丹酚酸B对人鼻咽癌细胞株CNE-2增殖、凋亡的影响及机制研究
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Effects of salvianolic acid B on proliferation and apoptosis of human nasopharyngeal carcinoma cell line CNC-2 and its mechanism JIANG Xuefan', ZHANG Dayong2, HU Weiming1, PU L i1, SU Lizhong1 'Department o f Otolaryngology, Center o f Otolaryngology Head and Neck Sugery, A ffiliated People's Hospital o f Hangzhou Medical College, Zhejiang Provincial People's Hospital, Hangzhou, Zhejiang, 310014, China; departm ent o f Clinical Medicine, School o f Medicine, Zhejiang University City College, Hangzhou, Zhejiang, 310015, China Corresponding author: ZHANG Dayong(Email: zhangdy@ )
[ABSTRACT] OBJECTIVE To observe the effects and relative mechanisms of salvianolic acid B on the proliferation and apoptosis on human nasopharyngeal carcinoma CNE-2 cells. METHODS The median inhibitory concentration(ICso) of salvianolic acid B on human nasopharyngeal carcinoma CNE-2 cells was detected by Tetramethylazolium salt(MTT). Human nasopharyngeal carcinoma CNE-2 cells were treated with Salvianolic acid B at the concentration of ICso, and the proliferation of the cells in each group was detected by MTT. The apoptosis of the cells was observed by Hoechst33258 fluorescence staining under fluorescence microscope. The apoptosis rate was analyzed by flow cytometry(FCM). The expression levels of apoptosis related proteins Bax, Bcl-2, Caspase-3 and Caspase-9 were detected by Western blot. RESULTS Different concentrations of salvianolic acid B inhibited the human nasopharyngeal carcinoma CNE-2 cells, and in a concentration dependent manner, compared with the control group, the difference was statistically significant (P<0.05 or P<0.01)，I C 50 at (56.26 ± 2.13)pg/ml, 48 hours is the most significant. Typical morphological changes of apoptotic nuclei were found by Hoechst33258 fluorescence staining. Flow cytometry showed that the apoptosis rate of the experimental group was higher than that of the control group(尸<0.01). Compared with the control group, the protein expression of Bax, Caspase-3 and Caspase-9 in the experimental group increased significantly, while the protein expression of Bcl-2 decreased significantlyCP<0.01). C O N C L U SIO N Salvianolic acid B can obviously inhibit the proliferation and induce the apoptosis of human nasopharyngeal carcinoma CNE-2 cells, and its mechanism may be related to the inhibition of cell cycle transformation and the change of expression of apoptosis related proteins. IK ey w ord s] N asopharyngeal N eoplasm s; Cell Proliferation; Apoptosis; salvianolic acid B
资料与方法
1 . 1 实 验 对 象 复 苏 液 氮 保 存 的 人 岛 咽 癌 C N E -2细胞 (购于上海生科院细胞所），离 心 （1000 r/min, 8 min)。 用 含 1 5 % F B S 、584 mg/L 谷 氨 酰 胺 、1x 丨05丨U/L青霉素和 100 mg/L链 霉 素 的 DMEM培 养 液 （美 国 Hyclone公司) 混 悬 沉 淀 细 胞 ：以5 x 105个/ml的 细 胞 密 度 均 匀 接 种 到 25 cm2的培 养 瓶 中 ，于3 7 1 和5 % CO:培 养 箱 中 培 养 ，每 3 天换液丨次，待 细 胞 密 度 生 K 至8 0 % 时 进 行 传 代 ，取对 数生长期的细胞进行实验 1 . 2 实验方法 1.2.1 丹 酚 酸 B 配 制 丹 酚 酸 B 溶 于 磷 酸 盐 缓 冲 液 (P B S )中，母液浓度为40 mg/ml, 过滤灭菌保存于-20T 冰箱备用 1 . 2 . 2 实 验 分 组 实 验 分 为 5组 ：对 照 组 、20 ng/m l、 40 jig/m l.80 ng/ml、160 ng/ml丹 酸 酸 B组 处 理 方 法 : 取 对 数 生 K 期的人鼻咽癌细胞株CN E-2, 吸去原培养液 后 ，经 PBS液 清 洗 2〜3 次 ，并 进 行 不 同 的 给 药 处 理 对 照 组 不 经 给 药 处 理 ，其 他 组 分 別 加 入 20 ng/ml、40 ng/ml、 80 ng/m丨、160 ng/ml的 丹 鼢 酸 B , 培 养 48 h后进行 相 关 检测： 1.2.3 M T T 法 检 测 细 胞 增 殖 情 况 取 对 数 生 长 期 的 C N E -2细 胞 株 ，调 整 细 胞 浓 度 为 2.5x l 04/ml, 加 入 96孔 板中，180 nl/孔 ，培养过夜，分别加人不丨ri]浓度的丹酚酸B 2 0 …，P B S作 为 阴 性 对 照 ，稍 加 振 荡 ，每 组 6 个 复 孔 ，设 一 孔 不 加 细 胞 的 空 白 对 照 在 培 养 箱 屮 分 别 培 养 48 h后
2 6 6 中国耳鼻咽喉头颈外科/2021年5 月，第2 8 卷，第5期
目 前 鼻 咽 癌 （ nasopharyngeal carcinoma, N P C )的 治 疗 以 放 疗 联 合 辅 助 化 疗 为 主 [11，针 对 V 期 局 部 病 灶 治 疗效果较好％ 但在NPC的放疗屮经常会遇到放疗后肿 瘤 复 发 、放 射 抗 拒 等 M 题 . ifllX或 7 射 线 等 在 杀 死 癌 细 胞 的 N 时 也 对 肿 瘤 组 织 附 近 的 正 常 细 胞 造 成 杀 伤 ，放 射 剂 量 大 ，副 作 用 也 大 临 床 上 常 用 的 化 疗 药 如 环 磷 酰 胺 、氟 K 嘧 啶 及 顺 铂 等 对 鼻 咽 癌 有 一 定 疗 效 ，但毐副作 用 大 ，还 存 在 远 期 效 果 不 明 显 和 耐 药 性 等 问 题 ^ W 此 ，迫切需要研究和开发高效低毒的新药
基金项目：浙江省中医药科学研究基金项目（2 0 1 6 Z A 0 2 4 ) ，浙江省医药卫生研究基金项目（2 0 1 6 K Y B 0 2 4 ) 第一作者简介及通讯：蒋 学 范 ，男，河南人，医学硕士，副主任医师，主要研究方向为鼻咽癌的基础和临床研究 E m a i l ：jiangxuefanl@ 通讯作昔：张 大 勇 （Email: zhangdy@_)
D O I : 10.16066/j. 1672-7002.2021.05.001
CHIN ARCH OTOLARYNGOL HEAD NECK SURG / May 2021, Vol.28, No.5 2 6 5 鼻 咽 癌 基 础 研 究 专 题 ：论 著
丹酚酸巳对人鼻咽癌细胞株CNE-2增 殖 、凋亡的影响及机制研究
蒋学范\ 张大勇2，胡未鸣、浦立\ 苏立众^ 1浙江省人民医院，杭州医学院附属人民医院耳鼻咽喉科，耳鼻咽喉头颈外科中心，浙 江 杭 州 310014; 2浙江大学城市学院医 学院临床医学系，浙 江 杭 州 310015
[摘要] 目 的 研 究 丹 酚 酸 B对人鼻咽癌CNE-2细胞增殖、 凋亡的影响，并 探 讨其可能的分子机制：方 法 采 用 四 甲 基 偶 氮 唑 盐 （M T T )法 检 测 丹 酚 酸 B对人鼻咽癌CNE-2 细 胞 的 半 数 抑 制 浓 度 （IC 5。）；用 IC 5。浓 度 的 丹 酚 酸 B 处理人鼻咽癌CNE-2细 胞 后 ，采用MTT法检测各组细胞 的增殖情况；在 荧 光 显 微 镜 下 应 用 H〇eChst33258荧光染 色 法 观 察 细 胞 的 凋 亡 情 况 ；应用流式细胞仪分析细胞凋 亡率情况； Western blot法检测细胞调亡相关蛋白Bax、 Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9的表达水平。结 果 不 同 浓 度 的 丹 酚 酸 B对 人 鼻 咽 癌 C N E -2 细 胞 均 有 抑 制 作 用 ，并呈 浓度依赖性，与对照组相比差异 具 有 统 计 学 意 义 （/^ o .o s 或/><0.01)，IC5〇* ( 56.2 6 ± 2_l3 ) n g /m l， 48 h 最 显 著 ; H oechst33258荧 光 染 色 发 现 典 型 的 凋 亡 细 胞 核 形 态 学 变 化 ；流 式 细 胞 仪 检 测 显 示 实 验 组 细 胞 的 凋 亡 率 高 于 对 照 组 （PcO .O l); 与对照组相比，实验组Bax、Caspase-3、 Caspase-9的蛋白表达显著增加，而Bcl-2的蛋白表达显著减 少 （户<0.01>。结 论 丹 酚 酸 B能明显抑制人鼻咽癌CNE-2 细胞增殖，促 其 凋 亡 ，其机制可能与其阻滞细胞周期的转 化并使凋亡相关蛋白表达的改变有关。 [关键词] 鼻咽肿瘤；细胞增殖；细胞凋亡；丹酚酸B
丹酚酸B是丹参提取物屮水溶性活性最强的成分， R 有 广 谱 的 生 物 学 和 药 理 学 活 性 |6' 近 来 有 研 究 发 现 其 亦 有 抗 肿 瘤 活 性 +111，可以在多个J3 面丨•.抑制多种肿 瘤 的 发 生 、发 展 fHFT前闰内外未见丹酚酸B 对人鼻咽癌 细 胞 作 用 的 报 道 。为 此 ，本 实 验 旨 在 研 究 丹 酚 酸 B 对人 鼻 咽癌CN E-2细 胞 增 殖 和 凋 亡 的 影 响 ，并 探 • 其 机 制 ， 初 步 探 索 丹 酚 酸 B 治 疗 鼻 咽 癌 的 可 能 性 和 价 值 ，同时也 为 合 理 ) f•发利用中药捉高理论和实验数据
[ABSTRACT] OBJECTIVE To observe the effects and relative mechanisms of salvianolic acid B on the proliferation and apoptosis on human nasopharyngeal carcinoma CNE-2 cells. METHODS The median inhibitory concentration(ICso) of salvianolic acid B on human nasopharyngeal carcinoma CNE-2 cells was detected by Tetramethylazolium salt(MTT). Human nasopharyngeal carcinoma CNE-2 cells were treated with Salvianolic acid B at the concentration of ICso, and the proliferation of the cells in each group was detected by MTT. The apoptosis of the cells was observed by Hoechst33258 fluorescence staining under fluorescence microscope. The apoptosis rate was analyzed by flow cytometry(FCM). The expression levels of apoptosis related proteins Bax, Bcl-2, Caspase-3 and Caspase-9 were detected by Western blot. RESULTS Different concentrations of salvianolic acid B inhibited the human nasopharyngeal carcinoma CNE-2 cells, and in a concentration dependent manner, compared with the control group, the difference was statistically significant (P<0.05 or P<0.01)，I C 50 at (56.26 ± 2.13)pg/ml, 48 hours is the most significant. Typical morphological changes of apoptotic nuclei were found by Hoechst33258 fluorescence staining. Flow cytometry showed that the apoptosis rate of the experimental group was higher than that of the control group(尸<0.01). Compared with the control group, the protein expression of Bax, Caspase-3 and Caspase-9 in the experimental group increased significantly, while the protein expression of Bcl-2 decreased significantlyCP<0.01). C O N C L U SIO N Salvianolic acid B can obviously inhibit the proliferation and induce the apoptosis of human nasopharyngeal carcinoma CNE-2 cells, and its mechanism may be related to the inhibition of cell cycle transformation and the change of expression of apoptosis related proteins. IK ey w ord s] N asopharyngeal N eoplasm s; Cell Proliferation; Apoptosis; salvianolic acid B
资料与方法
1 . 1 实 验 对 象 复 苏 液 氮 保 存 的 人 岛 咽 癌 C N E -2细胞 (购于上海生科院细胞所），离 心 （1000 r/min, 8 min)。 用 含 1 5 % F B S 、584 mg/L 谷 氨 酰 胺 、1x 丨05丨U/L青霉素和 100 mg/L链 霉 素 的 DMEM培 养 液 （美 国 Hyclone公司) 混 悬 沉 淀 细 胞 ：以5 x 105个/ml的 细 胞 密 度 均 匀 接 种 到 25 cm2的培 养 瓶 中 ，于3 7 1 和5 % CO:培 养 箱 中 培 养 ，每 3 天换液丨次，待 细 胞 密 度 生 K 至8 0 % 时 进 行 传 代 ，取对 数生长期的细胞进行实验 1 . 2 实验方法 1.2.1 丹 酚 酸 B 配 制 丹 酚 酸 B 溶 于 磷 酸 盐 缓 冲 液 (P B S )中，母液浓度为40 mg/ml, 过滤灭菌保存于-20T 冰箱备用 1 . 2 . 2 实 验 分 组 实 验 分 为 5组 ：对 照 组 、20 ng/m l、 40 jig/m l.80 ng/ml、160 ng/ml丹 酸 酸 B组 处 理 方 法 : 取 对 数 生 K 期的人鼻咽癌细胞株CN E-2, 吸去原培养液 后 ，经 PBS液 清 洗 2〜3 次 ，并 进 行 不 同 的 给 药 处 理 对 照 组 不 经 给 药 处 理 ，其 他 组 分 別 加 入 20 ng/ml、40 ng/ml、 80 ng/m丨、160 ng/ml的 丹 鼢 酸 B , 培 养 48 h后进行 相 关 检测： 1.2.3 M T T 法 检 测 细 胞 增 殖 情 况 取 对 数 生 长 期 的 C N E -2细 胞 株 ，调 整 细 胞 浓 度 为 2.5x l 04/ml, 加 入 96孔 板中，180 nl/孔 ，培养过夜，分别加人不丨ri]浓度的丹酚酸B 2 0 …，P B S作 为 阴 性 对 照 ，稍 加 振 荡 ，每 组 6 个 复 孔 ，设 一 孔 不 加 细 胞 的 空 白 对 照 在 培 养 箱 屮 分 别 培 养 48 h后
2 6 6 中国耳鼻咽喉头颈外科/2021年5 月，第2 8 卷，第5期
目 前 鼻 咽 癌 （ nasopharyngeal carcinoma, N P C )的 治 疗 以 放 疗 联 合 辅 助 化 疗 为 主 [11，针 对 V 期 局 部 病 灶 治 疗效果较好％ 但在NPC的放疗屮经常会遇到放疗后肿 瘤 复 发 、放 射 抗 拒 等 M 题 . ifllX或 7 射 线 等 在 杀 死 癌 细 胞 的 N 时 也 对 肿 瘤 组 织 附 近 的 正 常 细 胞 造 成 杀 伤 ，放 射 剂 量 大 ，副 作 用 也 大 临 床 上 常 用 的 化 疗 药 如 环 磷 酰 胺 、氟 K 嘧 啶 及 顺 铂 等 对 鼻 咽 癌 有 一 定 疗 效 ，但毐副作 用 大 ，还 存 在 远 期 效 果 不 明 显 和 耐 药 性 等 问 题 ^ W 此 ，迫切需要研究和开发高效低毒的新药
基金项目：浙江省中医药科学研究基金项目（2 0 1 6 Z A 0 2 4 ) ，浙江省医药卫生研究基金项目（2 0 1 6 K Y B 0 2 4 ) 第一作者简介及通讯：蒋 学 范 ，男，河南人，医学硕士，副主任医师，主要研究方向为鼻咽癌的基础和临床研究 E m a i l ：jiangxuefanl@ 通讯作昔：张 大 勇 （Email: zhangdy@_)
D O I : 10.16066/j. 1672-7002.2021.05.001
CHIN ARCH OTOLARYNGOL HEAD NECK SURG / May 2021, Vol.28, No.5 2 6 5 鼻 咽 癌 基 础 研 究 专 题 ：论 著
丹酚酸巳对人鼻咽癌细胞株CNE-2增 殖 、凋亡的影响及机制研究
蒋学范\ 张大勇2，胡未鸣、浦立\ 苏立众^ 1浙江省人民医院，杭州医学院附属人民医院耳鼻咽喉科，耳鼻咽喉头颈外科中心，浙 江 杭 州 310014; 2浙江大学城市学院医 学院临床医学系，浙 江 杭 州 310015
[摘要] 目 的 研 究 丹 酚 酸 B对人鼻咽癌CNE-2细胞增殖、 凋亡的影响，并 探 讨其可能的分子机制：方 法 采 用 四 甲 基 偶 氮 唑 盐 （M T T )法 检 测 丹 酚 酸 B对人鼻咽癌CNE-2 细 胞 的 半 数 抑 制 浓 度 （IC 5。）；用 IC 5。浓 度 的 丹 酚 酸 B 处理人鼻咽癌CNE-2细 胞 后 ，采用MTT法检测各组细胞 的增殖情况；在 荧 光 显 微 镜 下 应 用 H〇eChst33258荧光染 色 法 观 察 细 胞 的 凋 亡 情 况 ；应用流式细胞仪分析细胞凋 亡率情况； Western blot法检测细胞调亡相关蛋白Bax、 Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9的表达水平。结 果 不 同 浓 度 的 丹 酚 酸 B对 人 鼻 咽 癌 C N E -2 细 胞 均 有 抑 制 作 用 ，并呈 浓度依赖性，与对照组相比差异 具 有 统 计 学 意 义 （/^ o .o s 或/><0.01)，IC5〇* ( 56.2 6 ± 2_l3 ) n g /m l， 48 h 最 显 著 ; H oechst33258荧 光 染 色 发 现 典 型 的 凋 亡 细 胞 核 形 态 学 变 化 ；流 式 细 胞 仪 检 测 显 示 实 验 组 细 胞 的 凋 亡 率 高 于 对 照 组 （PcO .O l); 与对照组相比，实验组Bax、Caspase-3、 Caspase-9的蛋白表达显著增加，而Bcl-2的蛋白表达显著减 少 （户<0.01>。结 论 丹 酚 酸 B能明显抑制人鼻咽癌CNE-2 细胞增殖，促 其 凋 亡 ，其机制可能与其阻滞细胞周期的转 化并使凋亡相关蛋白表达的改变有关。 [关键词] 鼻咽肿瘤；细胞增殖；细胞凋亡；丹酚酸B
丹酚酸B是丹参提取物屮水溶性活性最强的成分， R 有 广 谱 的 生 物 学 和 药 理 学 活 性 |6' 近 来 有 研 究 发 现 其 亦 有 抗 肿 瘤 活 性 +111，可以在多个J3 面丨•.抑制多种肿 瘤 的 发 生 、发 展 fHFT前闰内外未见丹酚酸B 对人鼻咽癌 细 胞 作 用 的 报 道 。为 此 ，本 实 验 旨 在 研 究 丹 酚 酸 B 对人 鼻 咽癌CN E-2细 胞 增 殖 和 凋 亡 的 影 响 ，并 探 • 其 机 制 ， 初 步 探 索 丹 酚 酸 B 治 疗 鼻 咽 癌 的 可 能 性 和 价 值 ，同时也 为 合 理 ) f•发利用中药捉高理论和实验数据