顺铂缓释剂对人胃癌裸鼠移植瘤生长以及 CD44V6＼PTEN表达的影响 (2)

顺铂缓释剂对人胃癌裸鼠移植瘤生长以及CD44V6＼PTEN表达的
影响
目的:观察顺铂植入剂对人胃癌裸鼠移植瘤模型中肿瘤细胞生长及CD44V6与PTEN蛋白在胃癌组织中表达的影响，并探讨其作用的相关机制。

方法建立裸鼠皮下移植瘤模型，随机分4组: PBS 尾静脉注射组( A 组)、顺铂尾静脉注射组( B 组)、顺铂瘤内注射组(C组)，顺铂植入剂植入组(D组)。

药物干预后，通过免疫组化法检测CD44V6、及PTEN 表达水平，并进行流式细胞凋亡检测。

结果顺铂植入剂能显著抑制移植瘤的生长，促进其凋亡并能较显著提高PTEN的表达【D组( 62.46±4.36) 与A组（6.44±2.84）比较，差异有统计学意义( P <0. 05)】，降低CD44V6 的表达【D组( 28.7±8.10) 与A组（80.48±8.18）比较，差异有统计学意义( P <0. 05)】。

结论顺铂植入剂可能通过下调CD44V6表达、上调PTEN 表达来发挥抗肿瘤的作用。

标签：顺铂植入剂；胃癌，裸鼠，cd44v6；PTEN
The Effect of the human gastric transplantable tumor from nude mice implanted cisplatin-implants on its growth and on the expression of CD44V6 and PTEN Cai Tingting1，Yan Liping2*，Li Ping2
(1Graduate School，Guilin Medical School，Guilin 541001; 2 Dept of Gastroenterology，The Second People’s Hospital of Guilin，Guilin 541001) Abstract:ObjectiveTo observe the PTEN /CD44V6gene proteins expression level in nude mouse with gastric carcinoma subcutaneous transplanted by sustained-release cisplatin implantation，and discuss the mechanism of sustained-release cisplatin. MethodsTo establish the gastric carcinoma subcutaneous transplanted model ，and divided into 4 groups randomly: the control group respectively the tail intravenous injection of PBS( A group) ，the tail intravenous injection of cisplatin group( B group) ，the intratumor injection of cisplatin group( C group) ，the implant of sustained-release cisplatin group( D group) . After the drugs intervening，the tumor tissues weredetected by IHC with the PTEN /CD44V6.Besides ,the cell suspensions were tested by FCM.ResultsCisplatin-implants can promote the apoptosis as well as suppress the tumor growth significantly and it also can enhance the expression of pten ( D group: 62.46±4.36vs A group:6.44±2.84，P＜0. 05) ，reducing the expression of cd44v6( D group:28.7±8.10vs A group:80.48±8.18，P＜0. 05). Conclusion Cisplatin-implants can develop the anticancer function in apoptosis by enhancing the expression of pten and reducing the expression of cd44v6.
Keywords:cisplatin-implants;gastric cancer;nude mice; cd44v6；PTEN
由于恶性度高，预后差，生存率不理想，胃癌——特别是进展期胃癌治疗方面的研究有着重要的意义。

顺铂有显著的促肿瘤细胞凋亡作用，但其引起的全身副作用极大地限制了顺铂的临床使用。

而新型缓释顺铂植入剂药效时间长，顺铂植入部位药物浓度高，作用强度大，而全身作用强度小，药物利用率高【1】，治疗恶性实体肿瘤时能极大改善肿瘤预后，这一优势在临床已有相关报道【2-3】。

但其基础研究较少，有关其治疗对胃癌的凋亡作用机制尚不十分清楚。

本研究旨在探讨其对人胃癌裸鼠皮下移植瘤的抑制作用，初步阐明其诱导凋亡,降低侵袭转移发生率的机制，并验证其在抗肿瘤方面的优势，为该缓释药物的临床应用提供实验依据。

1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物与细胞系20只SPF级BALB /c 裸鼠，雌雄各10只，均为5 周龄，重18 ～20g，由桂林医学院实验动物中心提供; SGC7901 细胞系由广西医科大学实验中心提供。

1.1.2 试剂及药品RPMI-1640培养基及胎牛血清( Hyclone 公司) ; 鼠抗人CD44V6单克隆抗体( 北京中杉金桥生物技术有限公司) ; 兔抗人PTEN多克隆抗體( 北京中杉金桥生物技术有限公司) ; 流式细胞凋亡Annexin / PI 双染试剂（购于eBioscience），检测仪器采用美国BD公司生产FACSAriaTMⅢ型流式细胞仪；顺铂（CDDP）注射液( 上海旭东海普药业有限公司，25 mg/ml) ;顺铂缓释制剂( 生产厂家：安徽丰原中人药业公司，剂型：植入剂；规格：20mg,批号：20120403 ) 。

1.2 方法
1.2.1 建立动物模型并干预培养SGC7901 细胞株，收集对数期细胞并制成1. 5×108/ml的细胞悬液，于裸鼠右前肢腋下注射0. 2 ml-0.3ml ( 约3. 0 ×107个/只) ，约15 d 肿瘤可长至直径约5 mm大小表明致瘤成功，一组5只，随机分为4组: A 组-PBS 尾静脉注射组、B 组-顺铂尾静脉注射组、C组-顺铂瘤内注射组，D组-顺铂植入剂植入组。

于20、25、30d 分别给予 A 组PBS( 1 mg / kg)、B 组CDDP( 1 mg/kg)、C 组CDDP ( 1 mg/kg) 处理，D 组仅在成瘤后20 d 植入顺铂缓释剂( 0.4 mg/kg) 。

35 d 后，取出瘤体并称重，用千分尺测出肿瘤的最长径( a) 和最短径( b) 并计算出瘤体体积[V( mm3) =0. 5a× b2]及抑瘤率{抑瘤率=［1 - 实验组平均瘤重( B、C、D 组为实验组) /A 组平均瘤重］×100%}。

同一瘤组织分两部分处理：一部分用福尔马林固定，经石蜡包埋后严格按照相应的步骤进行常规HE 染色及免疫组化检测CD44V6与PTEN的表达；另一部分制成细胞混悬液，严格按照凋亡试剂盒的操作步骤进行处理。

1.2.2 免疫组化法及其结果判定
1.2.2.1 SP 免疫组化法检测PTEN、CD44V6蛋白表达石蜡切片脱蜡水化后，
每隔3 min用pH 为7. 4的PBS冲洗1次（共三次）; 对组织抗原进行相应的修复;13% H2O2( 50μl/张)室温孵育10 min。

PBS冲洗3次，间隔3 min; 弃PBS液，每张切片滴加50μl對应的一抗，室温孵育60 min，PBS 冲洗3 次，间隔3 min; 弃PBS 液，滴1滴即用型MaxvisionTM快捷免疫组化试剂，室温孵育10 min，PBS 冲洗3 次，间隔3 min; 除去PBS，滴100μl DAB ，冲洗，苏木精复染，PBS 冲洗反蓝，脱水干燥，二甲苯透明，晾干封片待干燥后镜检计数。

1.2.2.2 免疫组化结果判定PTEN 蛋白染色以细胞浆出现棕黄色颗粒为阳性，CD44V6 蛋白染色以细胞膜出现棕黄色颗粒为阳性。

400×镜下从每张组织切片染色的最强区域中选10个视野，使用目镜网格微尺计数 1 000 个细胞计算阳性细胞率。

（阳性细胞率= 阳性细胞数/肿瘤细胞数×100%）
1.2.3流式细胞术检测细胞凋亡
取出四组新鲜的肿瘤组织进行适度研磨，用PBS冲洗经筛网过滤后制成细胞混悬液，离心（2000r/min,5min），弃上清，用200μLPBS混悬，离心（2000r/min,5min），弃上清后用100μL1x buffer 混悬至1x106分别装于四个1.5 mL的EP管内，加5μL Annexin V，室温避光放置30min ，经1x的buffer洗涤后用200μL 1x的buffer制成细胞混悬液，加入5μL Propidium lodides, 2-8℃避光孵育10min，过滤上机。

1.3 统计学处理采用用SPSS 17. 0 统计软件进行分析，所有数据描述用x±s 表示，组间比较采用单因素方差分析( ANOV A) 及多个均数之间两两比较的q 检验。

绘制散点图进行相关性分析
2 结果
2.1 移植瘤体生长情况、瘤重及抑瘤率
20只裸鼠均在10 d 左右成瘤，成瘤率100%。

体积: A 组( 1564 ±180) mm3、B 组( 883± 46) mm3、C 组(584 ±91) mm3、D 组( 296 ±146) mm3。

D 组体积与
A、B、C 组比较，差异均有统计学意义( P <0. 05，F = 160.568) ，D 组瘤重与A、
B、C 组比较均降低，差异有统计学意义( P < 0. 05) ，D 组抑瘤率明显高于A 组，见表1。

表 1 各组CD44V6 及PTEN 的表达、瘤重及抑瘤率
( n =5，x ± s)
2.2 HE 染色结果A 组中可见腺管样结构，有少量细胞凋亡和片状坏死，肿瘤组织侵袭到脂肪和肌肉组织。

B 组肿瘤细胞有明显的异型性，未见明显腺管状结构，可见小片凋亡及坏死; 肿瘤局部侵袭到脂肪组织。

C 组肿瘤细胞有明显的异型性，未见明显腺管样结构，可见片状凋亡及坏死灶; 肿瘤组织侵袭不明显。

D 组细胞异型性不明显，未见腺管状结构，可见明显细胞凋亡和大量坏死; 未见
侵袭其它组织，长势慢。

见图1。

(1)(2)
(3)(4)
图1——各组HE染色结果
1:PBS尾静脉注射组200X2：顺铂尾静脉注射组400X 3：顺铂瘤内注射组400X4：顺铂缓释剂植入组400X
2.3 CD44V6和PTEN的免疫组化结果见图2、3。

（1）（2）
（3）（4）
图2——PTEN的表达情况
1:PBS尾静脉注射组200X2：顺铂尾静脉注射组400X 3：顺铂瘤内注射组400X4：顺铂缓释剂植入组400X
（1）（2）
（3）（4）
图3—— CD44V6的表达情况
1:PBS尾静脉注射组200X2：顺铂尾静脉注射组400X 3：顺铂瘤内注射组400X4：顺铂缓释剂植入组400X
2.4 CD44V6和PTEN 的相关性分析
A、B、C、D 组CD44V6 的表达呈逐渐下降的趋势，而PTEN的表达则与之相反，呈现升高趋势，(P =0. 000，F =57.167) 。

2.5 流式细胞术细胞凋亡结果分析
A、B、C、D 组肿瘤组织中细胞凋亡率呈逐渐升高趋势，见图4
(1) (2)
(3)(4)
图4细胞凋亡的流式细胞术散点图
1:PBS尾静脉注射组2：顺铂尾静脉注射组3：顺铂瘤内注射组4：顺铂缓释剂植入组
3 讨论
PTEN基因异常可存在于食管癌、肾癌、膀胱癌、卵巢癌、胃癌、前列腺癌、肝细胞癌、骨肉瘤等多种肿瘤中，是与肿瘤发生密切相关的一种抑癌基因。

研究发现，其通过拮抗酪氨酸激酶等磷酸化酶的活性来抑制肿瘤的发生发展【4-14】。

CD44v6参与异质性粘附，即肿瘤细胞与宿主细胞和宿主基质之间的粘附，能够促进肿瘤细胞侵袭与转移。

国内外多位专家研究发现PTEN这一抑癌基因与转移相关基因CD44v6在多种肿瘤细胞的分裂和增殖中发挥截然相反的作用【15-19】。

Zhu XH 等【20】发现PTEN有抑制细胞分裂和增殖的作用，其表达与癌细胞凋亡之间呈明显的负相关，提示PTEN作为一种抑癌基因，可能通过促进肿瘤细胞凋亡而抑制肿瘤生长，CD44v6 能介导淋巴细胞归巢并参与细胞间的粘附过程，从而促进恶性肿瘤的侵袭转移【21-24】。

在人类多种肿瘤中，尤其是在胃癌转移的淋巴结中，CD44v6基因蛋白都是高表达【25】。

CD44v6常发生于晚期胃癌，作用机制为抑制凋亡，促进增殖，增加肿瘤细胞的侵袭能力，促进肿瘤血管新生和淋巴管新生，若通过药物干预抑制CD44v6基因蛋白的表达则会诱导肿瘤细胞凋亡。

本研究发现顺铂植入剂可通过明显抑制CD44v6的表达、上调PTEN的表达来发挥抗肿瘤的作用。

笔者认为顺铂植入剂可能是通过有效抑制CD44v6、上调PTEN途径抑制肿瘤细胞增殖，促进肿瘤细胞凋亡而实现其治疗肿瘤的作用。

流式细胞术（Flow CytoMetry，FCM）通过检测标记的荧光信号，对悬液中的单细胞或其他生物粒子实现高速、逐一的细胞定量分析和分选，是精确高效的分析和分选技术。

肿瘤是FCM被最早应用的一个领域，尤其近几年，FCM多被用于肿瘤细胞凋亡的研究中，准确地反映了经药物干预后肿瘤细胞凋亡情况。

研究发现在促肿瘤细胞凋亡方面顺铂植入剂的效果比常规顺铂制剂更好，这可能因为缓释给药系统能够达到较高的药物浓度，且作用持久【3】，将其用于胃癌术后的植入，对促肿瘤凋亡、抑制转移和改善预后有相当大的作用。

特别是对晚期或不适合做手术的患者，植入剂是个较为理想的选择。

综上所述，通过采用不同的干预方式对裸鼠荷瘤进行处理后的免疫组化和流式检测细胞凋亡结果显示顺铂植入剂的作用机制可能与抑制CD44v6的表达、上调PTEN的表达所诱导的细胞凋亡有关，植入顺铂植入剂治疗胃癌能有效促进细胞凋亡，改善预后，为肿瘤的临床治疗提供了新思路。

但由于本实验是动物实验，且观察时间较短，应用于临床需要有效可行的方法，而是否能提高患者的长期生存率尚不明确，有待进一步研究。

参考文献：
[1]侯小明,范晓涌,张萍,赵达,张煦.胃癌组织中HER-2/neu、PTEN及CD44V6的表达与预后[J].军医进修学院学报,2009,04:547-548+551.
[2]刘培杰, 徐志巧, 李宁, 帖晓静, 高岭, 张燕, 任宏政. 缓释顺铂瘤体植入联合放疗治疗原发性肝癌的研究[J]. 医药论壇杂志,2013,06:41-42
[3]王世亮,陈殿良,丁满志,储成顶,叶红杨,周丽春,吴静,王军. 顺铂植入剂兔舌内植入药动学研究[J]. 安徽医药,2007,06:487-489
[4]窦鹏挥,邢雨彤,周钢,朱晓峰,邹志田.PTEN,HIF-1α和VEGF在食管鳞癌组织中的表达及其意义[J].中国老年学杂志,2014,02:293-295.
[5]李菲.PTEN与AKT/mTOR通路在食管癌进展中的研究[D].河北医科大学,2013.
[6]刘尚文,黄庆波,艾青,朱鸣阳,张旭.肾透明细胞癌细胞系中NOTCH1调控PTEN/PI3K/AKT信号通路促进肿瘤进展[J].临床泌尿外科杂志,2013,03:226-230.
[7]李永飞,唐敏,王尚乾,宋国新,张炜.PTEN和P53在非肌层浸润性膀胱肿瘤中的表达及临床意义[J].南京医科大学学报(自然科学版),2013,05:636-640.
[8]吴军华,杨振华,朱莉萍.S期激酶相关蛋白2与p27和第10号染色体同源缺失性磷酸酶-张力蛋白基因在卵巢上皮性肿瘤中的表达与其发生发展的关系[J].中国慢性病预防与控制,2013,06:682-686.
[9]王茂林.PTEN基因在胃癌组织中的表达及临床意义[D].内蒙古大学,2013.
[10]周巍.AKT1/NF-kappaB/Notch-1/PTEN信号轴在胃癌细胞化疗耐药性中的作用及机制研究[D].武汉大学,2013.
[11]景宝.PTEN敲除小鼠前列腺癌模型的蛋白组学分析靶基因Chop的确定及诱导性表达c-myc细胞系的建立[D].天津医科大学,2013.
[12]王文明.Survivin、PTEN、VEGF在肝细胞癌组织中的表达及意义[D].南华大学,2013.
[13]罗一.PTEN甲基化在骨肉瘤发生中的作用及5-Aza-CdR去甲基化对其MG-63细胞生物学行为的影响[D].中南大学,2013.
[14]赵红霞.PTEN与肿瘤的相关性研究进展[J].武汉大学学报(医学版),2014,01:155-159.
[15]张思森,张谢夫,张云汉.食管鳞状细胞癌组织中PTEN、E-cadherin和CD44v6蛋白的表达[J].郑州大学学报(医学版),2011,06:817-820.
[16]连黎红.PTEN及CD_(44)V6在视网膜母细胞瘤中的表达及意义[J].中国现代医学杂志,2006,20:3055-3057.
[17]谷化平,尚培中.CD44v6和PTEN表达与结直肠癌浸润和转移关系[J].青岛大学医学院学报,2008,01:3-5.
[18]侯小明,范晓涌,张萍,赵达,张煦.胃癌组织中HER-2/neu、PTEN及CD44V6的表达与预后[J].军医进修学院学报,2009,04:547-548+551.
[19]王武.KAI1、PTEN及CD44V6在胃癌中的表达及相互关系的研究[D].福建医科大学,2007.
[20]Zhu XH,Qin X,Fei MG,et bined phosphatase and tension homolog(PTEN) loss and fatty acid ayn-thase(FAS) over expression worsens the prognosis of Chinese patients with hepatocellular carcinoma[J].Int JMo1 Sci,2012,13:9980-9991
[21]Berns K,Horlings HM,Hennessy BT,et al.A functional genetic approach identifies the PI3K pathway as a major determinant of trastuzumab resistance in breast cancer [J].Cancer cell,2007,12:395-402
[22]赵红霞.PTEN与肿瘤的相关性研究进展[J].武汉大学学报(医学版),2014,01:155-159.
[23] Okayama H，Kumamoto K，Saitou K，et al.CD44v6，MMP-7 and nu-clear Cdx2 are significant biomarkers for prediction of lymph nodemetastasis in primary gastric cancer[J].Oncol Rep，2009，22（4）：745-755.
[24] Winder T，Ning Y，Yang D，et al .Germline polymorphisms in genesinvolved in the CD44 signaling pathway are associated with clinicaloutcome in localized gastric adenocarcinoma[J].Int J Cancer，2011，129（5）：1096-1104.
[25]张涛.胃癌组织中CD44v6和RHAMM的表达及临床意义[J].重庆医科大学学报,2012,03:216-218.。