基于Keap1

doi：10.3969/j.issn.1000-484X.2023.07.004
基于Keap1/Nrf2/NLRP3炎症小体和p62途径探讨右美托咪定改善脑卒中后损伤的内在机制①
高毅冷玉芳②张保朝司小萌温昌明孙丽孙军张萌李刚司海超张新科刘展王飒（郑州大学附属南阳市中心医院，南阳 437000）
中图分类号R966 文献标志码 A 文章编号1000-484X（2023）07-1362-05
［摘要］目的：探讨右美托咪定（Dex）对脑卒中后模型脑损伤的改善作用，并基于Keap1/Nrf2/NLRP3炎症小体和p62途径探讨其作用机制。

方法：大鼠随机分为假手术组、模型组、依达拉奉组、Dex组，除假手术组外，各组采用线栓法制造缺血性脑卒中大鼠模型，假手术组只穿线不结扎。

造模成功后，依达拉奉组大鼠给予依达拉奉3.2 mg/kg，Dex组大鼠灌胃给予Dex 50 mg/kg，模型组、假手术组大鼠给予等体积生理盐水，连续给药14 d。

采用改良m-NSS法评价大鼠行为学变化；TTC染色测定脑梗死体积；ELISA检测脑组织中TNF-α、IL-1β、IL-6水平；免疫荧光染色检测脑组织内ROS含量；RT-PCR检测脑组织Keap1、Nrf2、NLRP3、p62 mRNA水平；Western blot检测Keap1、Nrf2、NLRP3、p62蛋白表达。

结果：与假手术组相比，模型组大鼠脑神经功能评分明显升高，脑梗死体积明显增大（P<0.01），脑组织中TNF-α、IL-6、IL-1β及ROS水平明显升高（P<0.01），Keap1、Nrf2、NLRP3、p62 mRNA及蛋白表达明显升高（P<0.01）；与模型组相比，Dex组大鼠脑神经功能评分明显降低，脑梗死体积明显减小（P<0.01），脑组织中TNF-α、IL-6、IL-1β及ROS水平明显降低（P<0.01），NLRP3、p62 mRNA及蛋白表达明显降低（P<0.01），Keap1、Nrf2 mRNA及蛋白表达明显升高（P<0.01）。

结论：Dex可明显改善脑卒中大鼠脑损伤，其可能是通过调控Keap1、Nrf2、NLRP3炎症小体及p62相关基因及蛋白表达实现的。

［关键词］右美托咪定；脑卒中后损伤；Keap1/Nrf2/NLRP3；p62
Mechanism of dexmedetomidine in improving post-stroke injury based on Keap1/Nrf2/NLRP3 inflammasome and p62 pathways
GAO Yi， LENG Yufang， ZHANG Baochao， SI Xiaomeng， WEN Changming， SUN Li， SUN Jun， ZHANG Meng，LI Gang，SI Haichao，ZHANG Xinke，LIU Zhan，WANG Sa. Nanyang Central Hospital Affiliated to Zhengzhou University， Nanyang 437000， China
［Abstract］Objective：To investigate the improvement effect of dexmedetomide （Dex） on brain injury in post-stroke injury，and to explore its mechanism based on Keap1/Nrf2/NLRP3 inflammasome and p62 pathways. Methods：Rats were randomly divided into sham group， model group， edaravone group and Dex group， except for sham group， ischemic stroke model was made by thread bolt method in each group. In sham group， only thread was inserted without ligationby. After successful modeling， rats in edaravone group were given edaravone 3.2 mg/kg， rats in Dex group were given 50 mg/kg Dex by gavage， rats in model group and sham group were given equal volume normal saline， continuously for 14 days. Modified m-NSS method was used to evaluate behavioral changes of rats； TTC staining was used to determine volume of cerebral infarction； levels of TNF-α，IL-6，IL-1β in brain tissue were detected by ELISA； ROS content in brain tissue was detected by immunofluorescence staining； mRNA levels of Keap1， Nrf2， NLRP3 and p62 in brain tissue were detected by RT-PCR；protein expressions of Keap1，Nrf2，NLRP3 and p62 were detected by Western blot. Results：Compared with sham group， cerebral nerve function score was significantly increased， cerebral infarction volume was significantly increased （P<0.01）， levels of TNF-α， IL-6， IL-1β and ROS in brain tissue were significantly increased （P<0.01）， mRNA and protein expressions of Keap1，Nrf2， NLRP3 and p62 were significantly increased in model group （P<0.01）. Compared with model group， cerebral nerve function score was significantly decreased， cerebral infarction volume was significantly decreased （P<0.01）， levels of TNF-α ，IL-6， IL-1β and ROS in brain tissue were significantly decreased， mRNA and protein expressions of NLRP3 and p62 were significantly decreased （P<0.01）， mRNA and protein expressions of Keap1 and Nrf2 were significantly increased in Dex group （P<0.01）. Conclusion：Dex
①本文为河南省重点研发与推广专项计划项目（192102310349）；南阳市科技攻关计划项目（KJGG2018082）。

②兰州大学第一附属医院，兰州 730099。

作者简介：高毅，男，硕士，主治医师，主要从事疼痛诊疗方面的研究，E-mail：359597944@。

can significantly improve brain injury of stroke rats，which may be achieved by regulating expressions of Keap1，Nrf2，NLRP3 inflammasome and p62-related genes and proteins.
［Key words］Dexmedetomidine；Post-stroke injury；Keap1/Nrf2/NLRP3；p62
缺血性脑卒中是较为常见的一种脑血管疾病，致残率和病死率较高，给患者生活带来很大危害。

研究表明，炎症反应在脑卒中后损伤中发挥重要作用，其不仅能够破坏血脑屏障，形成脑水肿，还能够启动氧化应激反应，导致不可逆转的神经元死亡，加剧神经功能损伤［1-2］。

Kelch样ECH相关蛋白-1（Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1）/核因子
E2相关因子2（Nrf2）通路是细胞内维持氧化还原稳态、清除氧自由基的关键通路［3-4］。

大量研究显示，Keap1/Nrf2通路通过激活下游因子表达在急性缺血性脑损伤中发挥抗炎症反应、抗氧化应激损伤、抗凋亡作用［5-6］。

p62可调控氧化应激和自噬发生，有研究表明，在短暂局灶性脑缺血大鼠中，p62可通过调控Keap1/Nrf2/ARE信号通路抑制氧化损伤［7］。

右美托咪定（dexmedetomidine，Dex）是临床常用的一种镇静药物，对于脑、心脏、肾脏等多种器官的缺血再灌注损伤具有保护作用［8-10］。

本研究在前期预实验中也发现50 mg/kg Dex具有脑损伤改善作用，但其机制并未明确。

基于此，本研究拟探讨Dex对缺血性脑卒中后脑损伤的保护作用，及其对脑组织中氧化应激及炎症反应相关蛋白的影响，以期为治疗缺血性脑卒中提供新方向。

1 材料与方法
1.1　材料　
1.1.1　主要试剂　盐酸右美托咪定注射液购于江苏恒瑞；依达拉奉注射液购于西安利君制药有限责任公司；2，3，5-三苯基氯化三苯基四氮唑（TCC）购于美国Sigma公司；IL-6、IL-1β、TNF-α ELISA试剂盒购于南京凯基生物科技有限公司；Keap1、Nrf2、NLRP3、p62、β-actin抗体购于美国Proteintech公司；BCA蛋白定量试剂盒、蛋白提取试剂购于美国Thermo 公司。

1.1.2　主要仪器　电子分析天平（上海精密科学仪器公司）；超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；超低温冰箱（日本SANYO公司）；荧光倒置显微镜（日本Olympus公司）；离心机（上海安亭科学仪器厂）；图像分析仪（以色列Dinco公司）；化学发光仪（上海天能科技有限公司）。

1.1.3　实验动物　100只SPF级SD大鼠，体质量（250±30） g，购于湖南斯莱克动物实验公司，合格证号：SCXK（湘）2016-0002。

1.2　方法　
1.2.1　大脑中动脉闭塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型制备　80只大鼠以10%水合氯醛麻醉后仰卧位固定，颈部消毒，颈前正中做一2 cm切口，暴露分离颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉，结扎并游离颈外动脉主干，在颈外动脉距离颈总动脉分叉3~4 mm处做微切口，由切口向颈内动脉插入特制尼龙线（直径0.26 mm，长40 mm），直至有轻微阻力感时停止［（18.0±0.5） mm］，用1号手术线固定尼龙线，缺血2 h将尼龙线抽出进行再灌注，缝合切口。

假手术组（Sham）20只大鼠除不插线栓外，其余步骤同上。

1.2.2　分组及给药　将造模成功的60只大鼠随机分为模型组（Model）、右美托咪定（Dex）组、依达拉奉（Edaravone）阳性对照组，每组20只，未造模的20只大鼠设为假手术（Sham）组。

依达拉奉组腹腔注射依达拉奉3.2 mg/kg，Dex组灌胃给予Dex 50 mg/kg，模型组、假手术组给予相同体积的生理盐水，1次/d，连续给药14 d。

1.2.3　mNSS法评价大鼠行为学变化　在给药1 d、7 d、14 d时采用改良大鼠神经功能缺损评分（mNSS）表评价大鼠生理功能，正常为0 分，有神经功能缺损的根据其严重程度计1~6分，最高分为18分，神经功能损伤越严重分值越大。

1.2.4　TTC染色法测定脑梗死体积　将大鼠脑置于切片模具中，间隔 2 mm 冠状切片，置于5 ml含1%TTC的PBS中，37 ℃避光孵育30 min，期间每隔5 min将脑片翻动1次，TTC染色后，正常脑组织染为红色，梗死组织为白色，取出脑片置于10%甲醛溶液中固定，逐层拍照，采用Image pro Plus 图像分析软件处理并统计，计算各层梗死面积。

脑梗死体积=各层梗死面积×层面。

1.2.5　免疫荧光染色检测脑组织内活性氧（reac‐tive oxygen species，ROS）含量　取50 mg大脑组织，加入1 ml匀浆缓冲液充分匀浆，4 ℃、1 000 r/min离心10 min，取上清，在96孔板中加入190 μl匀浆上清液、10 μl DHE探针，移液器吹打，使之充分混匀，37 ℃避光孵育30 min，置于荧光酶标仪中，在发射波长610 nm、激发波长488~535 nm处检测荧光强度，组织ROS强度=荧光强度/每毫克蛋白，每个样本设3个复孔，取平均值。

1.2.6　ELISA检测脑组织匀浆中IL-6、IL-1β、TNF-α水平　矢状切取左侧脑组织，生理盐水清洗后，按照脑组织（g）∶生理盐水（ml）=1∶9的比例加入预冷生理盐水，采用玻璃匀浆器制成10%的脑匀浆，
4 ℃、3 000 r/min离心10 min，取上清液，按照ELISA 检测试剂盒说明书操作测定IL-6、IL-1β、TNF-α水平，每个样本设3个复孔，取平均值。

1.2.7　RT-PCR检测大鼠脑组织Keap1、Nrf2、NLRP3、p62 mRNA表达　低温取大鼠脑组织100 mg，提取组织总RNA，按照逆转录及PCR试剂盒说明书进行反转录及RT-PCR反应。

PCR反应条件为：94 ℃预变性5 min，96 ℃变性30 s，60 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，共40次扩增。

以β-actin为内参，琼脂凝胶对PCR产物进行电泳分析，Opticon Monitor 3软件分析PCR结果。

每个样本重复3个复孔，取平均值。

RT-PCR引物序列见表1。

1.2.8　Western blot检测大鼠脑组织Keap1、Nrf2、NLRP3、p62蛋白表达　低温下取大鼠脑组织100 mg，加入RIPA裂解液，在低温环境下进行研磨，充分裂解，4 ℃、12 000 r/min离心15 min，取上清液，采用BCA蛋白检测试剂盒测定裂解物中的蛋白质浓度。

取少量蛋白质配制上样缓冲液，电泳、转膜、封闭，加入Keap1、Nrf2、NLRP3、p62、β-actin一抗，4 ℃孵育过夜，TBST洗涤，加入二抗，室温孵育2 h，TBST 洗涤，ECL化学发光试剂显色后，化学发光仪成像。

每个样本设3个复孔，取平均值。

1.3　统计学分析　数据统计分析采用SPSS17.0软件包，计量资料采用xˉ±s表示，多组间差异比较采用单因素方差分析（One Way ANOVA），独立样本采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果
2.1　Dex对MCAO模型大鼠行为学的影响　与假手术组相比，模型组大鼠脑神经功能评分明显升高；与模型组相比，依达拉奉及Dex组大鼠脑神经功能评分均呈下降趋势，其中以给药7 d后下降明显（P<0.01），提示Dex可抑制MCAO引起的神经功能损伤。

见表2。

2.2　Dex对MCAO大鼠脑梗死体积的影响　与假手术组相比，模型组大鼠脑梗死体积明显增大（P<
0.01）；与模型组相比，依达拉奉组及Dex组大鼠脑梗死体积明显减小（P<0.01）。

见图1。

2.3　Dex对MCAO大鼠脑组织炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α水平影响　与假手术组相比，模型组大鼠脑组织中IL-6、IL-1β、TNF-α水平明显升高（P<0.01）。

与模型组相比，依达拉奉及Dex组大鼠脑组织IL-6、IL-1β、TNF-α水平明显降低（P<0.01）。

见图2。

2.4　Dex对MCAO大鼠脑组织ROS的影响　与假手术组相比，模型组大鼠脑组织中ROS水平明显升高（P<0.01）。

与模型组相比，依达拉奉及Dex组大鼠脑组织ROS水平明显降低（P<0.01）。

见图3。

2.5　Dex对MCAO大鼠脑组织Keap1、Nrf2、NLRP3、p62 mRNA表达的影响　与假手术组相比，模型组
表1　RT-PCR引物序列
Tab.1　RT-PCR primer sequence
Primers β-actin Keap1 Nrf2 NLRP3 p62
Sequences（5'-3'）
F：ATCTGGCACCACACTCTA
R：CTCGTGAGGATCTCATGA
F：TGGACTTTCGTAGCCTCCAT
R：GCATTCCACACTGTCCAGAA
F：ACCAGGAGAGGAAGAAUAAAGUU
R：AAUUUAUUCUUCCUCUCCUGCGU
F：TACACACCCGGTCGGAGAAG
R：ACCTCCATCCCGAACTACAAC
F：ACCCATCCACAGGTGAACTC
R：
GTGGGAGATGTGGGTACAGG
Note：Compared with Sham group，#.P<0.01；compared with Model
group， *.P<0.01.xˉ±s，n=20.
图1　Dex对MCAO大鼠脑梗死体积的影响
Fig.1　Effects of Dex on brain infarct volumes in MCAO
rats
表2　Dex对MCAO大鼠mNSS的影响（xˉ±s，n=20）
Tab.2　Effects of Dex on mNSS in MCAO rats（xˉ±s，
n=20）
Groups
Sham
Model
Dex
Edaravone
mNSS/score
1 d
0.00±0.00
11.16±0.821）
10.95±0.91
11.22±0.78
7 d
0.00±0.00
9.24±0.721）
6.79±0.412）
6.38±0.422）
14 d
0.00±0.00
6.72±0.531）
4.59±0.462）
4.28±0.392）
Note：Compared with Sham group，1）P<0.01；compared with Model
group， 2）P<0.01.
大鼠脑组织中Keap1、Nrf2 、NLRP3、p62 mRNA 表达明显升高；与模型组相比，依达拉奉及Dex 组大鼠脑组织中NLRP3、p62 mRNA 表达明显降低（P <0.01），Keap1、Nrf2 mRNA 表达明显升高（P <0.01）。

见 图4。

2.6　Dex 对MCAO 大鼠脑组织Keap1、Nrf2、 NLRP3、p62蛋白表达的影响　与假手术组相比，模
型组大鼠脑组织中Keap1、Nrf2、NLRP3、p62蛋白表达明显升高；与模型组相比，依达拉奉及Dex 组大鼠
脑组织中NLRP3、p62蛋白表达明显降低（P <0.01），Keap1、Nrf2蛋白表达明显升高（P <0.01）。

见图5。

3 讨论
缺血性脑卒中是我国常见的脑血管疾病，近年
来发病率呈升高趋势，具有较高的和致残率致死率。

脑缺血损伤的病理机制主要涉及氧自由基、炎症反应、细胞凋亡等［11］。

Keap1/Nrf2/p62途径和 NLRP3炎症小体是氧化应激和炎症反应的重要调节因子，可能参与脑缺血损伤的病理过程［12-14］。

机体发生氧化反应时，Keap1与Nrf2相互结合，与ARE
发生反应并诱导抗氧化蛋白因子、解毒酶表达，减少脑缺血再灌注的神经损伤，改善脑血流速度，进而保护神经系统［15-16］。

NLRP3炎症小体在正常脑组织内呈低表达，但在机体受到损伤刺激时，激活的NLRP3炎症小体可通过释放IL -1β等扩大炎症反
应。

有研究表明，抑制NLRP3炎症小体可减少神经元细胞凋亡，减轻脑卒中引起的脑损伤［16］。

p62不仅可以直接调控自噬和氧化应激发生，还可通过调控Keap1/Nrf2通路发挥抗氧化应激作用，在应激状态下，p62会发生磷酸化并结合Keap1，使Nrf2释放并进入细胞核内，激活下游氧化应激相关蛋白表达［17］。

有研究报道Dex 在脑缺血后可抑制脑缺血后的炎症反应、激活抗凋亡信号通路，发挥神经保护作用。

但具体作用机制尚不清楚［17］。

本实验从 Keap1/Nrf2/p62途径和NLRP3炎症小体角度出发，
探讨Dex 对脑卒中后损伤的影响。

在本研究中，模型组大鼠神经功能评分升高，脑组织梗死体积明显增加，脑组织中炎症因子IL -6、IL -1β、TNF -α及ROS 水平均明显升高，说明大鼠神经功能损伤严重，且存在炎症反应和氧化应激损伤。

经Dex 治疗后，
大鼠脑神经功能评分及脑组织
Note ：Compared with Sham group ，
#. P <0.01； compared with Model
group ， *. P <0.01. x ˉ±s ， n =20.
图2　Dex 对MCAO 大鼠脑组织IL -6、IL -1β、TNF -α水平的
影响
Fig.2　Effects of Dex on levels of IL -6， IL -1β and TNF -α
in brain tissue of MCAO rats
Note ：Compared with Sham group ，
#. P <0.01； compared with Model
group ， *. P <0.01.x ˉ±s ， n =20.
图3　Dex 对MCAO 大鼠脑组织ROS 的影响
Fig.3　Effects of Dex on ROS in brain tissue of MCAO
rats
Note ：Compared with Sham group ，
#. P <0.01； compared with Model
group ， *. P <0.01. x ˉ±s ， n =20.
图4　Dex 对MCAO 大鼠脑组织Keap1、Nrf2、NLRP3、p62
mRNA 表达的影响
Fig.4　Effects of Dex on Keap1，Nrf2，NLRP3，p62 mRNA
expressions in brain tissue of MCAO rats
Note ：Compared with Sham group ，
#. P <0.01； compared with Model
group ， *. P <0.01. x ˉ±s ， n =10.
图5　Dex 对MCAO 大鼠脑组织Keap1、Nrf2、NLRP3、p62
蛋白表达的影响
Fig.5　Effects of Dex on Keap1，Nrf2，NLRP3，p62 protein
expressions in brain tissue of MCAO rats
梗死体积均明显改善，大鼠脑组织炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α及ROS水平均明显降低，说明Dex能抑制脑缺血后炎症因子及ROS释放，改善脑缺血后的神经功能损伤。

检测脑组织中Keap1、Nrf2、NLRP3、p62分子生物学表达，发现模型组大鼠Keap1、Nrf2、NLRP3、p62 mRNA及蛋白表达水平均明显升高，经Dex治疗后，大鼠NLRP3、p62 mRNA 及蛋白表达水平均明显降低，Keap1、Nrf2 mRNA及蛋白表达水平均明显升高，说明在脑梗死刺激下，Dex可激活Keap1-Nrf2通路，抑制p62及NLRP3炎症小体表达，从而发挥抗氧化应激损伤、抗炎症反应作用，进而发挥神经功能保护作用。

综上所述，Dex可抑制缺血性脑卒中大鼠脑组织炎症因子及ROS释放，改善其神经功能损伤，其机制可能通过调节Keap1/Nrf2/NLRP3炎症小体和p62通路相关蛋白表达实现。

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［收稿 2021‐07‐22 修回 2022‐01‐05］
（编辑陈阳）。