实验二 经口急性毒性LD50测定

实验二经口急性毒性LD50测定
实验二经口急性毒性LD50测定
一、试验目的
1. 熟悉急性毒性LD50测定的剂量设计
2. 掌握小鼠灌胃技术
3. 掌握改进寇氏法计算LD50的方法
二、试验原理
选择健康的实验动物，依据LD50计算的设计原则，将实验动物随机分成数个染毒组和一个阴性对照组。

一次或24小时内多次给予实验组受试物后，观察动物所产生的急性毒性反应及其严重程度，中毒死亡的特征以及可能的死亡原因。

根据受试物毒性反应与剂量的关系，求出半数致死剂量(LD50)，并根据LD50值将受试物进行急性毒性分级。

三、材料和试剂
1. 实验动物:健康成年小鼠60只，雌雄各半
2. 器材:灌胃针(小鼠适用)、注射器、吸管、容量瓶、烧杯、滴管、分析天平、台秤、外科手术剪、镊子
3. 受试物:(敌百虫或克佰威)
4. 染色剂:苦味酸酒精饱和溶液、0.5%品红溶液
四、实验内容
1. 实验动物称重、编号和随机分组
2. 染毒剂量设计及试剂配制
3. 小鼠灌胃染毒技术
4. 毒性反应的观察及LD50计算
五、试验方法
(一)预实验
1. 探索剂量范围
先找出100%与0%的致死量(或阳性反应的剂量)为实验的上、下限剂量(Dmax和Dmin)。

据经验或文献定出一个估计量，取动物若干，每4只一组，按估计量给药，如出现4/4死亡时，下一组剂量降低，当出现3/4死亡时，则上一剂量为Dmax;如降低一档剂量出现的死亡率2/4或1/4时，应考虑到4/4死亡剂量组在正式实验时可能出现死亡率低于70%，为慎重起见可将4/4死亡剂量乘以1.4倍，作为Dmax。

以次类推，找出Dmin。

2. 剂量分组
一般染毒组数(G)以5-8组为宜，组间剂量比值为r。

在确定组数后，按下列公式计算r。

1/(G-1)r = (Dmax/Dmin) 3. 受试物溶液的配制
配制等比浓度的敌百虫溶液，并使每只动物在给药容量上相等(如
0.5ml/20g)。

剂量按等比级数增减，相邻两剂量比值1:0.6,0.9，设5个剂量组。

(二)正式试验
1. 动物的分组
1.1 区分性别
辨别小鼠性别，并将雌雄动物分开放入不同笼具中。

1.2 称重
称量并记录每只小鼠的体重，要求小鼠体重在20?2g范围内。

1.3 编号
小鼠称重后，立即以染色法编号。

用苦味酸酒精饱和溶液(黄色)标记个位数号码，品红(红色)标记十位数号码。

一般以头部为1号，按顺时针依次右前肢为2
号，右腰为3号，右后肢为4号，尾根部为5号，右后肢为6号，左腰为7号，左前肢为8号，后背为9号，10号为在头部染红色标记，11号在右前肢染红色和黄色标记各一，依次类推。

1.4 分组
从随机数字表上抄录30个随机数字，分别除以6(因为要将动物分成6组)，写下余数。

如果被除数小于除数，商数为0，那么被除数即为余数;如果被除数为0，余数亦为0。

然后按余数分组:余数为1，即将动物归入第一组;余数为2，归入第二组;以此类推，余数为0，归入第六组。

请分别将动物的分组情况填入实验报告的表1和表2中。

如各组动物数不等，则需调整。

调整时，仍从随机数字表中抄录若干随机数字，然后用待调整组动物数去除该随机数字，以决定将哪一只动物调整至其他组。

如随机数字分别为83、89。

而待调整组动物数为8，先用8去除83，得余数为3，于是将该组的第3只动物调至其他组。

再用7(因待调整组还剩7头动物)去除89，得余数为5，于是将该组的第5只动物调整至其他组，余类推。

计算各组动物的平均体重，同一次实验中动物体重变异不应超过平均体重的20%。

2. 剂量设置
本次实验采用改良寇氏法，分5个染毒剂量组，由教师指导同学进行染毒剂量设计。

3. 受试物的配制
3.1 量取受试物:固体化学物采用称量法，液体化学物可用称量法或吸量法。

3.1.1 称量法:准确称取一定量的受试物，放入烧杯中，加溶剂溶解或稀释，倒入刻度容器(如容量瓶)内，混匀，再加溶剂定容。

计算受试物浓度(mg/m1)，备用。

3.1.2 吸量法:依设计剂量计算出应吸取液态受试物的容积，加入容量瓶中，用溶剂加至刻度。

计算公式为:X=A?V/d?1000
式中:X——应吸取受试物的容积(m1)
A——设计要求的受试物浓度(mg/m1)
V——容量瓶容积(m1)
d——受试化学物比重
3.2 受试物的配制
3.2.1 等容量稀释法:按实验最大剂量组所需受试物溶液的浓度及体积，计算所需受试物量，配制最高剂量组试液;再按组距，逐组稀释，分别配出各剂量组所用的受试物药液。

3.2.2 等浓度稀释法:将受试物配成一种浓度的溶液，各剂量组的动物将给予不同体积的受试物。

等容量稀释法和等浓度稀释法计算举例如下:
若最大剂量组为760mg/kg(7.6mg/10g)，灌胃量为0.1ml/10g，则受试物浓度应为7.6mg/ 0.1ml，即76mg/1ml。

欲配置50ml该溶液，需受试物量为
7.6mg/0.1ml×50ml=3800mg。

其
余试剂的配制依此类推，详见表1。

表1 两种稀释法配制受试物计算结果举例
等容量稀释法等浓度稀释法剂量(mg/kg) 浓度(mg/ml) 灌胃量(ml/10g) 浓度(mg/mL) 灌胃量(ml/10g)
760 76 0.1 76 0.1
380 38 0.1 76 0.2
190 19 0.1 76 0.4
95 9.5 0.1 76 0.8
49.5 4.95 0.1 76 1.6
4. 灌胃染毒及毒效观察
4.1 要求
灌胃染毒应在动物空腹时进行，一般在染毒前禁食4小时。

因为胃内充满食物会增加注入阻力，并影响毒物的吸收。

4.2 灌胃量
本实验各剂量组采用等容量灌胃法，灌胃量为0.1ml/10g。

若小鼠体重为
18g，则灌胃量为0.18ml。

4.3 灌胃操作
左手抓住小鼠耳后、颈部的皮肤，用无名指、小指和大鱼际肌将其尾根部压紧，将动物固定成垂直体位，腹部面向操作者，注意使动物的上消化道固定成一直线。

右手持灌胃针，吸取所需受试物溶液后，将针头由小鼠口腔插入，避开牙齿，沿咽后壁缓缓滑入食管。

若遇阻力，可轻轻上下滑动探索，一旦感觉阻力消失，即可将灌胃针插入胃部。

如遇动物挣扎抵抗，应停止进针或将针拔出，千万不可强行插入，以免穿破食管，甚至误入气管，导致动物立即死亡。

小鼠的进针深度一般为2.5-4cm。

为验明是否已正确地插入胃部，可轻轻抽回注射器，如无气泡抽出，表明以插入胃中;如有大量气泡，则提示误入气管，应抽出重插。

确定将灌胃针插入胃部后，将受试物溶液注入小鼠胃部并抽出灌胃针，完成灌胃操作。

一般小-1ml。

鼠的灌胃容量为0.2
4.4 毒效应观察
染毒后注意观察并记录动物毒性体征和死亡情况。

高剂量组动物的死亡常很快发生，染毒后应立刻密切注视。

观察内容包括:?动物的死亡时间，各组动物的死亡数;?中毒症状，各组动物出现症状时间、表现等。

持续观察，直到动物不再因药物作用而死亡为止。

观察期间应注意保证食、水、温度等生活条件，严防非试验因素引起的死亡。

最后将死亡情况及各种数据填入实验报告中。

5. 计算LD50
按改良寇氏法公式进行计算。

-1LD=log[Xm-i(?P-0.5)] (公式1) 50
Xm:最大剂量组剂量对数值
i:相邻两组剂量高剂量与低剂量之比的对数(相邻两组对数剂量的差值) P:各组动物死亡率，用小数表示(如果死亡率为80%应写成0.80) ?P:各组动物死亡率之总和
n:每组动物数
2 (公式2) S,i，(P,P)/(n,1),,X50
S:logLD的标准误 x5050
X=logLD 5050
-1LD的95%可信限=log(X?1.96S) (公式3) 5050x50
LD的平均可信限=LD?(LD的95%可信限的上限-下限)/2 (公式4) 505050。