遗传学发展的背景资料

背景资料
遗传学的历史并不长，但其中的发现确实石破天惊，让我们一起来看看，并重新回顾一下当时的惊喜，快乐和担忧。

大约公元前10000年，小麦作物的选择育种开始在地中海地区实行。

大约公元前400年，希腊医生希波克拉底认为，品质是以混合的流体形式由父母传给孩子的，是父母双方的特征的结合。

大约公元前320年，亚里士多德认为婴儿所有的特征来自其父母。

公元100~1000年，印度人意识到一定的身体特征和疾病会在家族中遗传。

1100~160年，欧洲人提出了（不正确的）自然产生的理论，即说生物是有非生命物质产生的，
1630年，威廉.哈维认识到当一个卵子和一个精子结合（尽管这还没有被显微镜看到）后，婴儿就产生了。

1665年，罗伯特.虎克首先用显微镜识别了软木塞上的细胞。

1856年~1868年，奥地利修道士——格雷戈尔.孟德尔研究豌豆种植，发现显性和隐性基因（他称之为因子）。

然而，他的工作没有得到重视。

1859年，约翰.米歇尔从白血球细胞中分离出DNA，尽管，当时无人知道那是什么。

1870~1890年，运用新的显微技术，科学家观察到了染色体，看到了细胞分裂。

1900年，德.夫里耶斯、冯.切尔马克和科伦斯三人重新揭示了孟德尔的理论，证明孟德尔是正确的。

1902年，术语“基因”开始用来描述孟德尔的“因子”。

1905年，埃德蒙.威尔逊和内特.史蒂文斯都各自独立发现是：X和Y染色体决定了一个人是男是女。

1941年，乔治.彼德尔和爱德华.塔特姆每一个基因充当一种特定蛋白质的密码。

1944年，奥斯瓦尔德.埃弗里和他的同事发现DNA携带着遗传信息。

1950年，欧文.查格夫发现DNA内含有等量的四种化学碱基：腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶（常简写为A、C、G、T）。

1952年，罗莎琳的.富兰克林用X光结晶学研究DNA，发现他的螺旋结构。

1953年，沃森和克里克发现了DNA的右手双螺旋分子结构。

1956年，克里克和该莫夫找出DNA中的碱基是如何为不同的蛋白质编码的。

1966年，马歇尔.你伦伯格和他的同事提出了用三字母组的方式为DNA中的不同氨基酸编码的方法。

1972年，保罗.伯格通过结合两股DNA链在一起来改变DNA。

1973年，斯坦利.科汗、安妮.张和赫伯特.博耶将两种细菌的DNA结合，制成最早的基因改性的有机体。

1975年，弗雷德.商格和其他科学家发展了读取DNA序列的方法。

1977年，genentech公司率先用基因改性的细菌制造蛋白质。

1981年，科学家开始发现构成特定疾病的基因，例如癌症。

1985年，卡瑞.穆利斯开发了聚合酶链反应来复制大量的DNA。

1988年，科学家腌制了第一支利用遗传工程及时改变的实验老鼠。

1989年，亚历克.杰弗里斯发展了DNA指纹分析方法，用于犯罪检验。

1990年，人类基因组计划开始实施。

1993年，利用遗传工程技术改变、涉及以有超长保存期的西红柿开始出售。

1996年，多利，第一支从成年哺乳动物克隆出来的动物，诞生于苏格兰的罗斯林研究
所。

2001年，地衣服人类基因组图完成。

2002年，不同的科学家宣称他们正致力于克隆人类。

一、原理
1）基本原理
1.DNA在氯化钠溶液中的溶解度，是随着氯化钠的浓度的变化而改变的。

当氯
化钠的物质的量浓度为0.14 mol/L时，DNA的溶解度最低。

利用这一原理，可
以使溶解在氯化钠溶液中的DNA析出。

2.DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些物质则可以溶于酒精。

利用这一原理，
可以进一步提取出含杂质较少的DNA。

3.DNA遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的
试剂。

2）原理补充
2.1 DNA的释放本实验用鸡血细胞做实验材料有两个原因。

一是因为鸡血细胞核的DNA含量丰富，材料易得；二是鸡血细胞极易吸水胀破。

DNA位于鸡血细胞的细胞核中,正常情况下不会释放出来。

为了使DNA从细胞核中释放出来,实验中采用了向鸡血细胞液中加入蒸馏水并且搅拌的方法。

蒸馏水对于鸡血细胞来说,是一种低渗液体,水分可以大量进入血细胞内,使血细胞破裂。

同时,再加上搅拌的机械作用,就加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂),于是释放出DNA,当然也有RNA。

但是,释放出来的大量DNA和RNA往往与蛋白质结合在一起。

2.2 将DNA与蛋白质分离根据二者的特性,即在浓度较高的氯化钠溶液(物质的量浓度为2 moL/L )中,核蛋白容易解聚,游离出DNA。

而DNA在浓度较高的氯化钠溶液中的溶解度很高,Na+与带负电的DNA结合成DNA钠盐。

这时DNA在溶液中呈溶解状态。

2.3 DNA的析出与获取利用DNA在浓度较低的氯化钠溶液中溶解度小的原理,向含有DNA的浓度较高的氯化钠溶液中加入大量(300 mL )蒸馏水,稀释氯化钠溶液,使DNA 的溶解度下降,而蛋白质的溶解度增高(这就是蛋白质的盐溶现象),从而使二者分离。

这时,加上不停地搅拌,溶解度下降的DNA逐渐呈丝状物。

再通过过滤,滤去蛋白质,就可以获取DNA 的黏稠物了。

如果采用离心法则更好,用4 000 r/min 的旋转频率,离心15 min ,除去上清液(含有蛋白质),留下的沉淀物中含DNA。

2.4 DNA的再溶解再用较高浓度的氯化钠溶液去溶解DNA黏稠物。

2.5 DNA的沉淀和浓缩除去了蛋白质的核酸溶液,必须再进一步沉淀和浓缩。

最常用的方法是酒精沉淀法。

就是将含有Na+的DNA溶液,加入到相当于其两倍体积的体积分数为95%冷酒精溶液中（实验一般要求采用预冷的95％的乙醇，但对比结果显示，常温下的乙醇溶液也可产生明显效果。

从理论上分析，预冷的乙醇溶液具有以下优点。

一是抑制核酸水解酶活性，防止DNA降解；二是降低分子运动，易于形成沉淀析出；三是低温有利于增加DNA分子柔韧性，减少断裂。

）,混匀以后可以使DNA沉淀、浓缩,形成含杂质较少的DNA
丝状物,悬浮于溶液中。

如果出现的丝状物较少,可以将此混合液再放入冰箱中冷却几分。

浓缩后的DNA丝状物,可以用缓缓旋转玻璃棒的方法卷起(因为玻璃棒有吸附DNA的作用)。

2.6 DNA的鉴定本实验中鉴定DNA的方法为二苯胺法。

二苯胺法的原理是:DNA中嘌呤核苷酸上的脱氧核糖遇酸生成ω-羟基-γ酮基戊醛,它再和二苯胺作用而显现蓝色(溶液呈浅蓝色)。

鉴定时溶液蓝色的深浅,与溶液中DNA含量的多少有关。

二、不同材料DNA提取与鉴定方法
1、高中课本上的实验
1.破碎细胞，释放DNA：向5～10 mL的鸡血细胞液加入20 mL蒸馏水。

用玻璃棒沿一个方向小心快速搅拌5 min搅拌，使血细胞膜和核膜胀破。

再用3～4层纱布过滤，除去一些颗粒较大的杂质。

2．溶解细胞核内的DNA：在溶液中加入两倍体积的浓度为2 mol/L的NaCl溶液，搅拌1 min。

注意应沿一个方向搅拌，使DNA充分溶解。

3．DNA的析出：这一步骤是实验成败的关键。

①缓慢贴壁加入蒸馏水，并轻轻地沿一个方向不停地均匀搅拌。

同时控制加水量，使NaCl溶液的终浓度为0.1～0.2 mol/L。

加水过程一般分三次进行，当总加水量为300 mL左右时，DNA已基本析出。

加水太多、溶液过稀，会使DNA分子又重新溶解。

②用3～4层纱布对DNA稀释液进行过滤，滤去蛋白质，收集DNA的黏稠物。

此时注意观察DNA黏稠物的颜色（最佳为白色）。

4.DNA的初步纯化：继续用2 mol/L的NaCl溶液20 mL溶解DNA黏稠物，仍旧沿一个方向不停搅拌3 min，使DNA充分溶解。

用3～4层纱布进行过滤，滤去杂质，收集含有DNA 的滤液。

向滤液中贴壁缓慢加入50 mL预冷的体积分数为95％的乙醇，并用玻璃棒朝一个方向缓慢、均匀地搅拌(玻璃棒不要直插到烧杯底部)，溶液中会出现DNA丝状物。

(因为玻璃棒有吸附DNA的作用。

也可以用筷子等表面粗糙的用具来帮助DNA分子缠绕。

)。

5．DNA的鉴定：用0.015 mol/L的NaCl溶液5mL溶解DNA丝状物。

加入4mL二苯胺试剂，置于沸水中加热5min，注意观察试管溶液颜色的变化。

（要做对照组）
2、几种新材料的DNA粗提取与鉴定介绍
2.1新鲜菜花(或蒜黄、菠菜)DNA粗提取与鉴定
一.材料用具
新鲜菜花(或蒜黄、菠菜)。

塑料烧杯,量筒,玻璃棒,尼龙纱布,陶瓷研钵,试管,试管架,试管夹,漏斗,酒精灯,石棉网,三角架,火柴,刀片,天平。

研磨液,体积分数为95%的酒精溶液,二苯胺试剂,蒸馏水。

二.方法步骤
(1)DNA的粗提取
①准备材料将新鲜菜花和体积分数为95%的酒精溶液放入冰箱冷冻室,至少24 h。

②取材称取30 g菜花,去梗取花,切碎。

③研磨将碎菜花放入研钵中,倒入10 mL研磨液,充分研磨10 min 。

④过滤在漏斗中垫上尼龙纱布,将菜花研磨液滤入烧杯中(有条件的学校可将滤液倒入塑料离心管中进行离心,用1 000r/min的旋转频率,离心25 min,取上清液放入烧杯中)。

在4S冰箱中放置几分后,再取上清液。

⑤加冷酒精将一倍体积的上清液倒入两倍体积的体积分数为95%的冷酒精溶液中,并用玻璃棒缓缓地轻轻搅拌溶液(玻璃棒不要直插烧杯底部)。

沉淀35 min后,可见白色的DNA 絮状物出现。

用玻璃棒缓缓旋转,絮状物会缠在玻璃棒上。

(2)DNA的鉴定
①配制二苯胺试剂取0.1 mL B液,滴入到10 mL A液中,混匀。

②鉴定取4 mL DNA提取液放入试管中,加入4 mL 二苯胺试剂,混匀后观察溶液颜色(不变蓝)。

用沸水浴(100 ℃)加热10 min 。

在加热过程中,随时注意试管中溶液颜色的变化(逐渐出现浅蓝色)。

2.2洋葱DNA粗提取实验与鉴定（值得推介，它取材容易，操作简便，效果明显。

）
一、实验原理
洗涤剂等去污剂可以溶解细胞的细胞壁，破坏细胞膜，同时也能使蛋白质变性。

当细胞壁破坏后，细胞释放出核酸与蛋白质形成的复合物——核糖核蛋白(RNP)和脱氧核糖核蛋白(DNP)，这两种复合物在不同电解质溶液中的溶解度有较大差异。

当NaCl浓度达到0.14mol ／L时，DNP溶解度约为纯水中溶解度的1％，但RNP则不一样，在0.14mol／L NaCl溶液中，DNP溶解度很低，而RNP的溶解度仍相当大，因此在制备DNA时，利用0.14mol／L稀盐溶液使DNP与RNP分开。

去除蛋白质后的核酸盐溶液，再利用其不溶于有机溶剂的性质，但细胞中的其他物质则可以溶于有机溶剂，应用适当浓度的有机溶剂 (如乙醇)使DNA呈絮状沉淀析出（本实验加入酒精后使食盐浓度接近0.14mol/L）。

在溶液中，DNA链略带负电荷，而盐离子可被吸引到DNA的负电荷上，中和这些负电荷，因此就能够使DNA片段聚合在一起，形成絮状粘稠物质。

利用这一原理，就可以用酒精萃取DNA。

DNA与二苯胺作用生成蓝色沉淀用来鉴定 DNA。

二. 材料：洋葱、洗洁精、食盐、95％酒精、蒸馏水、
0.015 mol／L的NaCl溶液：称取0.88g NaCl，投入1000ml容量瓶中，加水到所需体积的刻度线上，溶解后成0.015 mol／L氯化钠溶液。

二苯胺试剂：1 g重结晶的二苯胺溶于100ml冰乙酸（A.R.）中，再加10ml过氯酸，临用前加入1.0ml 16%的乙醛，试剂应为无色，
三.器具：
匀浆机或研钵、纱布、漏斗、烧杯、玻璃棒、量筒、滴管、试管、天平。

四.方法步骤
称取100 g洋葱，切碎，放进搅拌机或研钵中
加入100ml洗洁精
充分搅拌或研磨
将研磨液用漏斗和两层纱布过滤到烧杯中
加入1g食盐，搅拌均匀
量取上述澄清的洋葱液50ml
加入70ml的95％酒精
轻轻摇动或用玻璃棒轻轻搅拌
白色纤维状粘稠物质析出，即DNA
用玻璃棒可将其轻轻卷起，放入1号试管
搅拌溶解后，加入4ml二苯胺试剂
混合均匀，在沸水浴中加热 3～8min，观察颜色的变化。

五. 实验注意事项
1)材料必须充分匀浆或研磨，否则洋葱细胞没有完全破碎，影响实验效果；
2)加入酒精后摇动或搅拌时一定要轻缓，否则会破坏DNA，以至于看不到；
3)DNA鉴定时，二苯胺最好现配现用，否则二苯胺会变成浅蓝色或绿色，则不能使用。

3.几种新材料的DNA粗提取介绍
3.1 细菌DNA提取方法（尤其对有荚膜的细菌）
方法一
1．种子加入2ml盛有4℃预冷的抽提缓冲液（8M LiCl，2% b-巯基乙醇仅针对RNA）离心管中，4℃过夜；
2．离心4s，转移上清到2ml新管中（针对植物）；
3．离心，12,000rpm，30min，4℃（仅针对RNA）；
4．弃上清液，用70％乙醇洗沉淀，风干；
5．溶解上述沉淀于缓冲液（5%SDS，10mMNaCl，25mM EDTA，10mM Tris-HCl，pH7.6，2％巯基乙醇）中；
6．加入等体积的酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）
7．离心12,000rpm，10min，转移上清到新管中.
8．加入等体积氯仿/异戊醇(24：1)
9．离心12,000rpm，10min，转移上清到新管中
10．分装至两支1.5ml离心管中，各加入1/10体积的3M醋酸钠和1.5倍体积的乙醇（或加入等体积的异丙醇），－200C沉淀；
11．离心12,000rpm，10min；
12. 弃上清，70％乙醇洗，也可以再用100％乙醇洗，然后溶解于100ml 水中。

方法二
1．试剂：抽提缓冲液、2% CTAB (W/V)、 2% PVP K25 (w/v) （去色素）、100mM Tris-HCl (pH8.0)、 25mM EDTA (pH8.0)、 2.0M NaClbM.、 2.10M LiClr+1、3. 2M LiCl, DEPC-water（抑制RNA酶活性）、 3M NaAc (pH5.2) 、96% 乙醇、 70% 乙醇2．步骤：
1）抽提缓冲液65℃预热；
2）加菌体到已经预热的缓冲液（700ul）中混匀，65℃，10min；;
3）加酚、氯仿、异戊醇（25：24：1），振荡，离心12,000rpm，10min；
4）取上清，加氯仿、异戊醇（24：1）振荡，离心12,000rpm，10min；
5）取上清，重复4步骤；
6）加10M LiCl 1/4体积到上清液；
7）4℃过夜，沉淀DNA；
8）离心（12,000rpm，10min），弃上清；
9）70％乙醇洗，再用100％乙醇洗，风干；
10）加入1/10体积的3M醋酸钠和1.5倍体积的乙醇（或加入等体积的异丙醇），－200C沉淀；
11）离心12,000rpm，10min；
12）弃上清，70％乙醇洗，也可以再用100％乙醇洗，然后溶解于100ml 水中。

3.2 从动物组织提取DNA的方法：
一、材料：哺乳动物新鲜组织。

二、设备：移液管、高速冷冻离心机、台式离心机、水浴锅。

三、试剂
1、分离缓冲液：10mmol/L Tris·Cl pH7.4, 10mmol/L NaCl, 25mmol/L EDTA。

2、其它试剂：10% SDS，蛋白酶 K (20mg/ml或粉剂)，乙醚，酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，无水乙醇及70%乙醇，5mol/L NaCl，3mol/L NaAc，TE。

四、操作步骤:
1. 切取组织5g左右,剔除结缔组织,吸水纸吸干血液,剪碎放入研钵(越细越好)。

2. 倒入液氮,磨成粉末,加10ml分离缓冲液。

3. 加1ml 10% SDS, 混匀,此时样品变得很粘稠。

4. 加50ul或1mg 蛋白酶 K, 37℃保温1-2小时, 直到组织完全解体。

5. 加1ml 5mol/L NaCl, 混匀,5000rpm离心数秒钟。

6.取上清液于新离心管，用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提。

待分层后,3000rpm 离心 5分钟。

7. 取上层水相至干净离心管, 加2倍体积乙醚抽提(在通风情况下操作)。

8. 移去上层乙醚,保留下层水相。

9. 加1/10 体积3mol/L NaAc, 及2倍体积无水乙醇颠倒混合沉淀DNA。

室温下静止10-20分钟，DNA沉淀形成白色絮状物。

10. 用玻棒钩出DNA沉淀,70%乙醇中漂洗后,在吸水纸上吸干,溶解于1ml TE中,-20℃保存。

11. 如果DNA溶液中有不溶解颗粒,可在5000rpm短暂离心,取上清; 如要除去其中的RNA,可加5μl RNaseA(10μg/μl), 37℃保温30分钟, 用酚抽提后, 按步骤9-10重沉淀DNA。

3.3 大豆DNA的提取
将新鲜大豆叶片保存在冰箱，用时取出。

1、称取大豆叶片2克左右，放入研磨钵中，倒入液氮，将其研碎成粉末。

2、将粉末装入50ml离心管中；同时将CTAB提取液放入水浴锅中，加温至65度。

3、吸取10ml的CTAB提取液和200ul的巯基乙醇放入装有叶片粉末的离心管中。

4、充分振荡后，放入65度的水浴锅中，大约40分钟；其间，每隔10分钟轻轻的摇
晃离心管，使溶液和粉末充分混合。

5、40分钟后，取出冷却至室温，加入等体积的氯仿异戊醇（24：1），充分混匀。

6、然后将离心管放入离心机中离心，转速12000rpm，时间大概15分钟，即可。

7、取上清液至另一离心管中，再吸取等体积的氯仿异戊醇，混匀离心，重复上述步骤。

8、再一次吸取上清液，加入2倍于该上清液体积的冰无水乙醇，轻轻混匀（因为此时DNA已有少许絮状沉淀，避免DNA断裂），放入4度冰箱中，大概1小时左右。

9、将DNA沉淀用玻璃器皿将其挑到1.5ml的离心管中，用70%的酒精清洗两遍，放
置室温中，待其酒精味挥发完之后（用鼻子闻闻），加入TE溶液即可，这就是DNA原液，放入-20度冰箱保存即可。

3.4 植物DNA的SDS（十二烷基硫酸钠）提取法：
取2-3g新鲜叶片，在液氮中研磨成粉状（防止溶化）后转入15ml离心管中。

加入5ml 于65℃预热的提取缓冲液，65℃水浴保温30min（摇动数次），使提取液与样品充分混合。

加入2ml 5mol/L Kac，剧烈振荡，冰浴保温20 min以上。

2700转离心20min，将上清液倒入新的15ml离心管中，（若提取DNA用于Southern等实验，一般在转移上清时加滤膜，防止样品残渣混入，可保证DNA纯度）。

加入4ml氯仿/异戊醇（24∶1），摇匀，平衡，2700 转离心15 min。

在另一新的15ml离心管中加入5ml预冷的异丙醇，将上清液用移液枪转入此管，在－20℃冷却30 min以上。

2700转离心10 min，弃去上清液，用4ml 70%乙醇洗涤，室温保持10 min。

2700转离心3 min，倒去上清液。

重复步骤7，用4ml 70%乙醇洗涤，室温保持10 min。

2700转离心3min，倒去上清液。

超净工作台内吹干（3h左右）。

加1ml TE 缓冲液中溶解，加10μl RNase （10mg/ml），在37℃恒温箱中温育20min。

再加100μl 3 mol/L NaAc和2ml无水乙醇，2700转离心3min，倒去上清液。

超净工作台内吹干（3h左右）。

将DNA沉淀溶于150μl TE中，置于超净工作台内（3h左右）。

将TE溶液转入已灭菌的15ml eppendorf管中,－20℃保存备用。

3.5 植物DNA的“一管法”提取方法：
称取100mg新鲜植物组织，剪碎置于15ml离心管中，可加入少许无菌石英砂，加入3 滴提取缓冲液，用带玻璃钻头的电钻充分研磨匀浆。

加入400μl提取缓冲液，混匀后置于90℃水浴中，不时颠倒摇匀。

温育20min后，置于冰浴中5min，使组织和聚乙烯聚吡咯烷
酮（PVPP）沉淀，置于4℃下保存备用。

3.6 适用于PCR研究的快速提取法：
田间剪取植株新鲜叶片5－10mg（约2cm长）左右，新鲜叶片放于15ml离心管中，存
于冰盒中，根据样品号贴上相应的标签。

用剪刀将叶片组织剪细（约0.5cm长）放在点穴式研板中。

加入400μl DNA提取缓冲液，用玻棒将叶组织研细，直到液体变成深绿色即可。

再加400μl DNA提取缓冲液，混合均匀，转入一新的15ml离心管（贴上相应的编号）。

加400μl氯仿，混合均匀后，2400转离心30s，将上清液转入一支新的15ml离心管（贴上相应的编号）。

加800μl无水乙醇，混匀，2400转离心3min。

弃上清。

70%乙醇冲洗，风干。

用50μl TE缓冲液溶解，存于－20℃。

取1μl用于PCR分析。

3.7 棉花等酚类、多糖类物质较多的植物DNA提取法：
取2g新鲜幼嫩的叶片放入研钵中，加入液氮后快速、充分研磨，待成极细的粉末状时迅速转入到50ml离心管中。

在50ml离心管中加入10ml冰预冷的提取缓冲液，在涡悬振荡器上充分混匀。

于4℃，2700转离心20min，倒去上清液在沉淀中加入5ml裂解缓冲液，在涡旋振荡器上充分混匀。

于65℃水浴锅中温育30min。

加入5ml氯仿/异戊醇（24/1），并上下翻转以充分混合。

于4℃，2700转离心5min。

转移上层水相至一新的50ml离心管中。

重复步骤7－9一次。

加入2/3体积的冰预冷的异丙醇，并上下翻转以充分混合，至－20℃ 2h。

于4℃，1200转离心10min。

在一新管中加入20ml含80%乙醇15m mol/L NaAc溶液，用玻棒将DNA转入该管（如不能直接用玻棒缠出，可离心后倒出上清，再在其中加入20ml含80% 乙醇15m mol/L NaAc溶液），放置20min后稍许离心，移走上清并吸出残存乙醇，室温干燥。

加入1 0ml TE（10 m mol/L Tris-HCl pH=8.0、1 m mol/L EDTA）并加入终浓度为20g/L 的RnaseA，过夜。

风干，用50μl TE缓冲液溶解，存于－20℃备用。

3.8 植物DNA的CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）提取法：
称取新鲜叶片2-3g，剪碎放入研钵中，在液氮中研磨成粉末。

将粉末转移到的加有7ml 经预热的15×CTAB提取缓冲液15ml离心管中，迅速混匀后置于65℃水浴中，温育30min。

取出离心管,冷却至室温，加入氯仿、异戊醇(24:1)，充分混匀，室温下2300转离心20min。

将上清转移至另一新的15ml离心管中，加入1/10体积10%的CTAB和等体积的氯仿/异戊醇。

充分混匀，2300转离心20min。

转移上清至另一新的15ml离心管中，加入等体积1%的CTAB沉淀缓冲液，轻轻摇晃至形成DNA絮状沉淀。

1000转离心10min，使DNA沉淀于管底。

加入1.5-2ml的1mol/L NaCl及5μl RNase置于56℃水浴中过夜。

待DNA完全溶解后，加2-3ml 4℃预冷的95%的冰乙醇使DNA沉淀，挑出DNA，置于15ml离心管中。

用70%乙醇清洗30min，用离心机甩5s，倒出70%乙醇，再用95%乙醇浸泡5min，倒出95%乙醇，在超净工作台上吹干。

将风干的DNA直接在4℃保存备用或溶于100μl TE溶液中于-20℃保存。

三、试剂配制
二苯胺试剂的配制
A液：15 g二苯胺溶于100 mL 冰醋酸中,再加15 mL浓硫酸,用棕色瓶保存。

如冰醋酸呈结晶状态,则需加温后待其熔化,再使用。

B液：乙醛的体积分数为0.2%的溶液。

将0.1 mL B液加入到10 mL A液中,现配现用。

研磨液的配制方法
Tris（三羟甲基氨基甲烷）：10.1 g(相对分子质量为121.14),先加50 mL 蒸馏水溶解,用物质的量浓度为2 moL/L 的盐酸调至pH8.0,再加下述药品。

NaCl：8.76 g(相对分子质量58.44)
EDTA（乙二胺四乙酸二钠）：37.2 g(相对分子质量372.24)
SDS(十二烷基磺酸钠)：20 g(相对分子质量288.3)
待上述药品全部溶解后,再用蒸馏水定容至1 000 mL。

若在室温低于20 ℃时配制药液,SDS呈沉淀析出,此时需要加温,才能将SDS溶解。

如果提前配制的研磨液出现了沉淀,则应加温使沉淀溶解后再使用。

四、DNA纯化及杂质去除
4. 1 酚类杂质的去除
对植物中次生产物酚类物质的去除,普遍是在提取液中加入适量的抗氧化剂和螯合剂,防止多酚氧化褐变。

在提取DNA 过程中加入巯基乙醇、半胱氨酸、二硫苏糖醇、谷胱甘肽及抗坏血酸等巯基试剂,抑制氧化反应,避免褐化。

在样品液氮研磨及提取缓冲液中加入高分子螯合剂PVP(聚乙烯吡咯烷酮) 或PVPP(聚乙烯聚吡咯烷酮) 等能络合多酚和萜类物质离心或氯仿抽提出去,有效的防止多酚物质氧化成醌类,避免溶液变褐而具有抗氧化作用。

因此在提取液中加入适量的PVP 或PVPP 能提高DNA 的纯度) ,其用量视杂质的多少而定
(1 %～6 %) ,PVP 同时能有效去除多糖。

因此将PVP 和巯基乙醇配合使用并调整用量,能够有效地防止多酚污染。

王玉成等认为以上的方法仅对褐化现象较轻者有效,却很难克服一些含酚类化合物丰富的植物,如柽柳、冷杉等树种的褐化。

在CTAB 缓冲液加入一定量的硼砂(提取缓冲液含0. 012 5 mol/ L 硼砂、2 % CTAB 、1. 4 mol/ L NaCl 、巯基乙醇0. 1 mol/ L ,pH值为9. 0) 提取柽柳、冷杉的RNA 取得了良好的效果,而且在提取紫丁香、糖槭、旱柳等植物组织的RNA 时也从未发生褐化[10] 。

4. 2 多糖类杂质的去除
多糖的污染是提取植物DNA 时常遇到的另一棘手的问题[11] 。

植物组织中往往富含多糖, 而多糖的许多理化性质与DNA 很相似,因此很难将它们分开。

经典的CsCl 梯度离心能有效的除去植物中多糖,但梯度离心设备昂贵,操作不便且DNA 得率很低。

近年国内外有一些去除多糖的相关报道,Dellaporta 等认为加入高浓度的KAc 有利于除去多糖[12] ;Fang 等认为在1. 0～2. 5 mol/ L NaCl 的高盐TE 中,用无水乙醇沉淀DNA 能除去多糖[13] ; Sue Porebski 等在沉淀粗提DNA 时,将NaCl 的浓度提高至2. 5 mol/ L 以除去多糖
[14] ;Candelario 等通过调节材料的取样时期、使用量, 在氯仿处理后加含2 %CTAB 的分离缓冲液, 及延长离心时间等方法来有效去除仙人掌植物的多糖[15] ;徐志祥等将DNA 沉淀重悬于30 %乙醇中4 ℃放置过夜,离心, 上清加乙醇至80 %重新沉淀DNA ,能去除多糖和其他杂质[16] ;陈大明等利用活细胞中由于细胞区室化多酚类以及其他杂质与DNA 相互隔离的特性,在裂解细胞前用不含CTAB 的提取缓冲液(0. 14 mol/ L 葡萄糖、3 %可溶性PVP、10 mmol/ Lβ2巯基乙醇) 去除细胞质中大多数生化成分,同时有效地防止多酚类物质被氧化,从而达到排除多酚类等杂质干扰的目的[17] ;程运江等先用水饱、乙醚和1. 2～1. 5 mol/ L Na2 Cl 溶液将大部分多糖去除, 再用2 倍乙醇沉淀DNA 可大大提高效率[18] 。

An Michiels 等用生长2～4 月的幼苗转移到暗室暗化处理4 周的黄化叶提取DNA 有效地防止多糖污染,同时发现在25 ℃异丙醇过夜沉淀DNA 能减少杂质污染且大大提高产率[19] 。

关于提取DNA 中蛋白质、糖类、多酚等各种杂质对分子生物学后续试验的影响,马小军等和文晓鹏等认为在一定范围内DNA 样品中蛋白质含量的高低, 可能不是影响PCR 扩增的重要因素, 去除RNA 后尚未纯化的DNA 作为模板进行RAPD 扩增也能得到和纯化后一致的条带。

但是, 用EcoRI 和HindIII 检测表明, 未纯化的DNA 不能用于酶切[20 - 21] 。

目前检测DNA 的纯度最常用的方法是测定DNA 在230、260、280 nm的吸收值, 通过计算OD 260/ OD 280 来评价DNA 的纯度, 通常认为OD 260/ OD 280 在1. 8～2. 0 表明DNA 的纯。