阿魏酸在烟曲霉菌诱导人角膜上皮细胞中的抗炎作用

第59卷 第4期2023年08月
青岛大学学报(医学版)
J O U R N A LO FQ I N G D A O U N I V E R S I T Y (M E D I C A LS C I E N C E S
)V o l .59,N o .4A u g
u s t 2023[收稿日期]2023-01-23; [修订日期]2023-02-17
[基金项目]山东省自然科学基金(Z R 2019B H 004)[第一作者]张飒飒(1996-),女,硕士㊂[通信作者]彭旭东(1988-),男,博士,副主任医师,硕士生导师㊂E -m a i l :d o c t o r p
x d @126.c o m ㊂阿魏酸在烟曲霉菌诱导人角膜上皮细胞中的抗炎作用
张飒飒1,鲁叶慧1,熊翌宏2,杨珊珊1,吴媛1,彭旭东1
(1 青岛大学附属医院眼科,山东青岛 266003; 2 湖北医药学院药护学院)
[摘要] 目的 探讨阿魏酸(F A )在烟曲霉菌诱导的人角膜上皮细胞中的抗炎作用㊂方法 采用C C K -8方法
检测不同浓度F A (0㊁50㊁100㊁150㊁200㊁250㊁300μm o l /L )溶液对人角膜上皮细胞(H C E C )活力的影响;采用R T -
P C R 方法检测灭活的烟曲霉菌菌丝感染H C E C 后,F A 对炎症因子白细胞介素1β(I L -1β)㊁白细胞介素6(I L -6)㊁肿瘤坏死因子α(T N F -α)及核因子E 2相关因子2(N r f
2)m R N A 表达的影响;采用E L I S A 方法检测F A 对炎症因子I L -6及单核细胞趋化蛋白(M C P -1)蛋白表达的影响㊂结果 300μm o l /L 的F A 溶液处理组H C E C 存活率低于其他各组(F =5.390,P <0.05),250μm o l /L 及以下浓度F A 溶液处理对H C E C 活力无影响(P >0.05)㊂250μm o l /L
F A 处理可显著升高N r f 2m R N A 表达,降低I L -1β㊁
I L -6㊁T N F -αm R N A 的表达水平,并显著降低I L -6及M C P -1蛋白表达(F =4.720~990.967,P <0.05)㊂结论 F A 可能通过上调N r f 2的表达,抑制烟曲霉菌诱导的H C E C 炎症反应中促炎因子的表达,发挥抗炎作用㊂
[关键词] 阿魏酸;烟曲霉菌;人角膜上皮细胞;炎症[中图分类号] R 77 [文献标志码] A [文章编号] 2096-5532(2023)04-0485-05d o i :10.11712/j
m s .2096-5532.2023.59.123[开放科学(资源服务)标识码(O S I D )
][网络出版] h t t p
s ://l i n k .c n k i .n e t /u r l i d /37.1517.R.20230921.1444.003;2023-09-22 12:27:19
A N T I -I N F L A MM A T O R YE F F E C TO FF E R U L I CA C I DI N H U M A N C O R N E A LE P I T H E L I A LC E L L SI N D U C E D
B Y A S P E R G I L -
L U SF U M I G A T U S Z HA N GS a s a ,L UY e h u i ,X I O N GY i h o n g ,Y A N GS h a n s h a n ,WUY u a n ,P E N GX u d o n g (
D e p a r t m e n t o f O p h t h a l m o l o g y ,T h eA f f i l i a t e dH o s p i t a l o fQ i n g d a oU n i v e r s i t y ,Q i n g
d a o 266003,C h i n a )[A B S T R A C T ] O b j
e c t i v e T o i n v e s t i g a t e t h e a n t i -i n
f l a mm a t o r y e f f e c t o f f e r u l i c a c i d (F A )i nh u m a n c o r n e a l e p i t h e l i a l c e l l s i n -d u c e db y A s p e r
g i l l u s f u m i g a t u s . M e t
h o d s C C K -8a s s a y w a s u s e d t oo b s e r v e t h e e f f e c t o f d
i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s o f F As o l u -t i o n (0,50,100,150,200,250,300μm o l /L )o n t h e v i a b i l i t y o f h u m a nc o r n e a l e p i t h e l i a l c e l l s (H C E C );R T -P C R w a su s e d t o m e a s u r e t h e e f f e c t o f F Ao n t h em R N Ae x p r e s s i o n l e v e l s o f t h e i n f l a mm a t o r y f a c t o r s i n t e r l e u k i n -1β(I L -1β)
,i n t e r l e u k i n -6(I L -6),t u m o rn e c r o s i s f a c t o r -α(T N F -α),a n d n u c l e a r f a c t o r e r y t h r o i d 2-r e l a t e d f a c t o r 2(N r f 2)a f t e rH C E Cw e r e i n f e c t e dw i t h i n a c t i v a t e d A s p e r g i l l u s f u m i g
a t u s h y p h a e ;E L I S A w a s u s e d t oo
b s e r v e t h ee f f e
c to fF Ao nt h e p r o t e i ne x p r e s s i o n l e v e l so f t h e i n f l a mm a t o r y f a c t o r s I L -6a n dm o n o c y t e c h e m o t a c t i c p r o t e i n -1(M C P -1). R e s u l t s T h e g r o u p o fH C E Cc e l l s t r e a t e db y 300μm o l /LF As o l u -t i o nh a
d a s i g n i f i c a n t l y l o w
e r c e l l v i a b i l i t y t h a nt h eo t h e r g r o u p s (F =5.390,P <0.05),a n dF As o l u t i o nw i t hac o n c e n t r a t i o no
f 250μm o l /Lo r l e s sh a dn o e f f e c t o n t h e v i a b i l i t y o fH C E C (P >0.05).T r e a t m e n tw i t h 250μm o l /LF As i
g n i f i c a n t l y i n c r e a s e d t
h e m R N Ae x p r e s s
i o n l e v e l o f N r f 2a n d s i g n i f i c a n t l y r e d u c e d t h em R N Ae x p r e s s i o n l e v e l s o f I L -1β,
I L -6,T N F -α,a n d t h e p r o t e i n e x -p r e s s i o n l e v e l o fM C P -1(F =4.720-990.967,P <0.05). C o n c l u s i o n F A m a y e x e r t a n a n t i -i n f l a mm a t o r y e f f e c t b y u p r e g u l a t i n g
t h e e x p r e s s i o no fN r f 2a n d i n h i b i t i n g t h e e x p r e s s i o n o f p r o -i n f l a mm a t o r y f a c t o r s i n t h e i n f l a mm a t o r y r e s p o n s e o fH C E C i n d u c e d b y
A s p e r g i l l u s f u m i g
a t u s .[K E Y W O R D S ] f e r u l i c a c i d ;A s p e r g i l l u s f u m i g
a t u s ;h u m a n c o r n e a l e p i t h e l i a l c e l l s ;i n f l a mm a t i o n 烟曲霉菌是一种常见的真菌性角膜炎的致病真菌[1]
,可黏附于角膜上皮从而免于宿主的免疫清
除[1-2]
㊂真菌感染时,各种免疫细胞在真菌清除方面发挥重要防御作用[3-4
];但是其引发的过度炎症反应会加重组织损伤[
5-6]㊂目前临床除了常用药物外[7],还需要寻找安全高效的抗炎药物实现抗真菌联合免
疫治疗㊂阿魏酸(4-羟基-3-甲氧基肉桂酸,F A )是一种酚类化合物,可溶于二甲基亚砜(D M S O )
,它具有抗炎[8-9]㊁抗氧化[10]㊁肝脏保护[11]
等功效㊂L AM -
P I A S I 等[12]
研究发现,F A 在脂多糖(L P S )
刺激的小鼠R AW 264.7细胞中发挥抗炎作用㊂最近C A O 等[8]研究发现,F A 可降低促炎因子表达,改善肝损伤的预后,在乙醇性肝损伤中起保护作用[13
]㊂本研究旨在探讨F A 在烟曲霉菌诱导的炎症中的抗炎作用,为真菌性角膜炎的治疗提供新思路㊂现将结果报告如下㊂
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486青岛大学学报(医学版)59卷
1材料和方法
1.1实验材料
人角膜上皮细胞(H C E C)由厦门眼科实验室馈赠,将其接种到10c m细胞培养皿中,在含有体积分数0.10胎牛血清的D M E M培养基中培养(37ħ,含体积分数0.05C O2培养箱)㊂烟曲霉菌(C P C C
3.0772)购自中国微生物菌种保藏中心(S GM C C);
F A(100m g,纯度98%)由麦克林试剂公司提供,用体积分数0.001的D M S O溶解后以100mm o l/L储备液存放于-80ħ;R N A e x p r or e a g e n t裂解液由艾科瑞生物公司提供;酶联免疫吸附试验(E L I S A)试剂盒由B i o l e g e n d公司提供;H i S c r i p tⅢR TS u-p e r M i x(南京诺唯赞生物公司)㊂
1.2实验方法
1.2.1烟曲霉菌丝制备将烟曲霉菌接种到沙氏液体培养基中培养48~72h(37ħ,含体积分数0.05C O2培养箱),待培养基中覆盖白色绒毛团块状菌落,将菌落转移至玻璃研磨棒中研磨至匀浆状态,加入体积分数0.75乙醇灭活(4ħ,48h)后得到灭活烟曲霉菌丝,使用血细胞计数器计数并调整菌丝浓度至1ˑ1011C F U/L后用于体外细胞实验㊂1.2.2 F A溶液制备用无菌P B S将F A溶液稀释至实验需要浓度(0~300μm o l/L)用于后续实验,
F A溶液中D M S O含量低于1ɢ㊂
1.2.3 C C K-8细胞毒性实验检测H C E C存活率96孔板中加入H C E C,达到80%融合时,向细胞中加入新的D M E M细胞培养液或含不同浓度F A (0~300μm o l/L)的D M E M细胞培养液,继续孵育24h(37ħ,含体积分数0.05C O2培养箱),弃去培养液并加入P B S洗去悬浮细胞及药物残留㊂向96孔板中分别加入100μL的D M E M细胞培养液和10μLC C K-8检测试剂,37ħ孵育2h㊂使用酶标仪检测各孔450㊁600n m波长处吸光度并计算细胞存活率㊂
1.2.4实时聚合酶链反应(R T-P C R)检测H C E C 中炎症因子及核因子E2相关因子2(N r f2)m R N A 表达将细胞加入12孔板或96孔板,随机分为空白对照组(A组)㊁单纯F A处理组(B组)㊁单纯加菌处理组(C组)和加菌+F A处理组(D组),向H C E C 加或不加F A(终浓度250μm o l/L)预处理2h,并向每孔中加入灭活烟曲霉菌菌丝(1ˑ1011C F U/L) 60μL培养24h(37ħ,含体积分数0.05C O2培养箱)㊂吸弃培养液并加入P B S洗涤3次,各孔中加入500μLR N A e x p r o r e a g e n t裂解液,充分研磨并转移入E P管中提取总R N A㊂采用R N A紫外线可见光度法(N a n o d r o p2000,T h e r m oF i s h e r)测定总R N A浓度,应用H i S c r i p tⅢR T S u p e r M i x处理R N A样本并逆转录为c D N A㊂根据产品说明书方法向c D N A样本中加入D E P C水和S Y B R预混液,进行R T-P C R分析(Q u a n t S t u d i o T M5实时荧光定量P C R系统,T h e r m oF i s h e r)㊂R T-P C R的引物及其序列见表1㊂
表1R T-P C R基因引物及其序列
基因名称方向引物序列(5'ң3')基因库
G A P D H F T G G C A C C C A G C A C A A T G A A
R C T A A G T C A T A G T C C G C C T A G A A G C A N M_001101.5 I L-1βF G C T G A T G G C C C T A A A C A G A T G A A
R T C C A T G G C C A C A A C A A C T G A C N M_000576.3 I L-6F G C T G A T G G C C C T A A A C A G A T G A A
R T C C A T G G C C A C A A C A A C T G A C N M_000576.3 T N F-αF T G C T T G T T C C T C A G C C T C T T
R C A G A G G G C T G A T T A G A G A G A G G T N M_000594.4 N r f2F G G T T G C C C A C A T T C C C A A A T C
R C A A G T G A C T G A A A C G T A G C C G N M_001313901.1 1.2.5 E L I S A法检测H C E C炎症因子I L-6及单核细胞趋化蛋白(M C P-1)蛋白表达水平根据1.2.4方法将H C E C分组并处理,4ħ㊁5000r/m i n离心后取上清液并转入新的E P管中,应用E L I S A试剂盒采用双抗体夹心法检测各组I L-6和M C P-1蛋白表达水平,按试剂盒说明进行操作㊂酶标仪检测450n m及570n m波长处吸光度,以其表示I L-6和M C P-1蛋白表达水平㊂
1.3统计学方法
使用G r a p hP a dP r i s m9.0软件进行统计学处理㊂计量资料结果采用 xʃs表示,多组比较采用单因素方差分析(组间两两比较采用B o n f e r r o n i法)及双因素析因设计方差分析㊂以P<0.05为差异有统计学意义㊂
2结果
2.1不同浓度F A溶液对H C E C活力的影响
不同浓度的F A(0㊁50㊁100㊁150㊁200㊁250及300μm o l/L)与H C E C共孵育24h后,300μm o l/L F A溶液处理组H C E C存活率低于其他各组,差异均有统计学意义(n=6,F=5.390,P<0.05)㊂250μm o l/L及以下浓度F A溶液处理组的H C E C
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4期
张飒飒,等.阿魏酸在烟曲霉菌诱导人角膜上皮细胞中的抗炎作用487
存活率与正常对照组(N 组)
相比差异无统计学意义(P >0.05)㊂见图1㊂后续实验选择250μm o l /L 作
为研究浓度
㊂
图1 不同浓度F A 处理组H C E C 存活率比较
2.2 F A 对烟曲霉菌诱导的H C E C 炎症因子以及
N r f 2m R N A 表达的影响R T -P C R 法检测结果显示,F A 处理(F F A =
7.195~18.560,P <0.01)㊁灭活菌丝处理(F A F =23.130~141.468,P <0.001)㊁F A 与灭活菌丝处理
产生的交互效应(F F AˑA F =8.731~18.536,P <
0.01)对H C E C 炎症因子I L -1β㊁I L -6及T N F -αm R N A 表达的影响均有统计学意义㊂单独效应结果显示,不用灭活菌丝处理时,F A 处理和不处理对m R N A 的表达均无影响(P >0.05);用灭活菌丝处理时,F A 处理组的I L -1β㊁I L -6及T N F -αm R N A 表达较不处理组明显降低(F =15.889~47.471,
P <0.001)㊂不用F A 处理时,灭活菌丝处理和不处理对I L -1β㊁I L -6及T N F -αm R N A 表达的影响均有统计学意义(F =30.141~94.603,P <0.001)
;用F A 处理时,灭活菌丝处理和不处理相比,各因子m R N A 表达水平差异均有统计学意义(F =4.720~23.860,P <0.05)
㊂双因素析因方差分析还显示,F A 处理(F F A =4.860,P <0.05)及灭活菌丝处理(F A F =37.652,P <0.05)对N r f 2m R N A 表达影响有统计学意义;但F A 与灭活菌丝处理无交互效应(F F AˑA F =2.757,P >0.05
)㊂见表2㊂2.3 F A 对烟曲霉菌诱导的H C E C 中I L -6以及M C P -1蛋白表达的影响E L I S A 方法检测结果显示,F A 处理(F F A =
299.155㊁388.573,P <0.01)㊁灭活菌丝处理(F A F =
421.591㊁809.406,P <0.01)㊁F A 与灭活菌丝处理产生的交互效应(F F AˑA F =258.206㊁298.778,P <
0.01)对I L -6及M C P -1蛋白表达的影响均有统计学意义㊂单独效应结果显示,不用灭活菌丝处理时,
F A 处理和不处理对I L -6及M C P -1蛋白的表达均
无影响(P >0.05);用灭活菌丝处理时,F A 处理较
不处理I L -6及M C P -1蛋白表达均明显降低(F =
556.608㊁684.406,P <0.01)㊂不用F A 处理时,灭活菌丝处理和不处理对I L -6及M C P -1蛋白表达的
影响差异均有显著性(F =715.097㊁990.964,P <
0.01);用F A 处理时,
灭活菌丝处理和不处理相比,I L -6及M C P -1蛋白表达水平差异均有统计学意义(F =5.273㊁76.648,P <0.05
)㊂见表3㊂表2 F A 对I L -1β㊁
I L -6㊁T N F -α和N r f 2m R N A 表达的影响(n =6, x ʃ
s )组别
I L -1β
*
I L -6*
T N F -α*
N r f
2A 组1.014ʃ0.1851.137ʃ0.5811.040ʃ0.3041.076ʃ0.477B 组0.957ʃ0.2471.113ʃ0.4811.082ʃ0.1971.173ʃ0.323C 组3.241ʃ0.58016.971ʃ5.4022.274ʃ0.6501.857ʃ0.621
D 组1.657ʃ0.4549.065ʃ1.4381.380ʃ0.2312.533ʃ0.139
注:*析因设计方差分析显示,F A F =23.130~141.468,P <
0.01;F F A =7.195~18.560,P <0.001;F F AˑA F =8.731~18.536,P <0.01㊂
表3 F A 对I L -6及M C P -1蛋白表达的影响(n =8, x ʃ
s )组别I L -6
M C P -1
A 组255.405ʃ52.19232.675ʃ2.861
B 组219.090ʃ49.324
30.524ʃ0.995C 组
1572.681ʃ127.30566.181ʃ3.831D 组
585.441ʃ81.56833.402ʃ1.127
注:I L -6及M C P -1蛋白表达析因设计方差分析显示,F A F =
421.591㊁809.406,P <0.01;F F A =299.155㊁388.573,P <0.01;
F F AˑA F =258.206㊁298.778,P <0.01㊂
3 讨 论
真菌性角膜炎是导致病人眼部溃疡㊁穿孔甚至
失明的一种严重的眼部感染性疾病[
14]
㊂在亚洲发展中国家的真菌感染中,丝状真菌感染占据主导地
位[15]
㊂植物性角膜损伤㊁角膜接触镜的使用及局部
类固醇的使用已被公认为真菌性角膜炎的主要危险
因素[15]
㊂真菌侵入宿主角膜组织后,真菌细胞壁上
的病原体相关分子模式受体通过释放毒素攻击受损的角膜组织,并被宿主先天免疫细胞表达的模式识
别受体识别[
16
]㊂这一相互作用诱导细胞因子和趋化因子的产生及释放[17
],并招募中性粒细胞及巨噬细胞向感染灶聚集[18
],真菌释放的细胞毒性物质及
免疫细胞聚集引发的过度炎症反应使得真菌性角膜炎溃疡愈合缓慢㊁预后不良㊂真菌性角膜炎的发病率逐年增高,亟待找到新的治疗药物㊂
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488青岛大学学报(医学版)59卷
F A为从当归㊁川芎㊁赤芍等中草药中提取的一种酚酸类化合物,相关研究发现它具有抗氧化[19]㊁抗炎[20]㊁抗凋亡[9]㊁抗菌[21]㊁心肌保护[22]及神经保护[23]等药理作用㊂E R M I S等[24]研究发现,在吲哚美辛诱导的大鼠胃溃疡模型中,F A通过抑制中性粒细胞浸润及降低炎症因子I L-6及T N Fα的表达,减轻胃黏膜充血㊁出血及溃疡的严重程度,从而改善大鼠胃溃疡的预后㊂而F A在真菌性角膜炎中的作用尚未见报道㊂本文研究结果显示,250μm o l/L F A对H C E C的活性没有影响,因此250μm o l/L F A可作为安全浓度用于后续实验㊂
真菌性角膜炎早期通过招募固有免疫细胞产生炎症反应,发挥对真菌的清除作用,但持续的炎症反应会加重组织的损伤[25]㊂中性粒细胞等免疫细胞的持续激活和招募会进一步导致更多的炎症因子及趋化因子的产生和释放[26],这不利于真菌性角膜炎的预后㊂本文R T-P C R检测结果表明,加菌刺激组炎症因子I L-1β㊁I L-6及T N F-αm R N A表达显著,即在真菌感染早期炎症因子如I L-1β㊁I L-6及T N F-α等表达增加,从而诱导炎症细胞的浸润及释放多种炎症递质进一步放大炎症反应来抵御真菌;而加菌处理后给予F A治疗可以显著抑制H C E C中I L-1β㊁I L-6及T N F-αm R N A的表达,从而减轻相关炎症反应㊂L I等[27]研究发现,在L P S诱导的人HM C3小胶质细胞的神经炎症模型中,F A通过抑制I L-1β㊁T N F-α及一氧化氮的产生及表达发挥抗神经炎症作用㊂本文研究结果与其相一致㊂为了进一步确认F A在烟曲霉菌刺激的H C E C中的抗炎作用,本研究应用E L I S A方法检测I L-6及M C P-1蛋白表达,结果显示,250μm o l/L的F A能够显著抑制烟曲霉菌刺激的H C E C炎症反应中I L-6及M C P-1蛋白表达上调㊂有研究显示,在乙醇诱导的C57B L/6小鼠肝损伤模型中,F A可以显著降低丙氨酸氨基转移酶和天冬氨酸氨基转移酶的血清酶活性,减少乙醇刺激后小鼠肝脏细胞细胞质的空泡性坏死及炎症细胞的浸润,抑制M C P-1和I L-6的表达,减轻乙醇对小鼠肝脏的损害[13]㊂本文研究结果与其相一致㊂提示F A可以通过下调真菌性角膜炎炎症因子及趋化因子的过度表达来改善真菌性角膜炎的炎症反应㊂
在真菌性角膜炎病程中,在控制真菌感染后期炎症反应的同时可以着力促进角膜上皮的修复,从而改善真菌性角膜炎的预后㊂已有研究显示,N r f2
不仅可以抑制促炎因子及炎症标志物的过表达,还可以通过与血红素氧合酶(HO-1)启动子抗氧化反应元件结合上调HO-1的表达,从而进一步抑制促炎因子的过表达,提示N r f2/HO-1信号通路在炎症反应中发挥负调控作用[28-29]㊂我们实验室早先的研究发现,萜类化合物紫苏醛㊁衣康酸二甲酯及没食子酸可通过增加N r f2和HO-1的表达,抑制I L-1β㊁I L-6㊁I L-8及T N F-α等炎症因子的表达,在真菌性角膜炎中发挥强大的抑炎作用[26,30]㊂而F A N等[26]的研究结果显示,紫苏醛通过N r f2/HO-1信号通路下调I L-1β㊁I L-6及T N F-α的表达水平从而发挥强大的抗炎作用㊂其研究还发现,在烟曲霉菌感染的早期N r f2表达水平上调,参与烟曲霉菌感染的免疫应答,且N r f2/HO-1信号通路可通过抑制下游炎症因子的表达水平发挥抗炎作用㊂本文研究结果显示,单纯加菌处理组N r f2m R N A的表达增加,而加菌加F A处理组N r f2m R N A表达相较于单纯加菌处理组显著上调㊂由此我们认为,在烟曲霉菌刺激的H C E C中,F A通过增加N r f2的表达水平发挥抗炎作用㊂
综上所述,F A能够通过增强N r f2的表达和调控炎症因子及趋化因子的表达,减轻烟曲霉菌感染后H C E C的炎症反应㊂以后的研究可能倾向于探讨F A在体内外烟曲霉菌感染模型中发挥抗炎作用的多种机制,以期推进F A用于真菌性角膜炎治疗的临床研究㊂
[参考文献]
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(本文编辑黄建乡)
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