce budworm in its management［J］.Forest Ecology Management，1991，39：183－210.
［2］CRAWFORD N M，GLASS A D M.Molecular and physiological aspects of nitrate uptake in plants ［J］.Trends Plant Sci，1998，3（10）：385－389.
［3］DANIEL V F，FILLEUT S，CABECHE M.Nitrate transport：a key step in nitrate assimilation ［J］.CurrOpin PlantBiol，1998，1（3）：235－239. ［4］WILLIAMS L E，MILLER A J.Transporters responsible for the uptake and partitioning of nitrogenous solutes ［J］.Annu Rev Plant PysioI Plant Mol Bio，2001，52（6）：659－688.
［5］VERMEER I T M，PACHEN D M A A，DALLINGA J W，et
al.Nitrosmnine formation after intake of nitrate at the ADI leveI in combination with an amine－rich diet［J］.Environ Health Perspect，1998，106（8）：459－463.
［6］李向辉，鲁艳红，廖育林，等.氮肥施用量对晚稻产量和氮肥利用效率的影响［J］.湖南农业科学，2010，49（8）：52－54.
［7］姜新有，周江明.氮素运筹对免耕移植水稻产量及氮素利用率的影响［J］.江
西农业学报，2011，23（9）：104－108.
［8］刘丽，于志晶，张文娟，等.转基因抗虫水稻研究进展［J］.安徽农业科学，
2011，39（9）：5109－5110，5147.
［9］彭少兵，黄见良，钟旭华，等.提高中国稻田氮肥利用率的研究策略［J］.中国农业科学，2002，35（9）：1095－1103.。