马氏珠母贝Pm-miR-183序列分析及功能研究

马氏珠母贝Pm-miR-183序列分析及功能研究
熊新威;郑哲;焦钰;邓岳文;杜晓东
【摘要】用马氏珠母贝基因组序列,通过生物信息学方法获得Pm-miR-183的前体,长度76 bp,具有典型的茎环结构.成熟序列及前体序列的同源性分析均显示较高的种间保守性.Pm-miR-183前体序列(Pm-pre-miR-183)的系统进化树分析,Pm-pre-miR-183与帽贝同源性较高.靶向关系分析,Pm-miR-183与矿化基因及免疫相关基因均存在靶向作用位点.实时荧光定量分析,Pm-miR-183在马氏珠母贝的各组织中均有表达.注射 Pm-miR-183 mimics进行过表达,Pm-miR-183的表达量在套膜区(MP)中显著上调(P<0.05).扫描电子显微镜(scanning electron microscope,SEM)检测,Pm-miR-183过表达会导致贝壳珍珠层生长出现紊乱.%MiRNAs are non-coding small RNAs involved in negatively transcriptional regulation. In our previous study, we had identified a miR-183 homologue in Pinctada fucata martensii by Solexa deep sequencing.Based on bioinformatics results obtained from whole genome sequence of P. f.martensii, the precursor Pm-miR-183(Pm-pre-miR-
183)obtained has a length of 76 bp and a typical stem-loop structure. Homology analysis of mature sequence and previous sequence indicated that they were highly conserved with other species. Phylogenetic analysis of precursor sequence showed that Pm-pre-miR-183 had a higher homology to Lottia gigante. The potential interactions among Pm-miR-183 and several mineralized genes and immune-related genes were obtained by target prediction. Pm-miR-183 was expressed in different tissues. In addition, after injection of Pm-miR-183 mimics, the expression of Pm-miR-
183 was significantly up-regulated in the mantle pallial. The result of SEM showed that there were adnormal growth of nacre in shell. This study shows that Pm-miR-183 could be involved in the formation of pearl oyster in P.f.martensii.
【期刊名称】《广东海洋大学学报》
【年(卷),期】2017(037)006
【总页数】8页(P11-18)
【关键词】马氏珠母贝;Pm-miR-183;生物矿化;miRNA调控
【作者】熊新威;郑哲;焦钰;邓岳文;杜晓东
【作者单位】广东海洋大学水产学院//广东省珍珠养殖与加工工程技术研究中心,广东湛江 524088;广东海洋大学水产学院//广东省珍珠养殖与加工工程技术研究中心,广东湛江 524088;广东海洋大学水产学院//广东省珍珠养殖与加工工程技术研究中心,广东湛江 524088;广东海洋大学水产学院//广东省珍珠养殖与加工工程技术研究中心,广东湛江 524088;广东海洋大学水产学院//广东省珍珠养殖与加工工程技术研究中心,广东湛江 524088
【正文语种】中文
【中图分类】S917.4
MicroRNA（miRNA）是在动植物以及病毒体内发现的一种参与转录后调控的非编码小RNA[1]。

研究表明，成熟miRNA 5′端第2 – 7位核苷酸序列为种子序列（Seed Sequence）[2]，可以与靶mRNA通过完全或不完全的碱基互补配对进行结合，从而剪切降解靶mRNA或抑制其转录[3,4]。

miRNA在生物体内普遍存
在。

在人类中，超过三分之一的蛋白质编码基因受到microRNAs的调控[2]。

miRNA作为负调节子，在骨形成和骨稳态上起重要作用[5-6]。

贝壳、珍珠和骨的形成均属于典型的生物矿化过程[7]。

研究发现miRNAs（如miR-29a，miR-2305）在珍珠层生物矿化中发挥重要的调控作用[8-10]。

miR-183是miR-183基因簇（miR-183、miR-96和miR-182）中的成员。

在脊椎动物中miR-183基因簇位于7号染色体NRF1和UBE2H基因间的DNA区域[11]。

miR-183参与骨肉瘤、乳腺癌和肺癌等多种癌症过程[12-14]。

例如miRNA-183-5p可以通过靶向下调PDCD4以促进细胞增殖并抑制人乳腺癌细胞凋亡[15]。

此外，miR-183在感觉器官、视觉器官和听觉器官的发育上起着调控作用[16-17]。

在早期内耳发育期间，miR-183通过抑制整合素α3以控制耳蜗中的细胞增殖[18]。

在脊椎动物中，miR-183广泛参与免疫应答过程[19-21]。

miR-183还参与了生物矿化的调控，如miR-183通过抑制血红素加氧酶1促进破骨细胞的生成[22]。

然而，miR-183在贝类分子调控机制的研究鲜见报道。

马氏珠母贝又称合浦珠母贝，是我国和日本重要的人工海水珍珠育珠贝类[23]。

前期研究发现转录因子Pm-Runt可能受到Pm-miR-183的调节，参与珍珠层的形成[24]。

而在扇贝中，转录因子cfRunt在免疫应答中发挥重要的调控作用[25]。

因此，探究Pm-miR-183在珍珠层形成的调控作用，对阐释珍珠层形成的调控机制以及珍珠生产上都具有重要意义。

本研究对Pm-miR-183的前体及特征进行分析，并对Pm-miR-183在贝壳珍珠层形成中的功能进行了初步探究，为研究Pm-miR-183在马氏珠母贝中的分子调控机制提供参考。

选取规格一致，健康的二龄马氏珠母贝迅速分离外套膜边缘区（ME）、外套膜套膜区（MP）、中央膜区（MC）、足（F）、肝胰腺（HE）、性腺（GO）、闭壳肌（A）、鳃（GI），液氮速冻保存；取经过Pm-miR-183 mimics和microRNA N.C.mimics注射的马氏珠母贝，迅速分离外套膜套膜区（MP），并
立即投入液氮中保存。

将材料从液氮中转移至-80 ℃冰箱保存。

Trizol购自Invitrogen公司；Reverse Transcriptase M-M LV（RNase H）、Reconbinant Rnase Inhibitor、dNTP Mixture、5x M-MLV Transcription Buffer、Marker和6x loading buffer等购自大连宝生物工程有限公司；琼脂糖H购自生物工程有限公司；Gold View购自Thermo Fish；SYBR®Select Master Mix购自Applied Biosystems公司；Pm-miR-183 mimics和microRNA N.C. mimics购自上海吉玛公司。

以马氏珠母贝基因组为数据库[26]，通过本地Blast获取可能的Pm-miR-183的前体序列。

利用在线软件M-fold[27]预测Pm-miR-183前体序列的二级结构，对可形成茎环结构且茎部错配小于3 bp的为Pm-miR-183前体。

从miBase 21[28]中下载人、小鼠、大鼠、猪、牛、鸡、树鼩、婆罗洲猩猩、恒河猴、斑胸草雀、鸭嘴兽、爪蟾、八目鳗、红鳍东方鲀、玻璃海鞘、斑马鱼和帽贝的成熟miR-183序列，利用CLUSTALW在线工具进行多序列比对。

对帽贝、人、斑马鱼、大鼠和牛进行前体序列的多序列比对。

同时对马氏珠母贝、帽贝、紫海胆、绿色海胆、斑胸草雀、鸡、白唇狨、大猩猩、佛罗里达文昌鱼、厦门文昌鱼、恒河猴、大鼠、人、婆罗洲猩猩、家山羊和树鼩做聚类分析。

从NCBI数据库中下载跟马氏珠母贝矿化免疫相关基因的3′ UTR，并与Pm-miR-183进行靶向关系预测。

预测分析采用miRanda软件，以自由能小于等于18 kCal /Mol作为阈值[29]获得Pm-miR-183的潜在靶标基因。

参考Trizol 说明书以及董冰冰[30]总RNA提取步骤进行总RNA的提取。

总RNA 的提取材料为：生理状态正常的马氏珠母贝的7个组织（外套膜边缘区（ME）、外套膜套膜区（MP）、中央膜区（MC）、足（F）、肝胰腺（HE）、性腺（GO）、闭壳肌（A）鳃（GI））；过表达实验组和对照组的马氏珠母贝的套膜区（MP）。

总RNA经10 mg/mL琼脂糖凝胶电泳检测其完整性并使用
Nanodrop 2 000核酸定量仪检测其浓度和质量。

将合格的RNA于-80 ℃保存。

从上海吉玛制药技术有限公司订购Pm-miR-183 mimics和microRNA N.C. mimics（N.C.）。

选取10只规格一致健康二龄贝，随机平均分为实验组和对照
组2组，使用微量注射器往闭壳肌上分别注射Pm-miR-183 mimics和N.C.。

注
射浓度为0.1 μg/μL，注射量为100 μL。

72 h后剪取外套膜组织，液氮速冻保存。

RNA提取同1.4所述。

采用茎环法设计茎环引物U6和miR-183并进行特异性反转录，实验使用的所有
引物见表1。

将特异性反转录产物稀释100倍作为实时荧光定量模板样品。

采用
实时荧光定量机器AB7 500进行检测Pm-miR-183的相对表达量。

使用SPSS 22.0对荧光定量数据进行显著性分析，显著性水平α为0.05。

根据实时荧光定量结果，挑选具有显著性差异个体的贝壳进行扫描电子显微镜的观察。

通过序列比对，从马氏珠母贝基因组中获得Pm-miR-183的前体序列（图1-A）。

通过M-fold[27]软件获得Pm-miR-183的二级结构（图1-B），其具有miRNA
典型的茎环结构且成熟序列来自茎环结构5′的一臂。

Pm-miR-183与人、小鼠、大鼠、猪、牛、鸡、树鼩、婆罗洲猩猩、恒河猴、斑
胸草雀、鸭嘴兽、爪蟾、八目鳗、红鳍东方鲀、玻璃海鞘、斑马鱼和帽贝miR-183成熟序列的多序列比对结果（图 2）显示，所有序列在第2-21个碱基完全一样。

Pm-miR-183成熟序列与帽贝成熟序列完全相同。

Pm-miR-183成熟序列与人、小鼠、大鼠、猪、牛、鸡、树鼩的同源性为87%,与婆罗洲猩猩、恒河猴、斑胸草雀、鸭嘴兽、爪蟾、八目鳗、红鳍东方鲀、玻璃海鞘和斑马鱼的同源性为91%。

Pm-miR-183前体序列在各物种间的多序列比对结果（图3）显示,Pm-pre-miR-183与帽贝、斑马鱼等物种具有较高的保守性。

Pm-miR-183前体序列在各物种
间的聚类分析结果（图4）显示，Pm-pre-miR-183与帽贝聚在为一支，与脊椎
动物一支分离。

Pm-miR-183的靶向分析共获得7个潜在的靶标基因（图 5）。

其中包含4个矿
化相关基因和3个免疫相关基因。

矿化相关基因为：骨形态发生蛋白7（BMP7）、骨形态发生蛋白3（BMP3）、MRNP和Aspein。

免疫相关基因为：Galectin、Astacin-like protein（Astacin）和microsomal glutathione S-transferase 3（MGST3）。

Pm-miR-183在马氏珠母贝的各组织的荧光定量结果显示，Pm-miR-183在边缘区、套膜区、中央膜区、足、肝胰腺、性腺、闭壳肌和鳃等处均有表达，其中，在性腺（GO）和中央膜区（MC）中的表达量显著高于其他组织（P＜0.05），在鳃（Gi）、边缘膜（ME）等其它组织中的表达量相对较低（图6）。

Pm-miR-183过表达结果显示，与阴性对照相比Pm-miR-183在套膜区（MP）
的表达量出现了显著上调（P＜0.05, 图7-A）。

SEM结果显示，与阴性对照相比（图7-C）Pm-miR-183过表达后，马氏珠母贝贝壳珍珠层出现了明显的紊乱生
长（图7-B）。

马氏珠母贝是我国重要的人工珍珠育珠贝类[31]。

探究贝壳和珍珠形成的调控机制有助于提高珍珠质量，提升珍珠养殖的经济效益。

前期研究已鉴定获得了258个
马氏珠母贝miRNAs序列，并发现了Pm-miR-183具有潜在的调控生物矿化的功能[23]。

本研究利用生物信息学方法获得了Pm-miR-183的前体序列Pm-pre-miR-183，并对其进行了特征分析。

Pm-pre-miR-183的二级结构特征与传统的microRNA前体序列特征一致，都呈典型的茎环结构。

马氏珠母贝、帽贝和人等
多个物种成熟序列的多序列比对结果显示Pm-miR-183与帽贝的成熟序列完全一致,且与所选脊索动物均具有较高的同源性。

各物种前体序列间的多序列比对结果
同样显示Pm-pre-miR-183与帽贝和斑马鱼等物种具有较高的同源性。

此外，
Pm-pre-miR-183与各物种的聚类分析显示，Pm-pre-miR-183与帽贝聚为一支，
与脊椎动物一支分离，这说明miR-183在进化上较保守，软体动物miR-183可
能来自共同的祖先。

已有研究表明，miRNA对靶标mRNA的识别调控取决于种
子序列[32-3]，而种子序列的相似性说明靶位点的识别可能较为一致[34]。

因此，可推测miR-183家族在脊椎动物和无脊椎动物中可能行使类似的功能。

研究表明，miR-183的功能并不单一，其在各类癌症[12-14]、器官发育[16-17]
和骨形成[22,35]过程中都起重要作用。

荧光定量PCR检测发现Pm-miR-183在
马氏珠母贝各个组织中均有表达，这提示Pm-miR-183在马氏珠母贝中功能的多效性。

为进一步探究Pm-miR-183在马氏珠母贝矿化过程的调控机制，本研究中对Pm-miR-183与矿化免疫相关基因进行靶向预测,结果发现贝壳矿化相关的BMP7、BMP3、MRNP和Aspein是其潜在的靶标基因。

目前均已有研究表明，这些矿化相关基因参与了马氏珠母贝贝壳的形成[36-39]。

此外，本研究进行了
Pm-miR-183活体过表达，结果发现，当Pm-miR-183在套膜区（MP）中的表
达量显著上调时，珍珠层出现明显的紊乱生长现象，提示Pm-miR-183可能参与了马氏珠母贝珍珠层的形成过程。

结果显示，Pm-miR-183可能通过靶向调控这
些矿化相关基因参与马氏珠母贝生物矿化过程。

此外，本研究还发现Pm-miR-183与免疫相关基因具有潜在的靶向调控关系。

由于 miR-183在脊椎动物中广泛参与免疫调控过程，且本研究获得的Pm-miR-183与脊索动物具有较高的同源性，故Pm-miR-183可能也参与了马氏珠母贝的免疫过程。

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