天麻素联合地塞米松保护缺糖缺氧诱导的H9C2细胞损伤

◇
基础研究
◇
中国临床药理学与治疗学中国药理学会主办!"#$ %&'()*，+,,"%''- &.'%
/0012))3334565104578&'&%"79:&(;%%<2%&$$ %&$-
&'&% '= '$
收稿　&'&% %' %#修回
新乡医学院博士科研启动基金（g`T,W`UU&'%-'%%）；国家自然科学基金青年基金（=%(''(>>）吴畏，女，硕士，主治医师，研究方向：重症急救。

VDB2%#>=%-&'$.-　? 8@AB2L7507N33'='#F%(#4578杨飞云，通信作者，女，本科，主任医师，研究方向：急危重症。

VDB2%#.&.''..'#　? 8@AB2R@EOMDARQE>-F%&(4578
天麻素联合地塞米松保护缺糖缺氧诱导的_-!&细胞损伤
吴畏，李广鹏，张江波，孔令宇，蔡君艳，杨飞云
新乡医学院第一附属医院急救医学科，卫辉$.#%''，河南
摘要　目的：探讨天麻素（O@G0N7LAEP bK,）联合地
塞米松（LD[@8D0/@G7EDP J?g ）在缺糖缺氧诱导心肌细胞损伤中的作用及可能机制。

方法：建立缺糖缺氧细胞（7[RODE OBQ57GD LD1NA9@0A7EP cbJ ）模型，细胞分为.组，即正常对照组（E7N8@B
ON7Q1），缺糖缺氧组（cbJ ON7Q1），J?g 组，bK,组，J?g e bK,组。

利用!!W =实验检测各组心肌细胞活性，利用比色法检测乳酸脱氢酶（SJ_）的活性；利用Vi"?S 法检测各组心肌细胞的凋亡情况；利用实验检测各组心肌细胞培养液中炎性因子；利用fDG0DNE YB70检测各组心肌细胞中"705/%、T@[、T5B &及TD5BAE%的表达情况。

结果：结果显示bK,与J?g 联合使用可显著提高损伤心肌细胞的活性，减少心肌细胞的凋亡；降低促炎因子V"d α、+S (和+S %β的产生及促进抑炎因子+S %'的产生，降低SJ_的释放；fDG0DNE YB70结果显示bK,与J?g 联合使用可促进"705/信
号通路中"705/%的表达，
显著降低受损心肌细胞中促凋亡蛋白T@[的表达，促进抑凋亡蛋白T5B &的表达，促进自噬相关基因TD5BAE%的表达。

结论：bK,与J?g 联合使用，可能通过促进"705/信号通路的激活，促进其自噬，提高细胞的活性，抑制心肌细胞的凋亡，减轻炎症反应，从而减轻cbJ 诱导的心肌细胞损伤。

关键词　天麻素；地塞米松；缺糖缺氧；自噬；凋
亡；"705/信号通路
中图分类号：*$.-4-文献标志码：K
文章编号：%''- &.'%;&'&%<%% %&$$ '(L7A ：%'4%&'-&)64AGGE4%''- &.'%4&'&%4%%4''$
心肌梗死是临床上造成患者猝死的常见的心
血管疾病之一［%
］，
再灌注治疗是最及时有效的治疗方式，再灌注在改善心肌缺血的同时，也会造成一系列的病理反应，如炎症、氧化应激等，进而造成心肌细胞的凋亡和坏死［& #］。

天麻素（O@G0N7L
AEP bK,）是中药天麻主要活性成分，具有抗炎、氧化作用，研究显示，bK,对损伤的心肌细胞具有一
定的保护作用，保护心功能［$ .］，
但其作用机制并不明确。

研究显示糖皮质激素通过其抗炎和抗心肌细胞的凋亡及坏死作用，发挥其对小鼠心梗后的心肌细胞的保护作用［( >
］，然而，bK,与地塞米松（LD[@8D0/@G7EDP J?g ）
联合使用的作用如何，其机制如何还未见报道。

本研究建立_-!&细胞缺糖缺氧模型，检测bK,与J?g 联合使用对_-!&细胞的作用及其可能机制，为临床缺血缺氧性心肌疾病的治疗提供参考。

材料与方法
主要试剂　天麻素注射液（O@G0N7LAEP bK,）
（国药准字_&''%#'$(），购自昆药集团，地塞米松（LD[@8D0/@G7EDP J?g ）（J$-'&）购自美国,AO8@公司，JH?H 培养基、胎牛血清购自美国_R5B7ED 公司，"705/%（G5 #>($'#），TD5BAE%抗体（G5
$=#$%），T5B &抗体（G5 >#=&），T@[抗体（G5 &''(>）购自,@E0@!NQC 公司，bKIJ_抗体（b-.$.）
购自
,AO8@公司。

!#"　
大鼠心肌细胞\TC"的培养　_-!&细胞（大鼠心肌细胞）购自美国KV!!细胞库，_-!&细胞种植于内含%'k 胎牛血清高糖JH?H 培养基中（%''i)8S 青霉素及'4%8O)8S 链霉素）#>℃、.k
!c &
的恒温培养箱中培养，&～#L 传代%次，
实验所用细胞均为对数生长期细胞。

!#7　缺氧缺糖细胞模型的建立　传代后的_-!&细胞正常条件下培养&$/后（#>℃、.k !c &
的恒温培养），去除培养液，更换成无血清的低糖JH?H 培养液，%k c &
、-.k "&
、.k !c &
条件下培养&$/。

!#8　实验细胞分组　正常对照组（E7N8@B
ON7Q1），缺糖缺氧组（cbJ ON7Q1，缺糖缺氧条件培养&$/），J?g 组（加入'4%μ87B)S J?g 后，缺糖缺氧条件培养&$/），bK,组（
加入%'4'μ87B )S bK,后，缺糖缺氧条件培养&$/后），J?g e bK,
组（加入'4%μ87B)S J?g e %'4'μ87B)S bK,后，缺糖缺氧条件培养&$/后）。

!#F 利用CCL S 实验对各组细胞活性的检测　将
_-!&接种于-(孔板中，
接种密度.×%'#
个)孔，按照上述方法将细胞分为.组，
检测各组活性，每孔加入%'μS !!W =溶液，正常培养条件下继续孵育&～$/，酶标仪测cJ （K ）
值。

!#Q 利用9]^MU 法检测细胞凋亡情况　提前制备好无菌的盖玻片放置于(孔板中，将_-!&接种于(孔板中培养&$/后，按照上述方法将细胞分为.组，严格按照使用说明书进行Vi"?S 染色，封片，显微镜下选择视野，观察染色结果并拍照，每组设置.个副孔，计算凋亡指数，凋亡指数p 凋亡细胞数)细胞总数×%''k 。

!#R 检测各组细胞培养液中炎性因子及乳酸脱氢酶（U?\）的含量　将_-!&细胞接种于(孔板中，按照上述方法将细胞分为.组，收集各组细胞培养液上清，按照试剂盒说明书检测各组细胞培养液中V"d α、+S (、+S %β、+S %'及SJ_的含量，利用酶标仪$.'E8处检测吸光度值，计算各组细胞培养液中细胞因子的含量。

利用SJ_检测试剂盒检测各组细胞培养液中SJ_的含量。

步骤均严格按照说明书操作。

!#S O36/3.4:()/　弃去培养液，收集细胞，IT,
冲洗两遍细胞，裂解液裂解细胞，提取总蛋白，电
泳、转膜，封闭液室温封闭膜%/后，加入"705/%抗体（%∶%'''），T5B &抗体（%∶.''），T@[抗体（%∶
.''）
，TD5BAE%抗体（%∶.''），bKIJ_抗体（%∶%''''）$℃孵育%&/以上，
荧光++抗避光孵育&/后（室温），曝光，+8@OD U 软件分析灰度值。

!#T 统计学分析　利用,I,,%-4'软件进行数据分析处理，本研究中计量资料以均数±标准差（ ± ）表示，多组间显著性检验采用单因素方差分析， m '4'.表示差异具有统计学意义。

"　
结果
"#!　
各组\TC"细胞活性的变化　如V@Y4%所示，与正常对照组相比较，cbJ 组细胞的活性显著降低；而与cbJ 组相比较，J?g 组与bK,组细胞活性显著升高；与J?g 组和bK,组相比较，J?g e bK,组细胞的活性进一步升高。

9-:#!　I+/&Y&/;)0+3((6&43-+,'.)A5D ± X 7E
bN7Q1cJ 9@BQD !7E0N7B ON7Q1'4=$(±'4'%#cbJ ON7Q1'4##=±'4'%$5J?g ON7Q1'4$>$±'4'%%D/bK,ON7Q1'4$-%±'4'%&D/J?g e bK,ON7Q1
'4('$±'4'&%
5
m '4'%P 5781@NDL 3A0/57E0N7B ON7Q1:D m '4'.P 5781@NDL 3A0/
cbJ ON7Q1:/ m '4'.P 5781@NDL 3A0/J?g e bK,ON7Q14
"#"　
各组\TC"细胞的凋亡变化　如dAO4%所示，与正常对照组相比较，cbJ 组凋亡细胞数目显著增多；而与cbJ 组相比较，J?g 组与bK,组凋亡细胞数目显著减少；与J?g 组、bK,组相比较，
J?g e bK,组凋亡细胞数目进一步减少，
凋亡指数显著降低。

"#7　各组细胞培养液中细胞炎性因子与U?\的
变化　如V@Y4&所示，与正常对照组比较，cbJ 组
细胞培养液中V"d α、+S (、+S %β的含量显著升高，而+S %'的含量显著降低，SJ_的含量显著升高；而与cbJ 组相比较，J?g 组与bK,组细胞培养液中V"d α、+S (、+S %β的含量显著降低，+S %'的含量显著升高，SJ_的含量显著降低；与J?g 组、bK,组相比较，J?g e bK,组细胞培养液中V"d α、+S (、+S %β的含量显著进一步降低，+S %'的含量进一步升高，SJ_的含量显著进一步降低。

%&'#!　M003+/6)0[I@-42?M_)4-5)5/)6&6&4P[? /.3-/32\TC"+3((6D ± X7E
K2Vi"?S G0@AEAEO;×$'<:T2,0@0AG0A5@B@E@BRGAG45 m'4'%P5781@NDL3A0/57E0N7B ON7Q1:D m'4'.P5781@NDL3A0/cbJ ON7Q1:/ m'4'.P578 1@NDL3A0/J?g e bK,ON7Q14
9-:#"　9,3+)4/34/)0+;/)B&436-42U?\&43-+,'.)A5+3((6D ± X7E
bN7Q1V"d α;1O)8S<+S (;1O)8S<+S %β;1O)8S<+S %';1O)8S<SJ_;i)S< !7E0N7B ON7Q1(4#$±'4..(4$=±'4(..4=#±'4.=.'4#&±%4##$4==±'4#>
cbJ ON7Q1$'4.$±%4.-5$-4$&±%4==5.'4#$±%4-(5%%4(>±%4'%5#&4$>±&4.%5
J?g ON7Q1#'4&%±%4'$D/#'4$(±%4$#D/#-4=$±%4=#D/&&4=$±%4&>D/&&4(>±%4-(D/
bK,ON7Q1##4#(±%4&$D/&-4==±%4&=D/#=4(-±%4>>D/&$4(-±%4.&D/&'4#>±%4(&D/ J?g e bK,ON7Q1%(4=%±%4%%&'4#$±%4&#%-4==±'4(-#(4$-±%4#-%%4$-±%4#$
5 m'4'%P5781@NDL3A0/57E0N7B ON7Q1:D m'4'.P5781@NDL3A0/cbJ ON7Q1:/ m'4'.P5781@NDL3A0/J?g e bK,ON7Q14
"#8　各组细胞中^)/+,!的表达情况　fDG0DNE
YB70检测bK,与J?g对cbJ诱导的_-!&细胞中
"705/信号通路的活性，结果如dAO4&所示，与正常
对照组相比较，cbJ组中"705/%的表达显著升
高；与cbJ组相比较，J?g组、bK,组中"705/%的
表达显著升高；而与J?g组、bK,组相比较，J?g
e bK,组细胞"705/%的表达进一步升高，这就提
示J?g与bK,联合使用可通过促进"705/信号
通路的激活而发挥心肌细胞的保护作用。

"#F　各组细胞中J+( "，J-H，J3+(&4!的表达情况　
fDG0DNE YB70检测bK,与J?g对cbJ诱导的
_-!&细胞凋亡与自噬相关蛋白的表达变化，结果
如dAO4#所示，与对照组比较，cbJ组细胞中T@[、
TD5BAE%的表达显著升高，而T5B &的表达显著降
低；与cbJ组相比较，J?g可促进细胞中T5B &的
表达，对T@[与TD5BAE%的表达作用不明显，bK,
可促进细胞中T5B &、TD5BAE%的表达，降低T@[的
表达；与J?g组和bK,组比较，J?g e bK,组中
T@[的表达显著降低，T5B &、TD5BAE%的表达显著升高，这就提示，J?g与bK,联合使用可显著抑制细胞凋亡，促进细胞自噬，减少缺糖缺氧对_-!&细
胞的损伤。

%&'#"　M003+/6)0[I@-42?M_)4^)/+,!3H5.366&)4&4
7　讨论
bK,是中草药天麻的主要活性成分，研究显示因其具有抗炎、抗氧化和抗细胞凋亡、神经保护等作用，常用于临床多种神经系统疾病的治疗［= %'］。

近年来的研究显示，bK,对损伤的心肌细胞具有一定的保护作用，保护心功能，bK,通过改善线粒体动力学失衡和线粒体功能障碍保护_-!&心肌细胞免受氧化损伤［%%］，bK,通过抑制"S*I#表达减轻败血性休克小鼠心肌细胞的炎症损伤［%&］。

糖皮质激素同样具有抗炎和抗心肌细胞凋亡的作用。

本实验首次研究bK,与J?g的联合作用，结果显示bK,联合J?g可提高缺糖缺氧条件下心肌细胞活性，降低细胞凋亡率，促进细胞自噬，提示bK,联合J?g抑制缺糖缺氧诱导的心肌细胞凋亡，促进细胞自噬，发挥对心肌细胞损伤的保护作用。

近年来的研究显示，"705/信号通路在心肌
HA5N7*"K --@
通路对脂多糖诱导的心肌细胞氧
［%#］。

在烧伤引起的心肌细胞
信号发挥细胞保护作用［%$］。

_+d %α的表达促进细胞自噬，发
［%.］。

在_-!&心肌细胞中，
KX0)1#=HKIW信号通路，抑制血清
从而发挥抗心肌+)*
［.］，bK,是否可通过"705/信号
本研究的结果显示
的联合使用可显著升高"705/%的表
信号通路的激活，提示bK,与J?g
"705/信号通路而发挥
在机体的生理和病理过程中都
自噬可降解非功能
会导致细胞膜结
SJ_释放到培养液中，
［%=］。

本研究的结果
J?g的联合使用可显著降低模型细
T@[的表达，促进T5B &的表
达，促进自噬相关蛋白TD5BAE%的表达，降低模型细胞的凋亡指数，提高细胞活性，减少SJ_的释放，这就提示bK,与J?g的联合使用，可通过抑制心肌细胞的凋亡，促进其自噬，提高细胞的活性，降低细胞毒性，从而发挥细胞保护作用。

缺血缺氧引起的心肌细胞损伤中，炎症反应是主要的病理变化［%-］。

而研究显示bK,具有降低血清炎症因子，抑制炎症发生的作用［&'］。

bK,与J?g的联合使用对炎性因子的影响还未见报道。

本研究的结果显示，bK,与J?g的联合使用可降低促炎因子V"d α、+S (、+S %β的产生，而促进抑炎因子+S %'的产生，从而减轻炎症反应对心肌细胞的损伤。

综上所述，bK,与J?g的联合使用，可能通过促进"705/信号通路的激活，抑制心肌细胞的凋亡，促进其自噬，提高细胞的活性，减轻细胞毒性，减少炎性因子的释放，减轻炎症反应，从而发挥细胞保护作用。

然而对bK,与J?g的联合作用药理机制的探讨存在不足，其对"705/信号的影响还需后续深入研究。

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