医院核酸检测实验室(PCR)消毒规范

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核酸检测实验室(PCR)消毒规范
一、PCR实验室设计核心问题
二、PCR实验污染来源
三、PCR实验污染预防措施
四、PCR实验室空气流向管理与环境消毒
五、实验室日常清洁消毒六、试验结束后物品及环境处理七、其他消毒方法
PCR实验，即临床基因扩增实验，是专门用来检验艾滋病、乙型肝炎、禽疫病等病毒感染性疾病的一种检测手段。

它可以通过将病毒体内所含的基因进行扩增的方法，测出一些病毒含量不高的感染者体内是否含有特定的病毒。

就新冠病毒核酸检测来说，RT-PCR是目前使用最广泛和较准确的筛选和确认方法，大规模核酸检测，必然会引起相关机构单位着力建设规范的临床PCR实验室。

但是，建立一个PCR实验室，其实就是在建设一个平台，考验的不仅仅是一个医疗机构的实验能力，也考验着整个医疗机构的整体能
力。

实验室的平面布局、空调通风系统设计、气流控制等都是围绕同一个核心问题进行——“避免污染”，任何级别的医院在建设PCR实验室时，均需要提前考量各个因素，以保证标本的全环节质量及实验室的生物安全。

1、建设要求。

PCR实验室的建设需要设置标准的“四区”：试剂准备区、标本制备区、PCR扩增检测区和扩增产物检测区。

每个独立实验区设置有缓冲区，各区通过气压调节，使整个PCR实验过程中试剂和标本免受气溶胶的污染，并降低扩增产物对人员和环境的污染。

2、人员要求。

进入PCR实验室，需要经过从基础理论、实验原理、规范操作、质量保证到注意事项等规范的培训，并获取PCR上岗证。

3、检测风险。

检测过程中，样本的开盖，核酸提取的震荡、离心都有可能产生气溶胶，有感染的风险。

4、防护要求。

必须按照生物安全三级实验室的个人防护要求进
行。

二、PCR实验污染来源
1、样本间交叉污染：收集样本的容器被污染或样本密封不严导致外溢；不同样本移液时忘记更换枪尖或未使用带滤芯枪尖；移液器等实验器具及耗材未及时消毒灭菌；不同样本同时开盖或样本剧烈震荡、反复吹吸导致气溶胶形成扩散，相互交叉污染。

2、实验试剂污染：主要是在PCR组分试剂加样过程中，由于移液器、容器、阴性对照及其它试剂被核酸模板或阳性对照污染。

加样过程中，因为PCR试剂对温度十分敏感，需要通过冰浴使得PCR试剂和PCR板/管处于02，但这个过程也充满污染风险。

3、扩增产物污染：大量拷贝的产物泄漏或扩增后的PCR 反应管意外开盖，这是PCR反应中最主要、最常见的污染问题。

因为PCR产物拷贝量大，远远高于PCR检测数个拷贝的极限，所以极微量的PCR产物污染，就可形成假阳性。

4、克隆质粒污染：作为阳性质控品的克隆质粒外溢。

对于低流行地区，PCR检测人员经过严格培训上岗后，核酸污染的风险相对较小，但在疫区超负荷工作时，就可能会遇到核酸污染的问题，可通过以下措施降低污染机会：
1、正确佩戴手套：手套未紧密贴合拇指、食指和中指，在进行开盖操作时容易发生交叉污染。

2、正确使用生物安全柜：简单、整洁、避免通风口堵塞；操作前后紫外线照射，消毒剂随手可及；废液缸里有1/3体积的含氯消毒液，并且及时清理废液缸，保证废物不超过废液缸体积的2/3。

3、核酸提取仪去污染：每天多批次检测时，在每一批次检测完以后必须用75%的乙醇和核酸去除剂对仪器进行去污染。

4、重视通风：不定期对房间进行通风，每次至少持续30min。

5、PCR扩增区去污染：PCR反应管必须盖紧，避免扩增后的核酸对环境的污染。

6、实验室随手可及的消毒剂。

PCR实验室可分为试剂准备区、标本制备区、扩增区和产物检测区四个区域，这四个区域在物理空间上必须完全相互独立，各区域无论是在空间上还是在使用中，应当始终处于完全的分隔状态，不能有空气的直接相通。

所以，临床基因扩增检验实验室的空气流向应按：试剂准备区一标本制备区一扩增区一产物检测区，应时刻防止扩增产物顺空气气流进入扩增前区域。

可按照上述顺序区域空气压力递减的方式进行，也可通过安装排风扇、负压排风装置或其他可行方式实现。

临床基因扩增检验实验室的环境清洁:
《临床基因扩增实验室工作规范》中有对物表清洁、消毒的要求，不同的实验区域应当有其各自的清洁用具以防止交叉污染。

1、基本原则：由清洁区向污染区进行，洁具不可交叉。

2、清洁消毒方向：准备区一标本制备区一扩增区一产物检测区
3、清洁消毒范围：工作区域的物体表面（含桌、椅），可使用含氯消毒剂擦拭消毒，空气和工作台面可使用紫外线照射消毒，也可使用空间消毒器进行全环节消毒。

4、不可使用紫外线消毒器及化学消毒进行有人状态下的消毒。

5、PCR室内的消毒应防止扬尘（减少人员走动）、杀灭DNA或RNA的基因片段。

可选择悬挂紫外线灯管进行空气消毒，试验前照射30-60分钟，实验结束照射30-60分钟，
必要时延长照射时间（可照射一夜）。

6、终末消毒：当出现实验室污染时，应按要求立即撤
出相关人员，在无人情况下可使用化学消毒剂进行终末消毒，如熏蒸法：过氧乙酸lg/nP加热熏蒸（湿度70-90%）,密闭24小时；气溶胶喷雾：3%过氧化氢：20m1./ni3气溶胶喷雾；5%过氧乙酸2.Sm1./n?气溶胶喷雾（湿度20-40%）o
1、每日工作前后，对工作区域表面、地面进行清洁并
消毒，使用含氯消毒液擦拭。

清洁采用湿式、不扬尘的方式进行。

2、物品防尘存放。

墙面定期清洁，有可见污染及时进
行清洁消
3、配备移动紫外线消毒装置进行空气和物表的消毒。

4、生物安全柜的消毒：
①每天工作前：对生物安全柜的内表面进行消毒，包括工作台面和内壁使用消毒剂擦拭。

②工作结束：柜内物品全部消毒后移出。

消毒剂擦拭台面四周、以及玻璃内侧灯部位。

③消毒剂应选择能够杀死生物安全柜里可能发生的任
何微生物（70%乙醇、含氯消毒剂）。

在使用漂白剂等腐蚀
性消毒剂后，还应用无菌水再次进行擦拭。

④停用生物安全柜前，运行5min以净化内部空气。

⑤终末消毒：需要进行终末消毒的时机：生物安全
1、做好废液及固废处理；
2、实验室空间消毒：在室温，50-60%湿度条件下，使
用过氧乙酸熏蒸Zg/n?,过夜；或使用20g/l气溶胶喷雾，用量8g/4；
3、物体表面消毒液：0.55%含氯消毒剂，现用现配，24小时内使用。

考虑到PCR实验室属于感染高风险区域，对其进行日常的清洁消毒及终末消毒，都需要在严密的防护下进行，给保洁工作带来极大不便，那目前是否有一些较为便利的消毒方法呢?
其实有的。

目前市场上经常能看到一些空间消毒机器人、
空间消毒器这类的高科技产品，也有一些便携式的消毒器可以非常方便的用于PCR实验室的消毒。

这些空间消毒器可以像机器人一样使用无线平板进行操控，随时启停，消毒者在实验室之外就可以完成整个消毒过程，避免了正常时间及突发状况下，操作人员为关闭设备而暴露在过氧化氢气雾中。

另外，这类设备还会自带推车，看似是一个推车，其实是一个移动等离子空气消毒机，同时又可以作为移动电源，配合便携式空间消毒器，在区域内的任意地方采用多种方式进行消毒，而不受电源插座的影响。

大家不妨可以关注一下！
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新冠核酸检测实验室操作规范
(202*)
新型冠状病毒感染的肺炎最初需要临床症状结合影像
学等检测结果的临床诊断转换到当前的以新型冠状病毒核
酸检测为依据的快速诊断，为新型冠状病毒感染的防控提供了强有力地保障。

但在新型冠状病毒核酸检测过程中，存在诸多问题急需规范化与标准化。

根据国家卫生健康委、世界卫生组织（WHO）、美国疾病控制与预防中心（CDC）发布的相关指南，结合当前我国各级临床医疗机构实验室现状，特
制订新型冠状病毒核酸检测临床实验室操作规范建议，仅供临床实验室检测时参考。

（一）轻症患者样本采集
对于高度疑似新型冠状病毒感染患者早期或与确诊患
者有密切接触史者，建议采用鼻咽拭子采集标本。

鼻咽拭子采样时，取样关键点："要深、要转、要取细胞"，“要深”即深入距离从耳垂部位到鼻尖长度的一半，”要转”即转动10〜15s,大约转动约4〜5圈，"要取细胞"即取鼻咽部的细胞，见图lo若鼻咽拭子无法采集标本时，可考虑口咽拭子采样。

咽拭子采样时，取样关键点为用拭子擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁3~5次。

取样完毕后，将拭子头浸入含3ml病毒保存液（也可使用等渗盐溶液、组织培养液或磷酸盐缓冲液）的管中，尾部弃去，旋紧管盖。

75%酒精或含有效氯消毒液喷洒密封袋外部后立即送检。

为提高检出阳性率，可同时采用鼻咽拭子和口咽拭子采样，采样后放入同一管细胞保存液或病毒保存液中。

必要时也可采集痰液标本，痰液标本应该取患者深咳的痰液。

(一)重症患者样本采集
疾病进展迅速的重症患者，可采集支气管肺泡灌洗液、气管吸出物、鼻咽抽取物、呼吸道抽取物和肺组织活检标本等。

（三）其他标本采集
新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案（试行第四版）已将血液样本纳入检测新型冠状病毒核酸的标本类型中。

血液样本采集时,EDTA抗凝管采集2〜4ml,分离血浆或血单个核细胞进行检测，也可以直接用全血进行检测。

临床可见部分确诊新型冠状病毒感染患者首发症状为结膜炎或消化道症状，此类患者可考虑采集角膜分泌物和大便等。

（四）样本存放条件与运输
样本采集后室温放置不超过4h,2〜8C不超过72h,超过72h时应该在一70C保存转运。

采集的样本运输时需放置专用的转移箱中运输。

转运时携带75%酒精或含有效氯消毒液，以便发生意外时能及时处理。

（一）人员安排
为有效避免实验室污染，建议采用模块化操作，即每个
分区的操作人员固定，避免人员在不同房间走动，应进行流水式工作流程，用对讲机等通讯方式联络。

人员分工可分为4个环节：（1）样本接收与录入实验室信息系统（laboratoryinformationsystem,1.IS系统）；（2）病毒核酸提取；（3）聚合酶链式反应
（polymerasechainreaction,PCR）扩增试剂配制，上机并审核发放报告；（4）报告结果解读。

（二）标本前处理
实验室采用56C灭活45min预处理采集的标本后再进行核酸检测，研究表明对新型冠状病毒核酸检测结果无影响（表1）o因此，建议对采集的样本，恒温箱或水浴箱56C 灭活30〜45min,温浴前旋紧管盖，必要时可用封口膜密闭管盖，温浴后静止至室温再开盖提取核酸。

表1新冠病毒标本56C灭活45min后对检测结果影响
注：示变异系数，PCR示聚合酶链反应，Ct示循环阈值
（三）核酸提取
尽可能采用自动化提取，小型设备必要时可放置于生物安全柜内操作，最大限度降低实验室污染的可能性。

如采用手工提取病毒核酸，建议在外排式生物安全柜内操作。

（四）核酸扩增
建议采用中国国家卫生健康委推荐的或经过实验室验
证的新型冠状病毒核酸检测试剂盒。

每批次建议使用一个弱阳性质控和三个阴性质控，三个阴性质控随机放置不同位置。

为提高报告的准确性和检测的灵敏度，减少灰区，各个实验室应摸索PCR扩增体系，必要时可以适当扩大反应体系至40口1或50Ulo
（五）核酸保存
提取的核酸如果不能及时扩增或剩余的核酸，应保存在一70°C备用，避免RNA降解。

目前新型冠状病毒核酸检测试剂盒检测主要分为开放
阅读框lab（openreadingframelab,ORFlab）基因、核壳蛋
白基因N片段和包膜蛋白基因E片段三个基因片段或开放性阅读框中的特异性片段ORFlab和核壳蛋白基因N片段二个基因片段。

由于新型冠状病毒核酸检测试剂盒仅设有阴性对照和阳性对照，因此检测结果判读务必谨慎，每批次检测中阳性对照应为阳性，阴性对照应为阴性，否则为失控。

根据中国国家卫生健康委推荐和武汉大学人民医院检测数据综
合分析，将结果判读及解释如下。

（一）二个基因片段结果报告判读与解释
开放性阅读框中的特异性片段ORFlab和核壳蛋白基因N片段二个基因片段的检测试剂盒检测结果解读如下（表2）：（1）ORFlab和N基因二个同时阳性时，判定为阳性；（2）若仅ORFlab或N基因其中之一检测结果阳性时，需重新采样复查，复查后ORFlab或N基因仍为阳性时，判定为阳性。

（3）若ORFlab或N基因检测结果处于灰区（即可疑）时，需重新采样复查，若结果仍为灰区时，扩增曲线有明显起峰，该样本判断为阳性，否则为阴性。

表2二个基因片段检测试剂盒判读示意图
注：ORFlab示开放阅读框lab
（二）三个基因片段结果报告判读与解释
开放性阅读框中的特异性片段ORFlab、核壳蛋白基因N 片段和包膜蛋白基因E片段三个基因片段检测试剂盒检测结果解读如下（表3）：（1）ORFlab和N基因二个或三个同时阳性时，判定为阳性；（2）若仅单一基因片段检测结果阳性时，需重新采样复查，复查后仍为阳性时，判定为阳性。

（3）若单一基因片段检测结果处于灰区（即可疑）时，需重新采样复查，若结果仍为灰区时，扩增曲线有明显起峰，该样本判断为阳性，否则为阴性。

（4）尚有其他可能情况，如出现一个基因片段阳性，而另外一个基因片段可疑时，处理及结果判读同（2）或（3）。

表3三个基因片段检测试剂盒判读示意图
注：ORFlab示开放阅读框lab
（一）个人防护
1.工作前防护要求：
样本采集时和进入实验室前，务必采用三级生物安全防护后方可进入，即穿一次性防护服、戴护目镜或面罩、戴双层手套、戴N95及以上口罩、帽子和防护靴套等。

可参照如下顺序进行：戴帽子，戴N95口罩，戴内层手套，穿防护服，穿防水鞋套，戴外层手套，戴护目镜或面屏。

2.工作后防护要求：
检测工作结束后，在PCR实验室缓冲间，应先用75%酒精（或等效消毒液）喷洒防护服消毒，然后按标准流程依次脱个人生物安全防护装备，污染面切勿接触内部衣物。

可按
照如下顺序：摘护目镜或面屏，解开防护服上的密封胶条，脱手套，脱防护服，脱防护靴套，摘口罩，最后脱帽子。

工作人员离开实验室必须洗手和手消毒。

护目镜放入消毒液中消毒后用清水冲洗可再次使用。

3.注意事项：
禁止穿戴防护装备离开生物安全二级实验室。

（二）消毒
1.实验室空气消毒：
实验室每次检测完毕后，应进行紫外消毒30min或房间宜用紫外消毒机消毒1h,必要时可采用核酸清除剂如PCRCleaner等试剂清除实验室残留的核酸。

2.工作台面消毒：
每天试验后使用0.5犷设有效氯的消毒液进行台面、地面消毒。

当出现溢洒事故时，使用2%〜3%有效氯的消毒液消毒。

垃圾桶及垃圾袋应喷洒有效氯的消毒液，以保证新型冠状病毒被杀灭。

3.安全柜消毒：
每天试验后用75%酒精对生物安全柜进行擦拭。

4.转运容器消毒：
转运及存放标本的容器使用前后用75%酒精进行擦拭或喷洒消毒。

5.塑料或有机玻璃材质消毒：
使用0.5犷1%有效氯的消毒液或过氧乙酸或过氧化氢喷雾（喷淋）消毒，或擦拭消毒。

（三）废弃物的处理
一次性防护用品等废弃物装入专用垃圾袋中，应在垃圾袋内外喷洒有效氯的消毒液，扎紧袋口转运至高压灭菌室，与专用密闭转运箱中转运的检测剩余标本、核酸等一起，经压力蒸汽12UC15min灭菌处理后方可转运出实验室按废弃物的处理。