PUF蛋白的研究进展

PUF蛋白的研究进展
张静;王文珍;蒲首丞;孙梅好
【摘要】RNA binding proteins has a very important role in cell metabolism,and the characteristics of PUF protein which is one of those proteins is to have the base recognition specificity.PUF protein exists in most eukaryotes and plays an important role in the process of gene regulation.Its special structure gives the unique function which is base recognition.This feature makes PUF protein to have many potential usages.To understand PUF protein,we summarized the research progress
of PUF protein,including the recognition specificity,structural and functional studies.%RNA结合蛋白在细胞代谢中有非常重要的作用,PUF蛋白作
为其中的特点之一在于其具有碱基识别特异性.在大多数真核生物中都存在PUF蛋白,并且在基因调控过程中起到了重要的作用.其独特的结构赋予了PUF蛋白特有的碱基识别功能,而这让PUF蛋白具有很多可以开发的潜在用途.为了解PUF蛋白的
研究进展,综合了近些年来对于PUF蛋白的相关研究,包括PUF蛋白的识别特异性、结构研究与功能研究等方面.
【期刊名称】《山西农业科学》
【年(卷),期】2018(046)005
【总页数】5页(P847-850,855)
【关键词】PUF蛋白;碱基特异性;研究进展
【作者】张静;王文珍;蒲首丞;孙梅好
【作者单位】浙江师范大学化学与生命科学学院,浙江金华321000;浙江师范大学化学与生命科学学院,浙江金华321000;浙江师范大学化学与生命科学学院,浙江金华321000;浙江师范大学化学与生命科学学院,浙江金华321000
【正文语种】中文
【中图分类】Q51
细胞能够精准地控制mRNA在恰当的时候在特定的位置产生定量的蛋白质，而RNA结合蛋白（RNA-binding proteins，RBPs）和小 RNA（miRNA）控制着这些进程。

它们结合特定的mRNAs，从而控制mRNA的稳定性、翻译过程和定位[1]。

一个RNA结合蛋白能够结合许多的RNA，从而建造一个庞大的RNA网络来调控特定的生物学功能。

蛋白质结合RNA有多种多样的方法，并且通常都难以预料是以怎样的方式结合。

目前，存在一些与RNA作用并对其产生影响的工具的使用，类似于短干扰RNA和小分子RNA的使用，但这些工具的使用会降低目标RNA的多样性和在细胞中的表达量[2]。

因此，能够被设计的工程性RNA结合蛋白是十分具有吸引力的，因为它们能与任何想要的效应结构域相结合，能够选择性结合一种特定的RNA目标，从而来研究或者控制某一方面的新陈代谢作用。

最早在果蝇D.melanogaster中和线虫C.elegans中分别发现的PUMILIO和FBF，并以此来命名的PUF蛋白就是这样一类蛋白质[3-4]。

PUF蛋白普遍存在于真核生物中，从酵母、果蝇到小鼠、人类都存在同源基因，并且在细胞分裂、分化及生殖发育方面有着非常重要的作用。

PUF家族蛋白通过结合于目的mRNA的3′UTR 的特定序列，并聚集其他促进mRNA降解或影响其翻译表达的蛋白质来调节其表达。

PUF蛋白家族大致能够分为4个分支，其中2个分支是细胞质蛋白[5]。

啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中的PUF3p，PUF4p和PUF5p是细胞质中
PUF蛋白的代表，人类中的PUM1也属于胞质类[4]。

果蝇PUMILIO是最原始的一种PUF蛋白，其识别的RNA序列特异性较为简单，并且可被预测。

而FBF显示出与PUMILIO不同的RNA识别特性。

Hunchback （hb）mRNA是其中最早发现的一个可被PUF蛋白识别的目标，在果蝇中被PUMILIO识别，其包含一连串的纳米响应原件（Nanos Response Element，NRE），NRE 序列在 hb mRNA 的表达过程和胚胎极性建立的过程中是必不可少的[6]。

hb NRE的核心序列（5′-U1G2U3A4-U/C5-A6U7A8-3′）是 PUF 蛋白识别目标位点的模型。

所有的PUF蛋白都包含一个特异性序列，即RNA结合域，
也被称为Pumilio同源域（Pumiliohomology domain，PUM-HD）或PUF结
构域。

研究发现[7-8]，PUM-HD包含8个串联的α-螺旋PUF重复单元，整体呈月牙型。

PUF蛋白的RNA识别序列起始于5′-UGUR（R代表嘌呤），紧接着是
一些可变的3′序列，其中可能包含着一些保守元素[4]。

人类PUMILIO1（PUM1）结合于hb RNA的PUM-HD的晶体结构显示了PUF重复单元识别RNA序列的
大致原理[9]。

RNA结合于PUM1的内凹面，每个PUF重复通过3个保守侧链识别一个RNA碱基，其中，2个侧链与RNA的碱基边缘形成氢键或者分子间作用力，第3个侧链堆叠在同一碱基或前一个碱基。

RNA与蛋白质之间“反向平行”，核酸链的1～8位与蛋白质的8～1位分别相互识别（图1-a）[10]。

这种简单的
一个PUF重复识别一个碱基的识别模式就是典型PUF蛋白识别RNA的基本原理。

1 PUF蛋白的研究现状
1.1 结构研究
人类PUM1与RNA复合体的晶体结构说明特定的PUF重复识别特定的碱基。

这
种简洁的识别模式暗示着PUF蛋白结合序列的碱基特异性可被定点诱变。

这种思
路已被用于连接效应器结构域或荧光分子与MS2外壳蛋白，但这需要在目的
RNA中插入MS2发卡序列[11]。

OPPERMAN[12]研究发现，蠕虫中的2种PUF 蛋白可以识别不同长度的核心序列。

其中PUF-8识别8个碱基的序列，与hb NRE序列相似，而另一种PUF蛋白FBF更倾向于识别9个碱基的序列，与hb NRE序列相似，但在其第4，5个碱基之间还含有一个额外的碱基。

一些研究已经证明，自然环境可以改变PUF蛋白所识别的RNA的特异性。

STUMPF等[13]的
试验结果显示，在线虫中RNA特异性极其相似的PUF5和PUF6蛋白都含有10
个碱基的核心序列，以5′UGU开始3′UGU结束，而这2个蛋白都只含有8个重
复序列，说明这些蛋白不是采用一个重复结合一个RNA碱基的模式，其碱基特异性已经被环境所改变。

同样，在啤酒酵母中也存在类似的证据。

酵母共表达6种PUF蛋白，这些蛋白调节不同的目的RNA[14-15]，基因组学已经发现，其中的PUF4和PUF5分别识别9个和10个碱基的RNA序列。

结构生物化学研究进一
步阐释了PUF蛋白的特异性如何适应更长的序列。

MILLER等[16]用酵母PUF4与其识别RNA序列的晶体结构，揭示了9个碱基的RNA序列如何被8个PUF重复所识别。

有了PUF4的晶体结构，就知道了它是如何结合9个碱基的目的序列的，而修饰对特异性的改变是否有影响，相同的原理是否适用于其他PUF蛋白呢？对此，OPPERMAN[12]通过构建嵌合蛋白，证明了PUF蛋白的特异性可以通过改变嵌入碱基附近的蛋白质组分而得到转变。

GUPTA[17]用另一种方式研究PUF蛋白对RNA识别序列的适应性，通过研究PUM1结合非同源RNA序列，结果显示，PUM1与2条非同源的RNA序列有相对较高的亲和力，证明了PUF蛋白具有通
过游离碱基而优化识别目标的能力，也暗示着PUF蛋白可以进化，从而识别更长
的RNA序列。

目前，PUF蛋白与RNA识别特点越来越清晰，我们也更清楚地知道，RNA结合
模型是如何识别比从PUM1结构中预期的更大范围的序列。

单个重复的适应性和
通过把额外的核苷酸游离于RNA结合面以外的适应能力揭示了为什么PUF蛋白
间的RNA结合序列是高度保守。

1.2 功能研究
随着PUF蛋白与RNA识别模式的深入研究，更多人把研究重点放在了PUF蛋白
的作用上。

不同的生物体间编码PUF基因的数量差异非常大，它们在细胞水平上
的功能也不尽相同，目前研究的功能已经包括了细胞分化和发育[18-19]、生殖细
胞[20]、神经功能与记忆[21-23]、细胞周期[21]以及线粒体生物合成[23]。

一直以来，关于PUF的研究都认为，PUF蛋白的典型作用是作为转录后抑制子[4]，除了这个作用，在不同的生物体中，PUF蛋白表现出不同的作用。

有试验表明，PUF
蛋白还有助于mRNA的激活表达[24-27]和亚细胞定位[28-30]。

WICKENS等[4]首次阐述了PUF蛋白抑制mRNA表达的机制，研究显示，酵母Puf5特异性地直接结合于Ccr4-Pop2-NOTmRNA腺嘌呤酶复合物的Pop2亚基，从而引导腺嘌呤酶到mRNA，这种细胞质核酸外切酶缩短mRNA poly（A）尾巴[31]，对mRNA的稳定性和翻译都产生影响。

PUF蛋白的激活子功能是一个新的概念，但在不同的生物体中有越来越多的证据表明PUF蛋白具有该功能[24-27]。

目前，基于PUF蛋白的激活机制还没有很明确的定义。

有证据显示[24-27]，PUF 蛋白对于mRMA的激活作用可能是直接的，PUF蛋白依赖性的调节作用取决于mRNA 3′UTR上的PUF结合位点。

果蝇中的FBF被提到可激活另一个mRNA
gel4，但其机制还不清楚，很有可能是通过PUF蛋白和microRNA共同合作实现的[26]。

非洲爪蟾蜍也是PUF激活转录的一个例子，在其卵母细胞中，Pum结合元件（Pum-binding element，PBE）能促进转录激活，由细胞质聚腺嘌呤基化（cytoplasmic polyadenylation element-binding，CPEB）和其同源的细胞质
聚腺苷酸化元件（cytoplasmic polyadenylation element，CPE）介导[24]。

但
其转录激活的要求非常严格，如果CPE是非典型的，或CPEB出现二聚体，其激
活都会失败，这说明Pum的激活作用可能是因为协同作用，从而使CPEB与转录
子结合更稳定[24]。

动质体目原生动物的寄生虫布氏锥虫（Trypanosoma brucei）中也存在基于PUF蛋白的mRNA激活[27]。

Puf9能够在其细胞周期的S期稳定mRNA，Puf9的消耗会减少与其相互作用mRNA的多样性，说明Puf9能够稳定其目标，但若突变Puf9的结合区会导致mRNA的稳定性增加[27]。

对此最简单
的解释是Puf9与转录抑制子相互竞争目标mRMA 3′UTR序列[27]。

对于是否所
有的PUF蛋白都是激活子和抑制子，或者仅限定于某些PUF蛋白，这仍然是一个值得研究的问题。

PUF蛋白还具有mRNA定位的功能，对表达的空间控制具有一定的作用。

目前，大多数关于PUF蛋白的定位功能都来自于酵母。

其Puf3将mRNA定位到线粒体[22，32]，Puf6对ASH1转移到酵母出芽过程中能够促进其不对称定位[15]，
Puf5与过氧化物酶体影响PEX14 mRNA的定位[29]。

此外，在果蝇的嗅觉神经
元中FBF能够激活周围胞体和感觉纤毛egl-4 mRNA的翻译[26]，在哺乳动物中Pum2可能参与定位神经元中mRNA翻译[30，33]。

有科学家研究了酵母中
Puf6和Puf3的作用机制，研究发现，Puf6调节ASH1 mRNA的翻译和定位[15]，ASH1编码一个只在子细胞中表达的转录抑制子，并不在酵母母细胞中表达。

这是由于非对称和编码的mRNA的表达[15]。

Puf6结合于ASH1的3′-UTR，通过与
翻译起始因子elF5B/Fun12相互作用，从而抑制其在转移到胚芽过程中的翻译[28]。

当ASH1 mRNA到达了胚芽的目标位置，Puf6被CK2激酶磷酸化，这影
响了Puf6与mRNA的结合，从而开启了ASH1抑制。

Puf3与编码线粒体蛋白的mRNA相互作用[14]，并促进其在线粒体中的定位[22]。

有试验证明了Puf3在线粒体中的作用，Puf3与线粒体定位mRNA发生免疫共沉淀[14]、puf3诱变体中
会出现mRNA的错误定位[23]、Puf3与线粒体的结合是通过其与ERMES（ER-Mitochondria Encounter Structure）的亚基Mdm12相互作用[32]。

除了有助
于mRNA的定位，Puf3还会抑制其mRNA并使其脱腺苷化[32，34-35]，目前，
还不清楚 Puf3在mRNA定位和抑制间有什么联系。

1.3 在植物中的研究进展
目前，大多数基于PUF蛋白的研究都集中在酵母、果蝇等模式生物中，也有科学
家研究了拟南芥和水稻中的PUF基因家族，发现这2种模式植物的PUF基因家族成员比其他模式物种多得多，可能是由于整个基因组的复制导致了大量的PUF基
因[4]。

这些大量的PUF蛋白家族成员暗示着它们在细胞中对相关RNA的稳定和
翻译是非常重要的。

植物PUF蛋白早期只在关于植物发展史形成的文献中稍有提
及[4，36-38]，也有个别文献[39]提到拟南芥中PUF蛋白潜在目标mRNA的鉴定。

近年来，有文献[40-41]针对植物中PUF蛋白的作用进行了研究。

而植物中由于PUF基因家族数目的庞大，其功能涉及广泛，目前还未研究透彻。

2 结论
最近证据显示，PUF是多功能的mRNA调节子，可以作为抑制子、激活子以及mRNA定位因子。

基于这些调节子对细胞分化、发育以及干细胞维持等过程的影响，可以认为，PUF蛋白家族采用多种机制来调节目标RNA，从而行使不同的细胞功能。

PUF家族对于RNA定位的广泛作用和其识别作用与mRNA的抑制和激
活是如何相互协调的都还不是很清楚。

所以，目前需要解决的是PUF蛋白是如何
调节众多特定的目标mRNA，是激活还是抑制，或者二者都有？PUF依赖的调节
对于细胞内外的信号又是怎样变化的？更多的是，我们应该形成一种mRNA靶向功能的共同认识，这就能更清晰地知道PUF目标mRNA的亚细胞定位以及这种定位是如何依赖于PUF的，并且有助于启发我们去探索基因的时空表达与PUF作用的相互联系。

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