不同海拔树麻雀EPO含量及心肌中有氧氧化酶活性的比较

本科生毕业论文设计
不同海拔树麻雀EPO含量
及心肌中有氧氧化酶活性的比较
作者姓名赵文璐
指导教师李东明
所在学院生命科学学院
专业（系）生物科学
班级（届） 2017届
完成日期2017 年4月21日
1.前言 (1)
2.材料与方法 (2)
2.1材料来源 (2)
2.2实验用品 (2)
2.3样本处理 (2)
2.3.1血浆样本的处理 (2)
2.3.2心肌样本的处理 (2)
2.4实验方法 (2)
2.4.1EPO含量的测定 (2)
2.4.2CS活性的测定 (3)
2.4.2.1CS 活性的测定 (3)
2.4.2.2蛋白浓度的测定 (3)
2.4.2.3CS活性的计算 (4)
3. 实验结果 (4)
3.1青海树麻雀和石家庄树麻雀血浆中EPO含量比较 (4)
3.2青海树麻雀和石家庄树麻雀心肌中CS活性比较 (4)
4. 讨论 (5)
4.1不同海拔对树麻雀心肌代谢中EPO的影响 (5)
4.2不同海拔树对麻雀心肌代谢中CS酶活性的影响 (6)
5.结论 (6)
致谢 (7)
参考文献 (7)
不同海拔树麻雀EPO含量及心肌中有氧氧化酶活性的比较
作者：赵文璐指导教师：李东明
摘要
在进化过程中，生物体会调节自身的生理机制来适应不断变化的环境。

低氧刺激和高住低训等环境的改变都会给动物的生理调控机制产生影响，产生应激反应。

但对于长期生活在高海拔或低海拔的树麻雀（Passer montanus），海拔的差异是否会影响其促红细胞生成素（Erythropoietin，EPO）的含量及心肌中有氧代谢酶的活性的研究尚不清楚。

本研究选用青海和石家庄两个不同海拔的树麻雀的血浆和心肌为实验材料，采用免疫酶联法来测定血浆中EPO的含量，用生化分析仪来测定有氧氧化关键酶柠檬酸合成酶（Citrate synthase，CS）的活性。

数据经过统计学T检验，表明海拔的不同并未对两个地区树麻雀血浆中EPO含量和心肌中CS活性产生显著性差异。

关键词：不同海拔，树麻雀，EPO，有氧氧化酶
1. 前言
生物体在进化的过程中，会采用复杂的生理调控机制来适应不断变化的环境。

很多研究对温度、季节等变化对鸟类代谢水平的影响做了分析，但对于海拔因素是如何影响鸟类代谢水平尚不清楚。

因此，国内外学者采用模拟高海拔或高原训练等方式对哺乳动物代谢的影响方向做了大量研究。

低氧是模拟高海拔环境的一个重要因素。

有研究表明，人类长期生活于高海拔或地域性肾性缺血容易引起组织缺氧导致EPO合成增加[1]。

徐国琴等人研究表明大鼠经过4周低氧居住后，血清中EPO含量增加，有氧运动能力也得到了提高[2]。

哺乳动物和鸟类在生理机制上有相似但也有不同，很多鸟类在高海拔也有分布，对于鸟类居住所在海拔的不同会不会引起其血浆EPO含量的差异还不清楚。

此外一些研究表明，间歇性低氧训练可提高大鼠心肌、骨骼肌中琥珀酸脱氢酶（Succinate dehydrogenase，SDH）以及细胞色素氧化酶（Cytochrome oxidase，CCO）的活性，从而提高低氧环境下大鼠的有氧氧化能力，增强代谢水平，为机体提供更多能量[3]。

低氧习服、低氧训练或暴露能增强大鼠心肌线粒体呼吸链酶的活性[4]。

根据高原或低氧等因素对大鼠、牦牛（Bos grunniens）等哺乳动物代谢水平的影响，本研究将研究不同海拔环境是否对树麻雀血浆中EPO的含量以及心肌的有氧氧化酶的活性产生影响。

海拔上升1000米，气温就降低6℃。

海拔的高低会造成该地区的气压、气流、气温、湿度、电离以及辐射等因素的差异[5]，这些气候因素的综合差异影响着生物体的生理调控机制。

同一海拔下，不同地区的气候差异也会影响生物体的能量代谢水平。

因此研究不同海拔对树麻雀的有氧氧化能力的影响要选取具有代表性的地区，本研究选择高海拔的青海和低海拔的石家庄两个地区为研究区域。

青海位于青藏高原的东北部，平均海拔在3000米以上，最高海拔在6860米[6]。

青藏高原地势复杂多样，物种种类繁多，鸟类在高原上不同海拔多有分布，青藏高原上丰富的鸟类资源给本研究提供了研究素材。

石家庄位于华北平原河北省，地区内大多海拔在30~100米，最低海拔为28米，相比于青藏高原内的青海，石家庄处于较低海拔。

并且树麻雀在人类居住地多有分布，也为本研究提供了大量的实验素材。

另外树麻雀是一种地方留鸟，没有季节性迁移，数量多且易捕捉。

EPO由肾脏产生，在血浆中也有分布，EPO与红细胞的生成密切相关，研究可以从肾脏、血浆等部位取材来测量EPO含量。

心脏是输送血液的泵，将携氧和营养的血液输送到全身各处，其有氧代谢的改善和增强影响着整个生物体机能状态的改善和提高。

心肌有氧氧化酶活性的差异体现着不同海拔对树麻雀心肌代谢的影响。

糖的有氧氧化在糖分解代谢中占主导地位，产能最多，在胞液和线粒体中进行，包括糖酵解、丙酮酸的氧化脱羧、三羧酸循环、氧化磷酸化四个阶段。

常测量的有氧氧化酶有CS、琥珀酸脱氢酶（Succinate dehydrogenase，SDH）、异柠檬酸脱氢酶（Isocitrate dehydrogenase，ICD）、α-酮戊二酸脱氢酶（α-Ketoglutarte dehydrogenase complex，KGDHC）、细胞色素氧化酶（Cytochrome oxidase ，CCO）等，酶活力的测定有比色法、分光光度法、滴定法、量气法、酶偶联分析法等，本研究通过测定有氧氧化酶CS的活性来代表生物体有氧氧化能力。

2.材料与方法
2.1材料来源
本研究采用的青海和石家庄树麻雀的血浆和心肌样本均来自于河北师范大学动物生态学实验室。

2.2实验用具
鸟类促红细胞生成素（EPO）酶联免疫分析试剂盒（酶联生物公司，Lot：201610）、BCA蛋白定量试剂盒（康为试剂公司，Cat：CW00145）、分光光度计、酶标仪（412nm）、生化分析仪、37℃水浴/气浴箱、微量移液器、漩涡混匀器、高速离心机、台式离心机、研磨管、1.5ml离心管。

2.3样本处理
2.3.1 血浆样本的处理
取出树麻雀冷冻血浆（采集于青海和石家庄）在室温下解冻。

2.3.2 心肌样本的处理
①样本准备：取出树麻雀冷冻心肌组织（采集于青海和石家庄）在室温下解冻，用冲洗液进行冲洗，用滤纸将其吸干，称取组织重量约100mg。

②样本研磨：将心肌放入研磨管中，按重量（g）：体积（ml）=1：9的比例加入PBS缓冲溶液，研磨至无明显固体，制备10%组织匀浆，倒入1.5ml 离心管中。

③离心：离心管在4℃台式低温离心机12000转/分钟离心10min。

④离心后将离心管置于冰槽，吸取上清液到新的1.5ml离心管备用。

2.4实验方法
2.4.1 EPO含量的测定
本实验采用免疫酶联分析法来测定树麻雀血浆中EPO的含量。

①稀释标准品：按照试剂盒所配置的比例在试管中进行稀释。

②酶标板加样：设置空白对照组、标准液孔和样本孔。

用移液枪在酶标包被板滴加50μl标准品，先在样本孔中滴加40μl样品稀释液，再滴加10μl待测样品。

加样时，小心将样品垂直加入酶标板孔底部，尽量避免触及孔壁，加完样后将酶标板轻晃混匀。

③气浴箱温育：取出试剂盒中封板膜，小心用其将酶标板封住，放入37℃气浴箱中温育，温育时间为30min。

④配制PBS洗涤液：在5ml 30倍浓缩洗涤液中加入150ml水轻晃混匀，稀释成30倍的PBS洗涤液。

⑤洗涤酶标板：从温浴箱中取出酶标板，小心揭开封板膜，将酶标板中液体甩干，在孔中加满PBS 洗涤液，静置30s甩干板中液体，在吸水纸上用力拍干。

重复5次洗涤操作。

⑥加酶标：每孔加入试剂盒中的50μl酶标试剂，空白组不需加入。

⑦温育（同③）→洗涤（同⑤）
⑧避光显色：在每孔中加入50μl显色剂A，再加50μl显色剂B，轻晃混匀，将酶标板置于37℃气浴箱中避光显色10min。

⑨显色终止：在每孔中加入50μl终止液，终止显色反应，孔内液体颜色由蓝色立刻变为黄色。

⑩OD值测定并计算实际浓度：
测定:在加入终止液15min内，进行空白对照组调零，在450nm波长下测量每孔的OD值。

计算：制定标准曲线，横坐标为标准物的实际浓度，纵坐标为测得的OD值。

按照测定的样品的OD值根据标准曲线，读出相对应的浓度数，再乘以5，所得结果即为样品EPO的实际浓度。

2.4.2 CS活性的测定
2.4.2.1 CS 活性的测定
①仪器准备：将酶标仪设定到波长412nm，预温30min，使之各项指标参数处于较稳定状态。

②试剂准备：取出冷冻试剂和冷藏试剂取出，平衡至室温后使用。

③阴性对照和待测样本OD值的测定
所加试剂（μl）阴性对照孔待测样本孔试剂一190190
试剂二2525
试剂三2525
轻晃混匀，在37℃孵育箱温浴3~5min
阴性对照液100
待测样本0 10
轻摇酶标板，并置于酶标仪中，设定波长为412nm，测定初始吸光度A0值；转置37℃孵育箱温浴15min，
即可放入酶标仪，测定吸光度A15。

按照上表测定空白对照组的AO0、AO15以及待测样品的AU0、AU15。

2.4.2.2蛋白浓度的测定
①BSA标准品的稀释：按照试剂盒稀释比例来稀释BSA标准品。

②BCA工作液的配制：
BCA工作液总量=（BSA标准品样本个数+未知样本个数）×复孔数×每个样本BCA工作液体积根据计算出的所需要BCA工作液总量，按照50：1的体积比将试剂A和试剂B成配制BCA工作液，充分混匀。

③定量检测
首先对试管进行标记，再将稀释好的BSA标准品和待测稀释后的蛋白样品各100μl分别加到试管
中。

做2-3个平行反应。

然后向每个试管中各加入2 ml BCA工作液，轻轻摇晃充分混匀液体，室温下孵育2小时。

最后将分光光度计调到562 nm，之后测定每个样品的OD值及BSA标准品的OD值，同时做好记录。

2.4.2.3 CS活性的计算
根据测定柠檬酸合酶酶活力的公式，进行运算，计算出CS活力。

柠檬酸合酶（CS）活力=[（AU15-AU0）-（AO15-AO0）]÷（13.6×10-3×0.6×15）×体系稀释倍数（25）÷蛋白浓度（mgprot/ml）×样本测定前稀释倍数
注：1.AU代表测定孔吸光度值，AO代表空白孔吸光度值。

2.微摩尔消光系数为1
3.6×10-3；0.6cm为光径换算结果；15分钟为反应时间。

3.单位为U/mgprot
3. 实验结果
3.1青海树麻雀和石家庄树麻雀血浆中EPO含量比较
将两个地区的各组数据进行统计学分析得出不同海拔树麻雀血浆中EPO含量无显著性差异。

（青海地区树麻雀血浆EPO含量平均值：28.84±2.150，N=6，石家庄地区树麻雀血浆EPO含量平均值：31.13±2.612，N=9，t=0.6253，df=13，P=0.5426；F8,5=2.213）（图3.1）。

3.1 青海和石家庄两地树麻雀血浆中EPO的含量
3.2青海树麻雀和石家庄树麻雀心肌中CS活性比较
将两个地区的各组数据进行统计学分析得出不同海拔树麻雀心肌中CS活性无显著性差异。

（青海地区树麻雀心肌中CS活性平均值：1558±321.7，N=14，石家庄地区树麻雀心肌中CS活性平均值：1584±490.1，N=6，t=0.0449，df=18，P=0.9646；F8,5=1.005）（图3.2）。

3.2青海和石家庄两地树麻雀心肌中CS活性
4. 讨论
4.1不同海拔对树麻雀心肌代谢中EPO的影响
有氧氧化的供能过程大多发生在线粒体，利用氧的氧化作用来进行糖的分解代谢。

EPO是一种大分子量的糖蛋白，主要由肾脏产生，分布在各组织及血浆中。

通过作用于促红细胞生成素受体（Erythropoietin receptor，EPOR）促进红细胞的生成，来提高血液的携氧能力[7]，促进机体有氧代谢的进行。

有研究表明，低氧能够促进大鼠肾脏EPO的分泌，加速红细胞的生成[8]，促进血浆中EPO的含量，增加血液中红细胞的数量，以改善机体对低氧环境的适应[9]。

EPO还能增强慢性缺氧心肌细胞的线粒体生物合成[10]，提高心肌细胞在慢性缺氧条件下的能量代谢能力[10,11]。

此外受试者在高海拔的急性暴露下，血浆中EPO含量明显增加，左心室收缩增强[12]。

本研究通过采集石家庄和青海两个地区树麻雀，来测定不同海拔下树麻雀血浆EPO的含量。

实验数据经统计学分析表明两个地区并无显著差异，这表明海拔并未对树麻雀血浆中EPO的含量产生影响，对于线粒体的生物合成，没有起到加强促进的作用，即海拔因素并未从改变树麻雀血浆中EPO的含量来影响机体的有氧氧化水平。

有研究表明，运动员和长期居住于高海拔地区的人的血浆中EPO含量经过了从上升到下降的过程[13]，这个过程是一个缓慢的环境适应过程。

本研究材料来源于长期栖息在高海拔和低海拔的树麻雀，树麻雀对高海拔的适应可能使血浆中EPO含量上升又下降到低海拔树麻雀血浆中EPO含量水平。

国外有研究显示，高低海拔的受试者在非高强度训练状态下血浆中EPO含量无变化[14]。

本研究中树麻雀长期生活在该海拔状态下，且未经过过量训练，这可能是不同海拔树麻雀血浆EPO含量没影响的一个因素。

此外，本研究结果与以往研究不同还在于，以往研究的实验大多在模拟高原环境中进行，探究单一环境因素变化而产生应激反应对生物体代谢的影响，本实验以栖息在不同海拔下的树麻雀为研究对象，无环境变化的干扰，这也可能是海拔对树麻雀EPO无明显差异的原因。

4.2不同海拔树对麻雀心肌代谢中CS酶活性的影响
三羧酸循环是有氧氧化过程的第二阶段，在线粒体中进行。

三羧酸循环是产生能量的主要途径，也是营养物质氧化分解的重要途径和代谢联系的枢纽，既为其他代谢过程提供小分子前体，又为呼吸链提供氢离子和电子。

在三羧酸循环中，无论乙酰CoA的来源如何，CS是催化三羧酸循环的第一步，是需氧代谢中必需的酶，也是限速酶。

有研究表明，缺氧训练可增强人体腿骨骼肌CS活性，提高有氧代谢水平[15]。

蔡明春研究表明，大鼠在模拟高海拔环境下训练并居住，能增加其右心室中CS的活性[16]。

另外，在大多数鱼类中，CS活性会随温度的升高而显著降低[17]。

本实验研究数据经统计学分析得出石家庄树麻雀和青海树麻雀心肌中CS酶的活性基本相同，没有显著性差异，说明不同海拔对树麻雀心肌中CS酶的活性无影响。

有研究表明高度可导致体重减轻，并可能导致肌肉细胞的底物消耗[18]，海拔暴露也不影响任何组织中CS的活性[19]。

本实验以不同海拔树麻雀心肌为研究材料，海拔可能导致树麻雀心脏结构甚至功能发生变化。

同时心脏是一个高耗能的器官，无论在高海拔还是低海拔，麻雀在空中完成飞行都需要心脏提供大量能量，CS活性没有差异，说明海拔对心肌中线粒体的数量没有影响[19]。

糖的有氧氧化和糖酵解以及脂代谢密切相关，树麻雀心肌的代谢调节可能在另外两个方面有所影响。

此外CS活性没有差异的原因也可能在于，以往实验是将普通动物暴露于高海拔的模拟环境下进行饲养或者训练，来研究动物应激条件下代谢相关酶的变化，而本研究选用长期生活在不同海拔的树麻雀，又因树麻雀是一种留鸟，已适应所在海拔的环境，不存在因环境变化而引起的应激变化，这些都可能导致海拔对树麻雀心肌中CS酶的活性无明显差异，有氧代谢水平没有影响。

综上所述，青海和石家庄虽然处于不同海拔，但这种海拔差异引起的地理环境因素并未对树麻雀血浆中EPO以及心肌中CS产生影响。

这可能是长期生活在高海拔或低海拔下的树麻雀，在捕捉前未进行强度的训练的情况下，EPO和CS活性无显著性差异。

海拔对心脏的结构和功能的影响也会对本研究结果起一定的作用。

本研究选择有氧氧化的两个方面进行研究，不同海拔对树麻雀其他代谢途径是否产生影响，还需进一步研究。

另外与大多数海拔对动物生理代谢影响的研究不同，本研究是在海拔的地理综合作用下对树麻雀进行实验，实验结果反映了在不同海拔集合环境因素下（如低温、低氧、高压）树麻雀EPO含量和心肌CS活性的情况，没有显著性影响并不意味着海拔环境中的低温、低氧及高压刺激某一因素不会造成树麻雀EPO含量和心肌CS活性的差异。

此外树麻雀是一种留鸟，没有出现显著性差异的原因可能与树麻雀在该海拔下生活的长期性有关，长期的进化使得树麻雀祖辈们的生理调节机制适应了该海拔的地理特点，如低温、低氧、高压，在后代的繁殖过程中会将这种特质遗传下来，成为适应性遗传。

因此在该海拔下生活的树麻雀已适应海拔的环境，在有氧代谢机制上不会做出反应。

至于不同海拔未对树麻雀EPO含量及有氧氧化酶产生显著性差异的原因，还需从代谢调节、基因遗传、适应性等方面进一步研究。

5.结论
青海和石家庄树麻雀血浆中EPO含量和心肌中CS的活性不存在显著性差异，表明不同海拔产生的地理作用未从EOP含量及CS活性方面来增强树麻雀有氧代谢的能力，同时表明树麻雀有可能从能量代谢的其他方面来提高机体代谢水平。

另外海拔对心脏的结构和功能的改变可能会影响心肌代谢的调
节，长期生活在高海拔上的树麻雀对其低氧低温环境的适应也有可能会限制它们生理机制的调节。

致谢
感谢生态学实验室提供给我完成本科实验论文的机会和平台，感谢老师们对我论文的指导，感谢实验室师兄、师姐以及同组小伙伴的耐心帮助。

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Study on the Content of EPO and the Activity of Aerobic Oxidase in Sparrows of Different Altitude
Author: Zhao Wenlu; Supervisor: Li Dongming
Summary：In the evolutionary process, the organism regulates its own physiological mechanisms to adapt to the changing environment. Hypoxia stimulation and high living low training and other environmental changes will have an impact on the animal's physiological regulation mechanism, resulting in stress response. However, it is unclear whether the difference in altitude affects the content of Erythropoietin (EPO) and the activity of aerobic metabolic enzymes in myocardium for long-lived sparrows (Passer montanus) at high altitudes or low altitudes. In this study, the plasma and myocardium of sparrows in Qinghai and Shijiazhuang were selected as experimental materials. The content of EPO in plasma was determined by immunoenzymatic method. The key enzyme of aerobic oxidation (Citrate synthase, CS) was determined by biochemical analyzer. The data were analyzed by statistic T test, indicating that the difference in altitude did not show significant differences in EPO content and CS activity in the myocardium of the two regions..
Key words：different elevation, tree sparrow, EPO, aerobic oxidase。