大肠杆菌与遗传测序

实时定量RT-PCR系统示意图，浙江大学，张云霞，2013.04
数据采集处理：采用自编的Labview程序读取各个循环荧 光照片上液滴的荧光强度值,得到荧光强度随反响循环数增 加的变化曲线。以各条曲线前10个循环荧光强度值Rn的标 准偏差的10倍作为阈值,取大于阈值的循环数作为CT〔临 界循环次数〕值。以参加miRNA-122的拷贝数的对数值作 为横坐标,CT值为纵坐标拟合出标准曲线。 〔 了解〕
2% RNase去除剖〔体积比〕:使用娃哈哈纯洁水稀释RNase去除刻,用 于芯片及PCR耗材清洁。 〔了解〕
实验芯片：
亲水点阵列芯片加 工，采用CorelD RAW X3软件绘制 芯片掩膜图。硅片 为直径76 mm的圆 形薄片,每块桂片可 加工出7块 13X13mm芯片。芯 片设计成6 X6点阵, 点直径为0.5 mm, 间距为1.7mm。 〔参考〕
主要通过检测什么检测大肠杆菌
主要通过检测什么检测大肠杆菌： 1、菌落数量 2、大肠杆菌生成物间接检测 〔β-半乳糖苷酶, β-葡萄糖醛酸酶〕 3、外表抗原 4、DNA
1、芯片化的大肠杆菌检测法
1.1、在线富集技术在微流控芯片上实现低浓度细菌微生物 超灵敏检测
背景：由于在水、食品和临床样品病菌的感染剂量可能非常低,为 了能够快速测量存在于实际样品中低浓度的病原微生物,科研工作中己 经投入了相当大的精力到这一领域。本文通过将壳聚糖〔CS〕扫集, 反转电场堆积和场放大样品堆积多步浓缩方法联合,在芯片上实现了细 菌的高因此常被用于絮凝吸附
剂和不同作用的绑定试剂。因为在细菌和病毒细胞外膜外表具 有羟基和磷酸根基团,常使其带负电荷,CS与细胞可通过静电作 用可使其聚集。并且CS也常作为天然抗菌剂被大量使用。因 此,CS的高吸附能力可使其用于细菌浓缩,并且作为扫集试剂可 以保持细胞的活性。此外,通过将CS扫集、场放大样品堆积和反 转电场富集技术联合使用,在微流控芯片上一体化实现了多步浓 缩检测方法。〔知道〕
微流控芯片系统的条件：用于实验的“十字〞通道微流控芯片微 通道深为25 宽为100 um。别离通道长为50 mm,其他通道与交叉 口的距离为10 mm。铂电极作为电源与溶液之间的导电电极。芯 片使用之前需要用98 %的浓硫酸和去离子水各冲洗10 min。随后, 用1 mol/L NaOH冲洗通道20 min,再用去离子水冲洗10 min,最后 用运行缓冲溶液清洗10 min。芯片清洗过后,将含有CS〔壳聚糖〕 的别离缓冲芯片对通道进行预涂敷处理。 〔参考〕
1.2、纳升级液滴阵列实时定量RT-PCR系统的研究
综述：基于平面液滴阵列的微流控系统具有系统简单、成本低廉、 液滴操控灵活、适于多步集成操作及液滴后续操作等优点,在微流 控系统的实时定量PCR技术显示了广阔的应用前景,尤其是基于液 滴的PCR系统。液滴微反响器将反响液分隔在单分散体系中,减少 了 PCR歧视及非特异性扩增;反响体积可为纳升至皮升级,与细胞 体积相当,能够有效限制内容物的扩散,降低背景对信号的稀释作用; 通过不溶相使液滴微反响器与微通道内壁间隔开来,最大限度地减 少了通道内壁对试样的吸附,消除了交叉污染。〔知道〕
实验材料及试剂：
单晶桂片〔N111型〕:上海齐鸣桂材料,上海。 氧化锡铟〔ITO 〕玻璃〔1.1 mm厚,lOohm/m2〕:深圳莱宝高科技股份,深圳。 AZ4620光胶:安智电子材料公司,苏州。 环氧树脂〔合众全透明AAA超能胶〕:浙江黄岩光华胶點剂厂,黄岩。 荧光素纳〔产品编号:FT0989 〕:上海生工生物工程股份,上海。 氟化铵〔NH4F〕:国药集团化学试别,上海。 氢氧化纳〔NaOH〕:国药集团化学试剂,上海。 浓硫酸〔H2SO4〕:国药集团化学试劍,上海。 氢氟酸〔HF〕:国药集团化学试刻,上海。 硝酸〔HN03〕:国药集团化学试劍,上海。 异辛院:国药集团化学试剖,上海。 无水乙醇〔C2H5OH〕:国药集团化学试剂,上海。 〔了解〕
实验材料及试剂：
溶融石英毛细管:河北永年锐洋色谱器件 Tygon〔聚乙烯〕 管: Saint-Gobain Performance Plastics,Franceo 微量注射器〔10 pL,1701N 〕: Hamilton, Switzerland。 DMEM 〔细胞培养基〕高糖培养液: Gibco, Life Technologies, USA。 FBS〔胎牛血清〕: Gibco, Life Technologies, USA。 PBS〔磷酸盐缓冲液〕 〔PH 7.2〕: Gibco, Life Technologies, USA。 生理盐水〔0.9%NaCl溶液〕:浙江大学校医院,杭州。 Calcein-AM 〔活细胞荧光染色别 〕 Invitrogen, Life Technologies,USA。 〔了解〕
标准条件下多步浓缩富集方法对大肠杆菌的定量检测曲线。
自然水体中大肠杆菌的检测：由于地表水中细菌的浓度 经常<30 CFU/mL,具有较高富集倍数的检测方法才能测 定河水中的大肠杆菌。此外,因为河水中常含有CO32-、 SO4 2-等，运行缓冲的电导率远远低于河水。由于使用的 浓缩方法局部是基于运行缓冲和样品缓冲中不同的电导 率,因此必须过滤水样以去除水中含有的离子。此外,经过
背景：MicroRNA 〔 miRNA 〕是一类非编码的小 RNA序列,其长度只有18-25个碱基。越来越多的研究 证明,miRN A 在很多基因的表达过程中起到了分子开 关的作用,在许多癌症及重大疾病的发生和开展 中,miRNA都出现了异常表达现象。因此准确对 miRNA进行定量检测具有重要的生物学和临床意义。 〔了解〕
微流控芯片多步浓缩方法用于细菌检测：对于场放大细菌堆 积,与运行缓冲溶液相比,细菌细胞应该分散在更低电导率的样 品缓冲溶液中。牛磺酸能够使细胞聚集从而改善检测灵敏度,将 少量的牛磺酸添加到悬浮液中。以下图是芯片电泳五步浓缩过 程示意图。通过施加相应的电压对细菌细胞进行在线富集和浓 缩。 〔图〕
细菌在线富集别离机理示意图。 〔A〕预上样;〔B〕进样,〔C〕场放大样品堆集 和扫集,〔D〕反转电场富集,〔E〕别离。黑色区带代表浓缩的细菌样品,灰色代表 样品基质,空白代表含有CS〔壳聚糖〕的运行缓冲,箭头表示电渗流方向。 Analytical Chemistry, 2012,84,1687 ，华东师范大学，王志芳
1.3、基于纳升级液滴阵列的自动化单细胞实时定量RTPCR系统的研究
综述：研究基因型与表现型之间的关系是生物学及医学开展的重要环节, 以定量测定细胞内各类RNA表达为目标的转录组研究对于基因表达和分 子诊断研究尤为重要。同一器官中的所有细胞具有特定的基因型,而细胞 个体之间基因表达却有很大差异,这就造成了细胞亚群的分化,并具有不同 的生理功能、应激行为及表现型。由于这种细胞异质性的存在,转录组研 究需要在单细胞水平进行。因而，针对单细胞的基因分析为大量细胞中 稀少变异细胞的检测提供了方法,特别对重大疾病与癌症的早期诊断、胚 胎植入前遗传学诊断、微生物亚群分类及法医鉴定等研究具有非常重要 的作用。 〔了解〕
Labview数据采集系统软件界面
芯片清洗及注意：每次使用后,使用医用脱脂棉蘸洗海刻搓洗芯片 外表,再分别用去离子水及娃哈哈纯洁水冲洗。清洗外表后,将芯片 置于2%RNase去除剂中浸泡5min,以减少RNA降解,防止PCR污染。 用娃哈哈纯洁水冲洗后,在烘箱中65 °C-80°C烘干30min。清洁 后的芯片置于干净的培养皿中,室温存放。实验中经清洗后的芯片 不会产生PCR污染,可反复使用。芯片最长使用时间可达一年。本 实验全程需佩戴口罩及乳胶手套。芯片硅烷化、光刻及湿法刻烛 过程中,使用试刻的挥发性和腐蚀性较强,尽量在通风橱内操作。玻 璃研磨过程中要带防护眼镜以保护眼睛。 〔知道〕
实时定量RT-PCR系统构建：将芯片置于商品化基因扩增仪 〔MGL96G/Y,杭州朗基科学仪器〕的载物合上,用PCR仪控制热循环 温度。将ITO玻璃罩在芯片上方,结合自制的温度控制模块,维持温度 恒定,以起到热盖的作用。以汞灯作为荧光激发光源,利用Nikon体视 荧光显微镜〔SMZ1500, Nikon, Japan 〕的光路系统采集荧光。用 Labview〔 Labview 8.0,National Instruments, Austin, USA 〕程序控制 CCD 〔 电荷耦合器件〕和自制的挡光阀,在每个循 环退火阶段拍摄荧光照片。 〔图〕
细菌悬浮液的准备：大肠杆菌在 LB 培养基 30 度下培养 13 h。在 3400 rpm〔每分钟转数〕离心5min,上清液去除,再次用无菌水对 细胞进行清洗,离心,重复这个过程5次以去除残留的培养基并且到 达清洗细胞的目的。近红外核酸荧光染料SYTO 62用来标记细菌 细胞。最后,标记的细菌细胞悬浮在含有牛磺酸的缓冲溶液,浓度约 1.0x107CFU/mL。在每次使用之前,新准备的细胞悬浮液需要漩祸 60-90 S以防止细胞聚集。〔了解〕
实验溶液配制：
硅烷化试剩:将OTCS与异辛烷混合作为硅烷化试剂,体积比为0.1%-1% 均可,现用现配。 芯片刻姓液分别量取HF16mL、NH4F 7.4 g. HNO319.2 mL.去离子 水364.8 mL在塑料器皿中混勻,配置成摩尔浓度比HF: NH4F; HNO3为1: 0.5:0.75的芯片刻烛液,常温保存,可重复使用。 光刻显影液:称取0.7 g NaOH固体溶解于100 mL去离子水中,配置成0.7 %NaOH溶液,作为光刻显影液。 0.1 M荧光素纳溶液:用于多步加样过程的观察。 成熟 miRNA-122 〔 mir-122, UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUG 〕 序列来源于 Sanger Center miRBase ,由上海吉玛制药技术〔上海〕负 责合成。
预富集的细菌水样的浓度必须到达多步浓缩方法的检出
限。因此可以通过无菌滤膜过滤预富集水样中的大肠杆 菌。
多步浓缩富集方法对地表水中大肠杆菌的检测
小结：为了提高检测灵敏度,能够实现实际样品中低浓度细菌的测 定,将堆积、扫集和其它预浓缩方法的联合使用是必要的。我们通 过使用微流控芯片展示了多步浓缩方法〔CS扫描、反转电场和场 放大样品堆积〕可以用来加强细菌富集,实现低浓度污染的样品的 测定。比照于常用的细菌检测方法,多步方法具有高灵敏度、低样 品需耗量和快速分析的优点。〔知道〕
材料和仪器
三羟基甲基氨基甲烧〔Tris〕,硼酸,乙二胺四乙酸 〔EDTA〕购置于Aldrich公司〔Milwaukee,WI,USA〕。 壳聚糖,牛璜酸和半胱氨酸购置于上海国药集团。大肠 杆菌、E. coli〕购置于广东微生物种质资源库。所有 的实验在自制的微流控-激光诱导焚光检测系统〔MCE〕 上实施。微流控系统主要由上海光谱提供。 〔了解〕
小结：本工作中,我们开展了一种半敞开式的纳升级平面液滴阵 列平台,并将其应用于miRNA-122的实时定量RT-PCR检测中。 利用平面液滴的优势,在经外表修饰的亲水点阵列芯片上,实现了 液滴的定位和多步加样操作。该芯片具有加工简单、操作灵活、 易于普及等优点,可以作为一种通用型的生物化学反响平台使用。 此外,该系统可在试剂消耗、检测通量及系统集成化微型化等方 面进一步优化改进,有望在大规模高通量分析领域发挥重要的作 用。 〔知道〕
技术条件：实时定量〔反转录〕聚合酶链式反响〔以下简称qPCR
或qRT-PCR〕技术是以传统PCR技术为基础建立起来的一种可对原 始核酸〔包括DNA和RNA〕模板拷贝数进行准确定量分析的一种现代 分子生物学检测技术,已经广泛地用于分子诊断,疾病研究,临床医学等 领域。qPCR技术遵循传统PCR的扩增原理,不同的是在每一个循环的 退火或延伸阶段进行实时荧光检测。根据溶液中模板的原始拷贝数的 对数与扩增循环数Ct存在的线性关系,对核酸进行定量分析。实时定 量PCR技术具有准确度高,灵敏度高及检测范围宽〔超过5个数量级〕 等特点,因此非常适用于miRNA的定量检测。 〔知道〕