烟草类胡萝卜素双加氧裂解酶基因的克隆与功能研究

烟草类胡萝卜素双加氧裂解酶基因的克隆与功能研究
重庆大学硕士学位论文
（学术学位）
学生姓名：高军平
指导教师：夏庆友教授
专业：生物学
学科门类：理学
重庆大学生命科学学院
二O一三年四月
Cloning and Functional Analysis of Carotenoid Cleavage Dioxygenase Gene in
Nicotiana tabacum
A Thesis Submitted to Chongqing University
in Partial Fulfillment of the Requirement for the
Master‘s Degree of Science
By
Gao Junping
Supervised by Prof. Xia Qingyou
Specialty：Biology
College of Life Science of
Chongqing University , Chongqing, China
April 2013
中文摘要
摘要
类胡萝卜素（Carotenoid）是烟草中一种重要的萜烯类化合物。

新鲜烟叶中的类胡萝卜素主要有叶黄素、新黄质、紫黄质和β-胡萝卜素，它们在烟草的生长、烤制和调制过程中起着重要的作用，其含量不仅与烟叶的光泽、色泽相关，也影响着烟叶的香味品质。

类胡萝卜素裂解的产物是烟叶致香的重要成分，包括紫罗兰酮、大马酮等，这些物质香味阈值很低、刺激性小、对香味贡献比较大。

类胡萝卜素双加氧裂解酶（Carotenoid cleavage dioxygenases，CCDs）是一类能在不同双键处裂解植物中不同类胡萝卜素的酶，产物为脱辅基类胡萝卜素。

这些物质有些参与植物的生长发育过程的调节，如脱落酸和独脚金内酯；有些是花和果实颜色、风味及香味成分，如具有经济价值的红木素、藏红花苷，阈值很低的香味成分β-紫罗兰酮、香叶基丙酮等。

CCDs是一个古老的基因家族，目前发现有九个成员，活性区域具有很强的保守性，其中CCD1主要作用于类胡萝卜素的9-10/9‘-10‘ 、C5-C6 ⁄C5‘-C6‘和C7-C8 ⁄C7‘-C8‘双键处，分别生成C13β-ionone、C8 6-methyl-5-hepten-2-one和C10 geranial。

本文以栽培烟草品种沙姆逊（Samsun）为材料克隆NtCCD1和NtCCD4基因，并对其序列和功能进行分析研究，结果如下：
（1）烟草中有两个NtCCD1（NtCCD1A和NtCCD1B）基因和一个NtCCD4基因。

多序列比对表明NtCCD1和NtCCD4蛋白含有多个保守域和实现功能必须的4个组氨酸，它们都是水溶性蛋白。

NtCCD1催化生物反应的场所在细胞质，NtCCD4定位在质体上。

三维结构预测表明目的蛋白由4个α螺旋，30个β折叠片以及一些无规则卷曲组成，预测结果与玉米VP14蛋白的三维结构相似。

qRT-PCR 检测烟草不同组织中NtCCD1和NtCCD4的表达情况，结果表明除了NtCCD1B基因，NtCCD1A基因和NtCCD4基因在根、茎、叶和花中均有表达，NtCCD4在叶中的表达量最高，其次是花中；NtCCD1A在叶和花中的表达量比较高，然而NtCCD1B在根中几乎不表达。

（2）构建NtCCD1基因的原核表达载体，诱导后能够表达可溶性的融合蛋白，大小为80KDa左右。

在通过基因工程技术改造能合成番茄红素、β-胡萝卜素和玉米黄素的菌株中诱导NtCCD1蛋白表达，与对照比较，菌体的颜色放生了明显的变化，浅红色、黄色和浅黄色消失或变淡，说明NtCCD1蛋白能裂解番茄红素、β-胡萝卜素和玉米黄素。

提取诱导目的基因表达后合成β-胡萝卜素的菌体中色素，用HPLC测定峰值，β-胡萝卜素消失，进一步说明了NtCCD1的裂解功能。

（3）采用农杆菌介导方法转化烟草，得到T0代转基因苗，收获种子并获得
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T1代幼苗，通过qRT-PCR验证获得3株NtCCD1A和5株NtCCD1B转基因苗，测定烟叶中的胡萝卜素、叶黄素和类胡萝卜素总含量，与对照相比，超表达植株中的类胡萝卜素在个别植株中显著下降，但是也有含量显著升高的植株，说明NtCCD1表达量会引起体内类胡萝卜素的变化，但是这种变化取决于基因的表达量，过低或者过高的增量表达所导致的结果不同，并没有和表达量呈一定规律。

关键词：烟草，CCDs，类胡萝卜素，功能研究
英文摘要
ABSTRACT
Carotenoid is one class of important terpenoids in tobacco, mainly including the lutein, neoxanthin, violaxanthin and β-carotene in fresh leaves. Carotenoid plays an important role in the growth of the tobacco. Especially, it is not only related with luster and color of tobacco during the process of baking and modulation, but also affects the aroma quality of tobacco. The products of carotenoid degradation in tobacco leaves are the important aroma substance, such as ionone, damascenone and so on, and have a low flavor threshold, less irritation and high fragrance.
Carotenoid cleavage dioxygenases(CCDs) are able to cleave carotenoid substrates at a variety of double bonds and the products of this class of enzymes are apocarotenoid, involved with the regulation of growth and development in plants, such as abscisic acid and strigalactone, and also associated with the aromatic components of flowers, and color, flavor and aroma of fruits, such as the b ixin, crocin, β-ionone, geranylacetone with high economic value, and so Ds is an ancient gene family with nine members currently, the active region of which is highly conserved. The CCD1 can cleave double bonds of carotenoid, located at 9-10/9‘-10‘, C5-C6⁄C5‘-C6‘, C7-C8⁄C7‘-C8‘, and produce C13β-ionone, C86-methyl-5-hepten-2-one and C10 geranial individually.
Here, the CCDs genes were isolated from Samsun which is one kind of cultivated tobaccos. The sequences and genic functions were analysed. The results are as following:
(1) Two NtCCD1genes and one NtCCD4gene were abtained from tobacco, and the proteins of NtCCD1 and NtCCD4have numerous conserved domains and the 4 histidine residues which are necessary for composing the functional domain and constructing the active center. NtCCD1 and NtCCD4 are stable and hydrophilic proteins. NtCCD1 and NtCCD4 are located on cytoplasm and chloroplast membrane individually, composing of 4 alpha helix, 30 beta pleated sheet and random coil by prediction of three-dimensional structure. The predicted results show that they have the similar 3D structures with maize VP14 protein (a key enzyme in the synthesis of plant hormones ABA). The expression patterns of NtCCD1and NtCCD4were examined in various tobacco organs by real-time PCR. NtCCD1A and NtCCD4 were detected in all organs, but NtCCD4 had the highest level in leaf. The expression level of NtCCD1A is higher in
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leaf and flower, but NtCCD1B was detected all organs except root.
(2) Prokaryotic expression vector of NtCCD1 gene was structured and induced to express about 80KDa soluble fusion protein. Expressing recombinant NtCCD1A and NtCCD1B proteins in strains of E. coli that were previously engineered to accumulate different carotenoid compounds(l ycopene, β-carotene and zeaxanthin) imparts color upon the cells and a loss of color. It indicates that the carotenoids are metabolized to colorless compounds. The β-carotene in strain after the NtCCD1 protein was expressed is less by HPLC detection and we confirm NtCCD1 can cleave β-carotene.
(3)We got resistant seedlings by Agrobacterium-mediated methods and harvested seeds of T1. Three NtCCD1A and five NtCCD1B positive transgenic individuals were identified by PCR and qRT-PCR. By determination of the contents of carotene, lutein and carotenoid in transgenic tobacco, there are significant changes between transgenic and wild tobacco. Different overexpressions of NtCCD1 caused the different changes of pigment content. Overexpressing NtCCD1 gene can lead to the changes of carotenoid, but the verity depends on the expression level of gene. Too low or too high expression of NtCCD1 caused the different results according to contents of carotenoid, and there are no certain rules between the expression level and contents of the pigment.
Keywords: tobacco, CCDs, carotenoid, functional research
目录
目录
中文摘要 (I)
英文摘要 (III)
目录 (V)
英文缩写词表............................................................................................................................ I X 1 绪论 . (1)
1.1 类胡萝卜素概述 (1)
1.1.1 类胡萝卜素的结构和主要类型 (1)
1.1.2 类胡萝卜素的性质和作用 (2)
1.2高等植物中类胡萝卜素的生物合成 (2)
1.3 脱辅基类胡萝卜素 (6)
1.4类胡萝卜素双加氧裂解酶（CCD S） (7)
1.4.1 CCDs的生化特性 (8)
1.4.2 CCDs的生理特性 (9)
1.5 烟草类胡萝卜素研究进展 (14)
1.5.1 烟草中的类胡萝卜素 (14)
1.5.2 类胡萝卜素及其裂解产物对烟草品质的影响 (14)
1.5.3 烟草类胡萝卜素研究展望 (15)
1.6 课题意义、内容和技术路线 (16)
1.6.1 课题意义 (16)
1.6.2 研究内容 (17)
1.6.3 技术路线 (17)
2 烟草CCD S基因的克隆和表达研究 (19)
2.1 实验材料与试剂 (19)
2.1.1材料、菌株、载体和试剂 (19)
2.1.2 主要仪器设备 (19)
2.1.3 常用试剂的配置 (19)
2.2 实验方法 (20)
2.2.1 实验材料的种植和采集 (20)
2.2.2 烟草CCDs基因引物的设计 (20)
2.2.3烟草组织总RNA的提取 (20)
2.2.4单链cDNA的合成 (20)
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2.2.5 烟草CCD1和CCD4基因的扩增 (21)
2.2.6 PCR产物的纯化 (21)
2.2.7 PCR产物的连接 (21)
2.2.8 连接产物的转化 (21)
2.2.9 阳性克隆的挑取和检测 (21)
2.2.10 测序 (22)
2.2.11 序列分析 (22)
2.2.12 烟草CCDs基因的组织特异表达分析 (22)
2.3结果与分析 (22)
2.3.1 烟草CCDs基因的克隆 (23)
2.3.2 不同物种CCDs同源蛋白的进化分析与多序列比对 (24)
2.3.3 烟草CCD1和CCD4蛋白的氨基酸疏水/亲水性分析 (26)
2.3.4 烟草CCD1和CCD4蛋白信号肽的预测 (26)
2.3.5 烟草CCD1和CCD4蛋白导肽的预测 (27)
2.3.6烟草CCD1和CCD4蛋白三维空间结构的预测 (28)
2.3.7 烟草CCD1和CCD4组织表达分析 (29)
2.3讨论 (30)
2.3.1 烟草CCDs的克隆与信息学分析 (30)
2.3.2 烟草CCDs的组织表达分析 (30)
3 烟草CCD1基因功能的互补验证 (33)
3.1 实验材料和试剂 (33)
3.1.1菌株、载体和试剂 (33)
3.1.2 主要仪器 (33)
3.1.3 主要试剂配制 (33)
3.2 实验方法 (35)
3.2.1 NtCCD1A和NtCCD1B原核表达载体的构建 (35)
3.2.2 质粒转化 (37)
3.2.3 感受态细胞的制备 (38)
3.2.4 表达载体转化 (38)
3.2.5 蛋白诱导表达 (38)
3.2.6 SDS-PAGE电泳检测 (39)
3.2.7 考马斯亮蓝染色 (40)
3.2.8 蛋白表达形式的鉴定 (40)
3.2.9 细菌中色素提取 (40)
目录
3.2.10 HPLC色谱分析条件 (40)
3.3 结果与分析 (41)
3.3.1 NtCCD1A和NtCCD1B基因原核表达载体的构建 (41)
3.3.2 重组质粒诱导表达与表达形式鉴定 (43)
3.3.3 NtCCD1A和NtCCD1B蛋白功能的互补验证 (44)
3.3.4 类胡萝卜素的测定 (46)
3.4 讨论 (46)
3.4.1 蛋白表达 (46)
3.4.2 NtCCD1分解类胡萝卜素 (47)
4 烟草CCD1基因植物表达载体构建与功能研究 (49)
4.1 实验材料和试剂 (49)
4.1.1 菌株、载体和试剂 (49)
4.1.2 主要仪器 (49)
4.1.3 主要试剂配置 (50)
4.2 实验方法 (51)
4.2.1 引物设计 (51)
4.2.2 植物表达载体构建 (51)
4.2.3 农杆菌感受态的制备 (54)
4.2.4 载体电转农杆菌 (55)
4.2.5 叶盘法转化烟草 (55)
4.2.6 转基因烟草的PCR检测 (56)
4.2.7 转基因烟草中目的基因表达检测 (56)
4.2.8 类胡萝卜素的测定 (56)
4.3 实验结果 (57)
4.3.1 植物表达载体构建 (57)
4.3.2 表达载体转化农杆菌 (61)
4.3.3 转基因植物的获得 (62)
4.3.4 转基因烟草植株的阳性检测 (62)
4.3.5 类胡萝卜素含量的测定 (64)
4.4 讨论 (65)
5 结论与展望 (67)
5.1 主要结论 (67)
5.2 后续研究工作展望 (67)
致谢 (69)
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参考文献 (71)
附录 (81)
A．作者在攻读硕士期间发表的论文 (81)
B．MS植物组织培养基配方 (81)
英文缩写词表
英文缩写词表
英文缩写英文全称中文全称
NAA α-Naphthaleneacetic acid α-萘乙酸
6-BA 6-Benzylaminopurine 6-苄氨基嘌呤
X-gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside 5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳
糖苷
IPTG Isopropyl β-D-1-Thiogalactopyranoside 异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷Str Streptomycin 链霉素
Amp Ampicillin 氨苄青霉素
Kana Kanamycin 硫酸卡那霉素
Rif Rifampicin 利福平
Cef Cefradine 头孢霉素
Spe Spectinomycin 壮观霉素
Nt Nicotiana tabacum烟草
bp base pair 碱基对
KDa Kilodalton 千道尔顿
SDS Sodium dodecyl sulfate 十二烷基硫酸钠
PCR Polymerase chain reaction 聚合酶链式反应
qRT-PCR Real-time PCR 实时荧光定量PCR
MS Murashige and Skoog basal medium Murashige 和Skoog 培养基LB Luria-Bertani medium Luria-Bertani培养基
Tris Trishydroxymethylaminomethane 三羟基氨基甲烷
HPLC High Performance Liquid Chromatography 高效液相色谱法
NCBI National Center for Biotechnology Information 美国国家生物信息中心CCDs Carotenoid cleavage dioxygenases 类胡萝卜素双加氧裂解酶DTT Dithiothreitol 二硫苏糖醇
PMSF Phenylmethanesulfonyl fluoride 苯甲基磺酰氟
rpm revolutions per minute 每分钟转数
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1 绪论
1 绪论
1.1 类胡萝卜素概述
1.1.1 类胡萝卜素的结构和主要类型
类胡萝卜素（Carotenoids）是一种脂溶性的异戊二烯化合物，一般是由八个异戊二烯单位以分子中心点对称形成的共轭双键系统作为基本骨架形成的多烯类化合物（其结构通式如图1.1），目前发现的有700多种结构[1-4]。

大部分的类胡萝卜素来源于四萜八氢番茄红素（phytoene），一些特殊的细菌能通过不同的中间产物合成C30和C50的类胡萝卜素。

链状的八氢番茄红素通过一系列的脱氢、氧化、羟化和环化反应生成有颜色的色素，红色的番茄红素（lycopene）就是在八氢番茄红素中引入13个双键而形成的，图1.2中列举出一些主要结构的类胡萝卜素。

在自然界中，大多数的类胡萝卜素含有通过共轭双键生色基团连接的末端环状系统，包括简单的碳氢化合物类胡萝卜素（如β-类胡萝卜素和β,β-类胡萝卜素）和末端环羟化的黄色素（如玉米黄素和叶黄素），以及末端环上羟基的氧化生成的虾青素（astaxanthin）和角黄素（canthaxanthin），然而芳香环和单环的类胡萝卜素在植物几乎没有合成，只有在特定海洋海绵生物[5]和酵母[6]中合成。

不同生物合成的类胡萝卜素结构已有相关的论述[7]，不同类胡萝卜素的结构可以在相关的网站上查到（http://lipidbank.jp/cgi-bin/main.cgi?id%BCVCA）。

图1.1 类胡萝卜素的结构通式
Fig. 1.1 The structural formula of carotenoids
番茄红素（lycopene）
α-类胡萝卜素（α-carotene）
β-类胡萝卜素（β-carotene）
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玉米黄质（zeaxanthin）
叶黄素（lutein）
图1.2 几种常见的类胡萝卜素
Fig. The structural formulas of common carotenoids
1.1.2 类胡萝卜素的性质和作用
通常具有光合作用的生物才能合成类胡萝卜素，但是一些非光合生物(除了动物)也能合成。

类胡萝卜素起初出现在远古生物中，作为酯类分子增强细胞膜的强度，这与它结构中的共轭双键骨架有关。

如今包括古细菌和真细菌，真核生物（植物、藻类和真菌）都能合成类胡萝卜素，行使不同的功能。

类胡萝卜素结构中的多聚链吸收450-570nm范围内的波长，处于叶绿素吸收波长的间隙，因此类胡萝卜素在光合作用中是一种必需的色素。

在参加光合作用的组织中其含量是相对稳定的，叶黄素占总类胡萝卜素的45%左右，β-胡萝卜素占25-30%，堇菜黄素占10-15%，新黄素占10-15%[8]。

类胡萝卜素含有多个双键，吸收激发态的单线态氧将能量转移到类胡萝卜素，从而使单线态氧回到基态，是一种很好的淬灭剂[9-11]。

类胡萝卜素的共轭双键程度影响生色基团进而影响色素颜色，进而调节光捕获、光保护和感光性能，研究表明9-11双键最适合进行光捕获[12]。

一些特别的变形菌、古细菌和真菌，通过裂解β-类胡萝卜素和其它类胡萝卜素生成的C20的脱辅基类胡萝卜素视黄醛作为营养物质[3]。

在植物中，类胡萝卜素通过花的颜色吸引授粉和种子传播实现生态角色。

然而在整个生物王国中，类胡萝卜素普遍且重要的功能是它的光保护和抗氧化性能。

类胡萝卜素还是一些植物激素的前体，比如生长激素ABA，独脚金内酯[13-18]。

独脚金内酯是近年新发现的一类植物激素，其作用是抑制侧枝的发育和促进真菌和根的共生[13, 18, 19]。

因此，类胡萝卜素是一种很重要的色素，参与调节植物的光合作用和生长发育过程，对类胡萝卜素的相关研究一直是热点。

1.2高等植物中类胡萝卜素的生物合成
在植物中，类胡萝卜素由通过细胞核基因编码酶在质体中催化合成，也有研究表明绿藻Haematococcus pluvialis在合成酮基类胡萝卜素虾青素的最后一步发生在细胞质脂质囊泡上[20]。

和其它的异戊二烯类物质一样，类胡萝卜素合成起始于5
1 绪论
个碳原子单元焦磷酸异戊烯（IPP）和二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）参与的4-磷酸甲基赤藓醇（MEP）途径合成牦牛儿牦牛儿焦磷酸(GGDP)[21]，两分子的GGDP 通过八氢番茄红素合酶生成第一个类胡萝卜素八氢番茄红素（图 1.3），在经过一系列的脱氢、氧化、酮化和羟化后生成不同的类胡萝卜素。

MEP途径一共包括7个步骤，参与第一步反应的酶是1-脱氧-D-木酮糖-5 磷酸合酶（DXS），目前已经从辣椒[22]、番茄[23]、玉米[24]和拟南芥[25]等植物中克隆到这个基因，并对其进行深入的研究，发现它是MEP途径中的限速酶[26]，不同植物中的拷贝数不同。

在MEP 途径中，科学家对DXS研究的比较清楚，然而对其它参与MEP途径的基因拷贝数及其在此途径的作用了解有限[21, 27]。

1-脱氧-D-木酮糖-5 磷酸还原异构酶（DXR）和4-焦磷酸-2甲基赤藓醇合酶（MCT）分别参与第二和第三步反应，用DXR的抑制剂霉素处理番茄幼苗和果实，结果完全抑制苗的生长和果实中类胡萝卜素的合成，但是没有影响与果实成熟相关的其它过程[23]。

拟南芥突变株（clb6）的最后一步反应影响4-羟基-3甲基-2己烯焦磷酸还原酶（HDR）的活性，表明在MEP 途径中存在转录后的反馈调节机制[28]。

HDR催化IPP到DMAPP生物合成过程，除了HDR外还有一个酶（IDIs）也行使相同的功能，在这两个异构体之间进行转化，调节其摩尔比。

这个过程对在细胞质中的MVA途径非常重要，为其提供C5前体IPP，因此异戊烯焦磷酸异构酶（IDIs）在质体、线粒体和细胞质中参与异构化过程。

在拟南芥中，IDI1蛋白定位在质体上，IDI2蛋白定位在线粒体上，没有转运肽的IDI蛋白在细胞质中[29]。

下一步为类胡萝卜素合成提供骨架的是C5单元，IPP在DMAPP、GPP或者FPP为牵引下，经过GGPP合酶（GGPPS）的催化下缩合成C20的单元，GGPPS 也为一些非类胡萝卜素异戊二烯产物合成提供C20的结构单元，如植物激素赤霉素、维生素E和大量的二萜类物质等。

从C20的前体到八氢番茄红素（PSY）的生成在整个反应链上是协同调节的过程，包括前体的形成，它们转化成C40的骨架以及进一步的修饰。

在这些协同的过程中，代谢通道是否是一个有效机制仍然需要研究。

高等生物已经进化出几种GGPPS异构体，分别定为在不同的亚细胞区域。

在拟南芥的基因组中已经鉴定出12个可能的GGPPS[30]，通过分析其中的5个，有两个定位在质体上[31]。

在番茄中也有类似的情况，GGPPS1主要在叶中表达，蜘蛛螨寄生虫和茉莉酸甲酯也能诱导其表达，然而GGPPS2在果实和花中强烈表达[32]。

在辣椒的果实中，质体上的GGPPS表达水平很高，其氨基酸序列和番茄的GGPPS2同源性很高。

在玉米中，质体上3个GGPPS异构体中的GGPPS1与胚乳中的类胡萝卜素的含量成正比，GGPPS3的重组蛋白没有活性[33]。

总之，与类胡萝卜素合成相关的GGPP合酶异构体通过调节MEP途径来为类胡萝卜素的合成提供充足的单个或者组合的C5单元。

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图1.3 植物中类胡萝卜素的生物合成途径和脱辅基类胡萝卜素的生成
Fig. 1.3Carotenoid pathway and apocarotenoids formation
两分子的GGPP在PSY合酶的催化下合成C40的八氢番茄红素（PSY）。

在类胡萝卜素的合成途径中，PSY是最好研究的酶，和DXS一样是该途径中的限速酶，作为主要瓶颈控制着碳通量进入到类胡萝卜素[34-36]。

通过分析番茄的第一个与果实成熟相关的cDNAs，证明其编码PSY1,突变体psy1的果实几乎完全没有类胡萝卜素并表现出浅黄色的花，但是叶片中的类胡萝卜素和叶绿素没有受到影响[37]。

在番茄PSY1的基础上，科学家也鉴定出了PSY2，在成熟叶片中的表达很显著[38]。

通过qRT-PCR技术进一步对番茄中的PSY同源基因进行研究，发现PSY2在所有的组织中都有表达，尤其是在黄色的花瓣总表达量最高，PSY1在叶片中的表达很低，花瓣中有适量的表达，然而在果实的粉红色到红色成熟阶段的表达量非常高[39]。

许多植物含有几个PSY基因，但是在拟南芥中只有一个。

1 绪论
八氢番茄红素（PSY）通过一系列的饱和和异构化反应生成全反式的番茄红素（lycopene），参与这个过程的有八氢番茄红素脱氢酶（PDS）、ζ-胡萝卜素异构酶（Z-ISO）、ζ-胡萝卜素脱氢酶（ZDS）和胡萝卜素异构酶（CRTISO）[40-43]。

在光敏色素介导的光的形态建成途径中，PDS作为一个限速的角色控制9,15,9‘-三烯-顺式-ζ-胡萝卜素的少量上调[44]。

研究表明，八氢番茄红素的积累对代谢途径有负向反馈调节[45]，比如在pds3突变体中，下游的ZDS和番茄红素环化酶（LCY）以及上游的IPI、GGPS和PSY表达下调。

关于ZDS和Z-ISO在催化ζ-胡萝卜素过程中的调节作用还没有相关的报道。

在随后的反应中，番茄红素（lycopene）通过两个番茄红素环化酶（ε-LCY和β-LCY）的催化生成ε-类胡萝卜素（ε-carotenoid）和β-类胡萝卜素（β-carotene），这两个酶决定类胡萝卜素（carotenoids）和黄色素（xanthophylls）的含量，尤其是叶黄素（lutein）与β-胡萝卜素（β-carotene）和玉米黄素（zeaxanthin）的比例。

在拟南芥中，ε-LCY和β-LCY是单拷贝基因，它们两个的主要区别是ε-LCY能生成一个环，β-LCY生成两个环[46]。

在番茄中，有两个β-LCY基因，β-LCY1在绿色的组织和花中活性很高，但是在果实成熟时它的转录水平下降[47]。

β-LCY2是色素细胞上特有的，它和β-LCY1的氨基酸序列相似度仅为53%，与辣椒中的辣椒红素合酶（CCS）相似[48]。

β-LCY2在β突变体中的表达很高，然而在野生型的番茄的成熟开始期它的表达很低。

在番茄的橙色果实的突变中，积累单环的δ-胡萝卜素（δ-carotene），这种表型可能与ε-LCY在果实成熟时表达量增加了30倍有关，但是在野生型的植株中，没有发现其转录水平的下降[49]。

番茄的ε-LCY与β-LCY1蛋白序列的相似度为36%，但是和拟南芥的相似度达到71%。

在正常的番茄中，番茄红素的积累归因于果实中ε-LCY和β-LCY的少量甚至完全不表达，然而在叶片和花瓣中却有转录和表达。

环状的胡萝卜素经过两种不同羟化酶作用于3C和3C‘位置，一个作用于β-环，另一个作用于ε-环[50]，β-羟化酶作用的发挥需要铁氧还蛋白和离子，其作用机理是利用离子去激活氧来氧化碳水化合物[51]。

β-胡萝卜素经过一系列酶作用后生成β-隐黄素（β-cryptoxanthin），然后在转变成玉米黄素（zeaxanthin）。

拟南芥[52]和番茄[53]中各有两个β-胡萝卜素羟化酶，番茄中的一个在绿色组织中表达，另外一个在花中表达。

ZEP通过环化3-羟基-β-环的5,6位置把玉米黄素(zeaxanthin)转化成堇菜黄素（violaxanthin），在这个氧化还原反应中需要铁氧还蛋白、NADPH和FAD[54]。

在过度的光照下，堇菜黄素在脱环化酶（VDE）脱环化后经中间产物环氧玉米黄素（antheraxanthin）转化成玉米黄素（zeaxanthin）。

这些物质的相互转变作用实现了光吸收状态和消散状态的可逆转变。

第一个ZEP cDNA是从缺少ABA合成的烟草（Nicotiana plumbaginifolia）突变体（aba2）中克隆的，通过对拟南芥突变体ZEP（npq2）和VDE（npq1）的研究，发现它们能决定光合作用中能量的转变[55, 56]。

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VDE首先在莴苣中克隆到，现已证明此酶能催化从堇菜黄素（violaxanthin）到玉米黄素（zeaxanthin）的两步环化反应[57]。

ZEP和VDE分布在类囊体膜相反的两面，到目前为止，还没有关于他们异构体的报道[58]。

叶黄素及其环化产物通常和β-胡萝卜素同时存在非光合作用的组织中，比如花瓣，然而不同的植物具有许多独特的成分。

万寿菊(Tagetes erecta)的花瓣中积累大量的叶黄素，然而在菊花(Chrysanthemum morifolium)的花瓣中含有许多叶黄素环化产物以及其他的衍生物[59]。

番茄的花瓣中主要含有新叶黄素（neoxanthin）和堇菜黄素（violaxantina）[60]。

1.3 脱辅基类胡萝卜素
类胡萝卜素降解可以通过非具体的化学氧化作用（包括光、热等）以及酶的催化作用（脂质氧化酶、超氧化酶等），但是具体的作用机制还不是很清楚[61]，其裂解的产物称为脱辅基类胡萝卜素（apocarotenoid）。

脱辅基类胡萝卜素广泛存在于生物体中并对其生长发育发挥着重要的生物功能。

在动物体中，视黄荃的功能是作为维生素、视觉色素和信号分子。

视黄荃是裂解酶在β-类胡萝卜素15,15‘双键处裂解生成的，是视紫红质的生色基团[62]。

视紫红质是一个七次跨膜的蛋白，在微生物中起着光传递和趋光信号，组成动物体内不同的光传导系统。

视黄荃的衍生物视黄醇（维生素A）和维甲酸在动物发育过程中具有重要的神经和信号功能。

植物中，脱辅基类胡萝卜素作为植物的激素、色素、风味、香味和防御成分扮演着重要的作用。

许多不同的脱辅基类胡萝卜素来源于类胡萝卜素的裂解，植物中研究最为深入的是C15的激素脱落酸ABA，它是由9-顺式-紫黄质和9-顺式-新黄质11,12‘位置的双键裂解生成的，在胁迫和种子的脱水条件下ABA的水平上调，裂解反应是其合成的限速步骤[63]。

现在对ABA的研究主要在对它的认识、信号传导以及病害抵抗方面[64]。

过去的七年中，科学家对一系列突变体的研究发现了一种新的脱辅基类胡萝卜素植物激素独脚金内酯，它能增加茎的分枝。

通过分析拟南芥和豌豆突变体max4和rms1[65]，发现其缺陷和两个不同的CCDs型的基因表现出相同的功能，现在命名为CCD7和CCD8。

同时证明矮牵牛中的MAX4、RMS1和DAD1以及水稻中的D10编码的蛋白属于CCDs家族中的CCD8；MAX3、RMS5、D171、HTD1和DAD3属于CCD7[66]。

这个基因的功能主要是增加茎的分枝和表现出一些矮化性状，比如许多的腋芽分枝、多枝条、矮化和降低顶端优势[67,68]。

脱辅基类胡萝卜素除了作为激素对植物生长发育过程中起着重要的作用，也是果实和花的风味和色素成分。

C10和C13的脱辅基类胡萝卜素具有强烈的气味，风味和香味成分。

C10和C20的合成是非常严格的[69]，挥发性成分C13的脱辅基类胡萝卜素形成伴随着C14部分的并发，这个反应时普遍发生的。

对于包含9-13个
碳原子的风味和香味成分，类胡萝卜素的的生物降解被认为是一个重要的途径，然而也有不同的看法，化学降解过程也可以生成相关的成分[70]。

许多有名的香味成分（β-紫罗兰酮、α-紫罗兰酮、β-大马酮等）具有很低的香味阈值，这是C13脱辅基类胡萝卜素的优势。

植物体内也含有脱辅基类胡萝卜素色素，其表现出的颜色依赖于足够长的共轭双键系统，比如单环的C30和C27脱辅基类胡萝卜素，后者在山楂的根中含量丰富。

一种澳大利亚植物香蜜儿的花表现出橘红色，通过研究花的丙酮提取物中类胡萝卜素的含量，发现含有几种C27的衍生物，其中一种是C27的棕榈酸酯。

另一种具有商业价值的双脱辅基类胡萝卜素色素是藏红花素，它是C20的二元羧酸藏红花酸的糖脂，藏红花酸是酶裂解玉米黄质的7-8/7‘-8‘双键生成的。

总之，类胡萝卜素的裂解产物脱辅基类胡萝卜素在动物、植物和微生物的生长过程中发挥着重要的作用，参与植物的抗逆、生长发育、园艺性状等。

植物和微生物中的一些脱辅基类胡萝卜素成分具有重要的商业价值，可以作为医药、化妆品以及食品添加剂。

1.4类胡萝卜素双加氧裂解酶（CCDs）
类胡萝卜素双加氧裂解酶（CCDs）氧化裂解类胡萝卜素生成脱辅基类胡萝卜素产物，CCDs酶通常表现出底物的广泛性，在自然界中能找到不同种类的脱辅基类胡萝卜素。

化学、热和酶促过程能非特异性裂解类胡萝卜素，但是CCDs的裂解具有特异性，作用于特定的双键位置（图1.3）。

在植物CCDs家族中，玉米的VIVIPAROUS14（VP14）是第一个被发现和研究的酶[71,72]。

通过分析ABA缺陷的玉米种子而克隆到VP14基因，酶活检测表明VP14能裂解9-顺式-环氧类胡萝卜素（9-cis-epoxycarotenoids），这是植物中合成ABA的第一步反应[72]。

拟南芥测序结果出来后，通过与VP14基因序列比较分析发现了拟南芥中CCDs基因。

CCDs基因家族包括9个成员，所有的这些基因编码的蛋白能够氧化裂解类胡萝卜素，其中的5个基因和通过裂解9-顺式-环氧类胡萝卜素（9-cis-epoxycarotenoids）参与ABA的合成[73]，这些亚家族的基因被命名为9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶（9-cis-epoxycarotenoid dioxygenases ，NCEDs)基因，包括NCED2、NCED3、NCED5、NCED6和NCED9。

剩余的四个基因命名为CCD：CCD7和CCD8与信号分子独脚金内酯的合成有关，CCD1和CCD4编码的酶具有广泛的裂解底物，产生一些挥发性的降碳异戊二烯化合物（norisoprenoids）[74]。

随着对类胡萝卜素合成代谢工程的深入研究，通过发现和应用CCDs基因催化特殊的反应形成目的脱辅基类胡萝卜素产物，然而在通过类胡萝卜素工程生产脱辅基类胡萝卜素的过程中却遇到了很多困难，包括关于控制。