ANCA荧光判读与讲解

cANCA
pANCA
cANCA pANCA
EUROIMMUN
二、检测方法学选择上的问题
仅RP3和MPO
单基质/两基质片， 未排除ANA干扰
降低疾病特异性 临床应用范围受限
假阳性
给临床信息少
国内ANCA临床常规检测存在的问题
EUROIMMUN
ANCA检测方法的合理选择
l 两种方法联合使用，可提高ANCA临床应用价值 原发性系统性小血管炎患者约5%IIFT阴性而ELISA阳性
5-10%
EUROIMMUN
注意区分ANA对荧光模型的干扰
ANA homogen Nuclear dots Centromere ANA nucleolar
Scl-70
Sm/RNP
SS-A/SS-B
Nuclear memb. Ribosomes Mitochondria Golgi apparat. Lysosomes
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结果的解释（2）
IFT为C-ANCA，靶抗原为MPO
样本稀释后实验结果：IFT为强C-ANCA+弱pANCA 靶抗原结果为：弱MPO + 强BPI
提醒： 强C-ANCA有时会掩盖弱pANCA; ANCA的靶抗原检测多数医院还是很 有局限
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ANCA谱 ELISA-可同时检测6种靶抗原
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ANCA(抗中性粒细胞胞浆抗体)
ANCA=Anti-Neutrophil Cytoplasm Autoantibodies
中性粒细胞结构： 细胞直径10-12um，核呈 深染的弯曲杆状（马蹄铁 形）或分叶状，分叶核一 般为2~5叶，叶间有前戏 的缩窄部相连。
EUROIMMUN
ANCA(抗中性粒细胞胞浆抗体)
pANCA（甲醛敏感）
1
4
粒细胞 (乙醇固定)
猴肝
2
3
粒细胞 (甲醛固定)
EUROIMMHUNEp-2 cells
pANCA: 靶抗原
髓过氧化物酶(MPO; 甲醛固定;甲醛抗性) 乳铁蛋白 弹性蛋白酶 组织蛋白酶G（甲醛敏感） 杀菌性/通透性增强蛋白(BPI; CAP57) -烯醇化酶 -葡萄糖醛酸酶 溶菌酶 Azurocidine (CAP37) ...
猴肝
2
3
粒细胞 (甲醛固定)
EUROIMMHUNEp-2 cells
1
4
粒细胞 (乙醇A固N定A) 干扰
猴肝
2
ANCA阴3性
粒细胞 (甲醛固定)
EUROIMMUN HEp-2 细胞
1
4
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
粒细胞 (乙醇固定阴) 性
猴肝
2
3
粒细胞 (甲醛固定)
EEUROIMHMMUEUNNp-2 细胞
1
4
粒细胞 (乙醇固甲定)醛抗性
EUROIMMUN
cANCA: 相关疾病
韦格纳肉芽肿（WG） - 典型的WG：可逐渐发展成为肾小球肾炎 - 局限性的WG：可不累及肾小球
>90% 70%
显微镜下多动脉炎（MPA）
up to 30%
变应性肉芽肿性血管炎（Churg-Strauss 综合征）
10-20%
结节性多动脉炎(PAN)
ANCA荧光判读与讲解
ANCA临床意义(1)：原发性系统性小血管炎
相关疾病
IIF染色型 特异性靶抗原抗体
韦格纳氏肉芽肿(WG)
c, p(少见) PR3(85%),MPO(10%)
显微型多动脉炎(MPA) 坏死性新月体肾小球肾炎 （NCGN） 过敏性肉芽肿性血管炎(CSS) 结节性多动脉炎(PAN) 抗肾小球基底膜疾病 （抗GBM病）
IIFT
阴性
阳性
最优检测 最低检测
单特异性 ELISA检测
结果
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间接免疫荧光法检测ANCA ➢间接免疫荧光法是检测ANCA的经典方法
特点：敏感性高，半定量，是区分cANCA和 pANCA的基础
局限性：间接免疫荧光法测定的是总ANCA，不能 区分靶抗原，需要确认实验作为补充
EUROIMMUN
围形成p-
ANCA
甲醛的强固定作用细胞浆 中ANCA抗原如MPO不能 从嗜天青颗粒中释放，表 现为胞浆内均一的荧光染
色即c-ANCA
EUROIMMUN
ANCA筛查: 免疫荧光
粒细胞 (乙醇固定) 粒细胞 (甲醛固定)
猴肝 HEp-2
EUROIMMUN
cANCA
EUROIMMUN
ANCA判读
建议
Actin
Vimentin
EUROIMMUN
ANA + pANCA 与 ANA
粒细胞 (乙醇固定)
HEp-2 cells
粒细胞 (甲醛固定)
猴肝
ANA + pANCA
粒细胞 (甲醛固定)
ANA
猴肝 EUROIMMUN
均质型ANA的干扰
1
4
粒细胞 (乙醇固定)
猴肝
2
3
粒细胞 (甲醛固定)
EUROIMMUNHEp-2 cells
猴肝
2
pAN3 CA
粒细胞 (甲醛固定)
EEUROIMHMMUUENNp-2 细胞
1
4
粒细胞 (乙醇甲固定醛) 抗性
猴肝
2
pAN3CA
粒细胞 (甲醛固定)
EEUROIMMMUUNN HEp-2 细胞
1
4
粒细胞 (乙醇A固N定C) A阴性
猴肝
2
3
粒细胞 (甲醛固定)
EUROIMMUHNEp-2 细胞
c, p p, c(少见)
p, c(少见) 低阳性率 p
PR3(30%),MPO(70%) PR3(25%),MPO(65%)
PR3(10%),MPO(60%) PR3( 5%),MPO(15%) MPO(30%)
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ANCA临床意义(2)：IBD/ALD/CTD
相关疾病
IIF染色型 特异性靶 抗原抗体
a, p
病毒(HIV感染)
a, p
真菌(着色真菌病)
a, p
原虫(急性疟疾、侵袭性阿米巴感染) a, p
特异性靶抗原抗体
MPO （常见） LF,HEL MPO,LF,HEL,BPI,其它
BPI（91%） BPI，其它 BPI，其它
BPI，CG，其它 不明 不明 CG，EUPRORIM3MUN
ANCA检测方法及检测指标
炎症性肠病
溃疡性结肠炎(UC, 60-80%)
p, a
BPI , lamina ？其它
克罗恩病(Crohn’s病, 10-20%)
p, a
BPI, lamina ？其它
自身免疫性肝病
原发性硬化性胆管炎(PSC, 70-88%)
p, a
actin BPI ,其它
原发性胆汁性肝硬化(PBC, 3-18%)
EUROIMMUN
ANCA IIF法检测的影响因素-ANA
l 据国内外报道，采用IIF在SLE中检测ANCA，阳性率差异很大， 16%-69%，主要为pANCA 仅采用乙醇片判断，ANA干扰大
l 据欧蒙检测数据，SLE中单独采用乙醇固定抗原片检测ANCA，由于 ANA干扰可产生31.2%的假阳性结果，主要为均质型的ANA（占77.8%）
读片顺序：
粒细胞 (乙醇固定)
判读
基质
粒细胞 (乙醇固定) GRANULOC.EOH 粒细胞 (甲醛固定) GRANULOC.HCHO HEP-2
猴肝 HEPAR PRIM
cANCA
粒细胞 (甲醛固定)
HEP-2
提示
1）ANCA阴阳性 2）cANCA 或 pANCA 1）cANCA：进一步提示是否 2）pANCA：甲醛敏感型或抗性
l 推荐：IIF法检测ANCA提倡应用组合抗原片（甲醛固定片、乙醇固 定片、Hep-2细胞片等），综和判断结果，避免ANA干扰，提高 ANCA临床应用价值
EUROIMMUN
三、ANCA的定量或半定量检测的选择
l 需求：抗PR3及MPO抗体滴度与病情活动一致→疗效判断、复发指标
l 特异性：低效价MPO抗体偶见于CTD患者等非血管炎患者，高滴度的 抗MPO抗体更多见于原发性小血管炎
p, a
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ANCA临床意义(3)：药物性 /感染性疾病
相关疾病
IIF染色型
药物性ANCA阳性血管炎
药物性狼疮(DIL)
p
甲状腺功能亢进(PTU治疗)
p, a
呼吸系统炎性疾病
囊性纤维化(CF)
a, p
原发性支气管扩张症
a, p
原发性支气管扩张
a, p
感染性疾病
细菌(心内膜炎、呼吸道感染)
ANCA常见问题答疑
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一、实验结果与理论知识不符
关于ANCA：
理论知识：
荧光模型 C-ANCA P-ANCA（甲醛抗性） P-ANCA（甲醛敏感）
靶抗原 PR3 MPO
Other (BPI, LF……)
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结果的解释（1）
IFT为C-ANCA，靶抗原为MPO
作者证明了抗MPO抗体成为C-ANCA的原因：抗MPO抗体为一组异质性抗体 ，其中某个亚群的靶抗原（即MPO蛋白）被与乙醇反应后不会向胞膜移动。
间接免疫荧光法检测ANCA
核周型ANCA（pANCA）
细胞核周围呈现平滑的带状荧 光，细胞核阴性
胞浆型ANCA（cANCA）
细胞浆呈现不均匀的颗粒样荧光， 有时形成小团块或粗大颗粒，核分
叶处有荧光增强
EUROIMMUN
两种ANCA荧光染色成因
无水乙醇固定 时，MPO等抗 原物质可以从 嗜天青颗粒中 释放出来，由 于电荷作用吸 附在细胞核周
l 结论：临床常规检测ANCA应报告定量或半定量检测结果。 IIF法：将血清作倍比稀释后（1:10、1:100）检测 ELISA法：应选择可定量或相对定量的检测试剂盒
EUROIMMUN
Thank you!
EUROIMMUN
教学资料整理
• 仅供参考，
欧蒙公司产品基质是从O型血的人血中提取出来的 中心粒细胞。
ANCA的靶抗原位于中心粒细胞胞浆中，ANCA 是从间接免疫荧光法中发现的。
ANCA分两种：cANCA及pANCA。
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ANCA检测方法及指标
➢ 间接免疫荧光法
➢ ELISA方法/欧蒙印迹法
ANCA检测和报告的国际公识
(Savige, van der Woude, Wiik et al., 1999)
Actin
Vimentin
EUROIMMUN
抗溶酶体抗体
1
4
粒细胞 (乙醇固定)
猴肝
2
3
粒细胞 (甲醛固定)
EUROIMMUHN Ep-2 cells
pANCA
EUROIMMUN
pANCA （甲醛抗性）
1
4
粒细胞 (乙醇固定)
猴肝
2
3
粒细胞 (甲醛固定)
EUROIMMHUHNEEpp-2-2cceelllsls
ANA阴阳性
1）ANA阴阳性 2）ANCA：粒细胞是否荧光增强
pANCA
猴肝
注意
ANA阳性 ANA阳性 辅助判读 辅助判读
EUROIMMUN
cANCA
1
4
粒细胞 (乙醇固定)
猴肝
2
3
粒细胞 (甲醛固定)
EUROIMMUNHEp-2 cells
cANCA: 靶抗原
蛋白酶3 (PR3) 杀菌性/通透性增强蛋白 (BPI; CAP57) 其它未知抗原
✓请参考上文2-4页相关疾病与其靶抗原
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pANCA: 相关疾病
原发性血管炎 （MPO） 显微镜下多动脉炎 变应性肉芽肿性血管炎
42-70% 18-60%
结缔组织病
SLE 类风湿性关节炎
9-25% 3-20%
慢性炎症性肠病
溃疡性结肠炎 克隆恩氏病
76% 7%
自身免疫性肝病
原发性硬化性胆管炎
AIH type 1 / PBC
EUROIMMUN
87%
注意区分ANA对荧光模型的干扰
ANA homogen Nuclear dots Centromere ANA nucleolar
Scl-70
Sm/RNP
SS-A/SS-B
Nuclear memb. Ribosomes Mitochondria Golgi apparat. Lysosomes
核膜型ANA的干扰
1
4
粒细胞 (乙醇固定)
猴肝
2
3
粒细胞 (甲醛固定)
EUROIMMHUNEp-2 cells
ANA + pANCA（甲醛抗性）
1
4
粒细胞 (乙醇固定)
猴肝
2
3
粒细胞 (甲醛固定)
EUROIMMHUNEp-2 cells
ANA + pANCA （甲醛敏感）
1
4
粒细胞 (乙醇固定)