TTC法测根系活力

氯化三苯基四氮唑（TTC ）法测定根系活力
摘要：氯化三苯基四氮唑是标准氧化还原电位为80mV 的氧化还原物质,溶于水中成为无色溶液, 但还原后即生成红色而不溶于水的三苯基甲,TTC 被广泛地用作酶试验的氢受体,植物根所引起的TTC 还原,可因加入琥珀酸、延胡索酸、苹果酸得到增强,而被丙二酸、碘乙酸所抑
制.所以TTC 还原量能表示脱氢酶活性,并作为根系活力的指标.
【原理】
氯化三苯基四氮唑（TTC ）是标准氧化还原电位为80mV 的氧化还原物质,溶于水中成为无色溶液但还原后即生成红色而不溶于水的三苯基甲（TTF ）,如下式：
生成的TTF 比较稳定,不会被空气中的氧自动氧化,所以TTC 被广泛地用作酶试验的氢受体, 植物根
所引起的TTC 还原,可因加入琥珀酸、延胡索酸、苹果酸得到增强,而被丙二酸、碘乙酸所抑制.所以TTC 还原量能表示脱氢酶活性, 并作为根系活力的指标.
【仪器与用具】
分光光度计；分析天平（感量0.1mg ）；恒温箱1 台；研钵1 套；100ml 三角瓶；漏斗；移液管
10ml 1支、2ml 1支、0.5ml 1支；20ml刻度试管；10ml容量瓶；小培养皿；试管架,药匙；石英砂适量. 【试剂】
1 、乙酸乙酯；
2、连二亚硫酸钠（Na2S2O4, 为强还原剂,俗称保险粉）；
3、1%TTC 溶液：准确称取TTC 1.0g, 溶于少量蒸馏水中,定容至100ml；
4、0.4%TTC 溶液：准确称取TTC 0.4g, 溶于少量蒸馏水中,定容至100ml；
5、磷酸缓冲液（1/15mol/L,pH7.0 ）；
6、1mol/L 硫酸：用量筒量取比重1.84 的浓硫酸55ml, 边搅拌边加入盛有500ml 蒸馏水的烧杯中,冷却后稀释至1000ml ；
7、0.4mol/L 琥珀酸钠：称取琥珀酸钠（含6 个结晶水）10.81g, 溶于蒸馏水中,定容至100ml.
【方法】
1 、定性测定
1)配置反应液把1%TTC 溶液,0.4moL/L 琥珀酸钠和磷酸缓冲液按1:5:4 比例混合.
(2)把根仔细洗净，把地上部分从茎基切除，将根放入三角瓶中，倒入反应液，以浸没根为度，置37 C左右暗处放1h,以观察着色情况，新根尖端几毫米以及细侧根都明显地变成红色，表明该处有脱氢酶存在•
2、定量测定
( 1 ) TTC 标准曲线的制作
吸取0.25ml 0.4%TTC 溶液放入10ml 容量瓶,加少许Na2S2O4 粉末,摇匀后立即产生红色的TTF. 再用乙酸乙酯定容至刻度,摇匀.然后分别取此液0. 25ml 、0.5ml 、1 .00ml 、1 .50ml 、2.00ml 置10ml 容量瓶中,用乙酸乙酯定容至刻度，即得到含TTF25口g、50 口g、100口g、150口g、200口g的标准
比色系列,以空白作参比,在485nm 波长下测定光密度,绘制标准曲线.
(2)称取根样品0.5g,放入小培养皿(空白试验先加硫酸再加入根样品，其他操作相同),加入0.4%TTC 溶液和磷酸缓冲液的等量混合液10ml,把根充分浸没在溶液内，在37 C下暗处保温1h,此后加入1mol/L 硫酸
2ml, 以停止反应.
( 3)把根取出,吸干水分后与乙酸乙酯3~4ml 和少量石英砂一起磨碎,以提出TTF. 把红色提出液移入试管，用少量乙酸乙酯把残渣洗涤二至三次，皆移入试管，最后加乙酸乙酯使总量为10ml,用分光光度计在485nm 下比色,以空白作参比读出光密度,查标准曲线,求出四氮唑还原量.
( 4)计算
将所得数据带入下式,求出四氮唑还强度。