一种静注人免疫球蛋白的提纯方法[发明专利]

(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810576441.4
(22)申请日 2018.06.06
(71)申请人 华兰生物工程重庆有限公司
地址 408000 重庆市涪陵区鹤凤大道66号
申请人 华兰生物工程股份有限公司
(72)发明人 刘余江　滕世超　杨柳　周康森　
张宝献　李长明　
(74)专利代理机构 重庆中之信知识产权代理事
务所(普通合伙) 50213
代理人 张景根
(51)Int.Cl.
C07K 16/00(2006.01)
C07K 1/36(2006.01)
C07K 1/34(2006.01)
C07K 1/18(2006.01)
(54)发明名称
一种静注人免疫球蛋白的提纯方法
(57)摘要
本发明公开了一种静注人免疫球蛋白的提
纯方法，对二次沉淀组分进行提纯，其特征在于：
所述静注人免疫球蛋白的提纯方法包括如下步
骤：S1溶解：用注射用水溶解二次沉淀组分，并在
2.0～8.0℃下搅拌2～4小时，得溶解液；S2过滤：
过滤溶解液，先用0.45μm滤膜过滤，再用0.2μm
滤膜过滤，得过滤液；S3调整过滤液：调整过滤液
的pH为5.60～6.00，蛋白浓度为10～13g/L，电导
率为0.2～1.90ms/cm，得层析前溶液；S4层析：利
用强阴离子交换凝胶进行层析，层析前，先对凝
胶进行冲洗平衡：平衡至凝胶的pH与层析前溶液
的pH值差值为-0.10～0.10，按照0.5～1.5cm/
min线性流速，按照层析载量不高于600g/L凝胶
层析上样，并收集层析后溶液。

本发明的方法简
单、可控，大大降低了静注人免疫球蛋白中IgA、
IgM的含量。

权利要求书1页 说明书11页CN 108623677 A 2018.10.09
C N 108623677
A
1.一种静注人免疫球蛋白的提纯方法，对经低温乙醇法得到的二次沉淀组分进行提纯，其特征在于：所述静注人免疫球蛋白的提纯方法包括如下步骤：
S1溶解：用相当于二次沉淀组分体积5～10倍的注射用水溶解二次沉淀组分，并在2.0～8.0℃下搅拌2～4小时，得溶解液；
S2过滤：过滤溶解液，先用0.45μm孔径过滤，再用0.2μm孔径过滤，得过滤液；
S3调整过滤液：调整过滤液的pH为5.60～6.00，蛋白浓度为10～13g/L，电导率为0.20～1.90ms/cm，得层析前溶液；
S4层析：利用强阴离子交换凝胶进行层析，层析前，先对凝胶进行冲洗平衡：平衡至凝胶的pH与层析前溶液的pH值差值为-0.10～0.10；
依据层析前溶液的蛋白浓度，按照层析载量不高于600g/L凝胶层析上样，控制流速为0.5～1.5cm/min线性流速，并收集层析后溶液，
层析结束后，用洗脱液将吸附于凝胶上的杂质冲洗下来，得杂质溶液。

2.根据权利要求1所述的一种静注人免疫球蛋白的提纯方法，其特征在于：所述步骤S2中的过滤压力不超过0.15MPa。

3.根据权利要求1所述的一种静注人免疫球蛋白的提纯方法，其特征在于：所述步骤S3调整过滤液的pH用1.0mol/L醋酸溶液，并控制醋酸加入的速度在300～400ml/min。

4.根据权利要求1所述的一种静注人免疫球蛋白的提纯方法，其特征在于：所述步骤S3中用平衡液调整过滤液蛋白浓度、电导率，所述平衡液包括pH为
5.60～
6.00的0.025mol/L 醋酸盐缓冲液、pH为5.60～6.00的0.0025mol/L醋酸盐缓冲液、注射用水其中一种或多种组合。

5.根据权利要求1所述的一种静注人免疫球蛋白的提纯方法，其特征在于：所述步骤S4层析前对凝胶进行平衡包括如下步骤：按1.5～3.0cm/min的线性流速分别用0.5mol/L氢氧化钠溶液、pH为5.60～
6.00的0.025mol/L醋酸盐缓冲液、pH为5.60～6.00的0.0025mol/L醋酸盐缓冲液进行冲洗平衡。

6.根据权利要求1所述的一种静注人免疫球蛋白的提纯方法，其特征在于：步骤S1中所述注射用水的温度为2～8℃，且注射用水用于溶解二次沉淀组分前检查内毒素，内毒素检查合格后再使用。

7.根据权利要求1所述的一种静注人免疫球蛋白的提纯方法，其特征在于：对溶解液、过滤液、层析后溶液进行取样测量蛋白质浓度、pH、电导率，用以指导下一步的操作。

权　利　要　求　书1/1页CN 108623677 A
一种静注人免疫球蛋白的提纯方法
技术领域
[0001]本发明涉及生物制药领域，具体涉及一种静注人免疫球蛋白的提纯方法。

背景技术
[0002]静注人免疫球蛋白的活性成分为人免疫球蛋白，以1000人份以上的健康人血浆为原料，分离制备得到IgG免疫球蛋白。

静注人免疫球蛋白含有广谱抗病毒、细菌或其它病原体的IgG抗体，另外免疫球蛋白的独特型和独特型抗体能形成复杂的免疫网络，所以具有免疫替代和免疫调节的双重治疗作用，临床上主要用于原发性免疫球蛋白缺乏症、继发性免疫球蛋白缺陷病、自身免疫性疾病。

[0003]提取人免疫球蛋白的技术主要是低温乙醇法，低温乙醇法始于20世纪40年代。

但是低温乙醇分离蛋白质的方法制得的免疫球蛋白不能用于静脉注射，否则会引起严重的副反应，这是因为，除了体内缺乏IgG外，另外一个重要的原因是制剂中存在着与IgG聚合体相关的抗补体活性。

为了治疗像原发性免疫缺陷、免疫性血小板缺乏性紫癜和皮肤黏膜淋巴结综合征等需要注射大剂量的免疫球蛋白的疾病，人们的研究重点放在如何减少抗补体活性上。

主要的方法包括酶解法和化学修饰法，在消除和减少抗补体活性的同时，也影响到了IgG的全活性表达。

如IgG上Fc段的功能与效应。

经过多次的改进，现在的制备技术主要有低温乙醇法结合层析法。

低温乙醇法以人血浆为原料，一般经过二次沉淀，得到免疫球蛋白的二次沉淀组分，二次沉淀组分中包括大部分的IgG、少量的IgA、IgM、还带有多聚体和PKA。

[0004]近年来，国内生产厂家将重点放在目标产物的收率上，不断改善静注人免疫球蛋白的制备工艺。

但是人血中的免疫球蛋白主要有五种，每一种还包括多种亚种，其中IgA能够引起先天缺乏IgA患者输注静注人免疫球球蛋白后产生抗-IgA，可能引起过敏反应，产生副作用，成为一个不安全因素。

欧洲规定了必须标明IgA的含量，以便患者选择IgA含量较低的产品，而国内并没有要求。

国内有IgA的含量不超过200μg/ml的报道，国外出现过IgA的含量不超过50μg/ml的要求。

为了降低静注人免疫球蛋白中IgA、IgM的含量，现提供一种静注免疫球蛋白提纯的方法，简化工艺，大大降低静注人免疫球蛋白中IgA、IgM的含量。

发明内容
[0005]针对现有技术中所存在的不足，本发明的目的在于提供一种静注人免疫球蛋白的提纯方法，本发明的方法简单、可控，大大降低了静注人免疫球蛋白中IgA、IgM的含量。

[0006]为实现上述目的，本发明采用了如下的技术方案：
[0007]一种静注人免疫球蛋白的提纯方法，对经低温乙醇法得到的二次沉淀组分进行提纯，所述静注人免疫球蛋白的提纯方法包括如下步骤：
[0008]S1溶解：用相当于二次沉淀组分体积5～10倍的注射用水溶解二次沉淀组分，并在2.0～8.0℃下搅拌2～4小时，得溶解液；
[0009]S2过滤：过滤溶解液，先用0.45μm滤膜过滤，再用0.2μm滤膜过滤，得过滤液；[0010]S3调整过滤液：调整过滤液的pH为5.60～6.00，蛋白浓度为10～13g/L，电导率为
0.20～1.90ms/cm，得层析前溶液；
[0011]S4层析：利用强阴离子交换凝胶进行层析，层析前，先对凝胶进行冲洗平衡：平衡至凝胶的pH与层析前溶液的pH值差值为-0.10～0.10，
[0012]依据层析前溶液的蛋白浓度，按照层析载量不高于600g/L凝胶层析上样，控制流速为0.5～1.5cm/min线性流速，并收集层析后溶液，
[0013]层析结束后，用洗脱液将吸附于凝胶上的杂质冲洗下来，得杂质溶液。

[0014]本发明是基于低温乙醇方法基础上继续进行层析提纯得到低IgA、IgM含量的静注人免疫球蛋白制品。

所用的层析凝胶为强阴离子交换凝胶，将层析环境pH的范围控制在5.60～6.00时，因为IgA、IgM此时的等电点小于所处溶液的pH所以IgA、IgM带负电，与阴离子交换柱进行交换、吸附。

而绝大部分的IgG不会吸附于凝胶上，随即流出，层析分离蛋白的原理主要是基于蛋白质分离的特性，既蛋白质的浓度、pH、电导率。

所要分离蛋白质的特点结合离子交换凝胶的特性，通过配合出适宜分离的微环境，达到分离的效果。

[0015]层析用于生物制药的下游产业时，常常面对的是原来的试验被放大时不能实现同样的效果。

而本发明就克服了这个缺点，可用于放大生产，且大大降低了IgA、IgM的在制剂中的含量。

提高静注人免疫球蛋白的含量。

[0016]本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：
[0017]1、用灭活后二次沉淀的二次沉淀组分为起始原料，通过层析，准确控制提纯系统的酸碱度，得到去除效果明显的制品。

[0018]2、凝胶高度采用25cm，提高了层析一次上样量，减少生产时限。

[0019]3、高载量，载量可以达到600g/L凝胶，去除效率90％以上。

[0020]4、电导率采用0.2～1.90ms/cm，一次调节电导率后，在层析过程中不用再调电导，易于放大生产操作。

具体实施方式
[0021]下面通过具体实施方式对本发明作进一步详细的说明：
[0022]一种静注人免疫球蛋白的提纯方法，对经低温乙醇法得到的二次沉淀组分进行提纯，所述静注人免疫球蛋白的提纯方法包括如下步骤：
[0023]S1溶解：用相当于二次沉淀组分体积5～10倍的注射用水溶解二次沉淀组分，并在2.0～8.0℃下搅拌2～4小时，得溶解液；
[0024]S2过滤：过滤溶解液，先用0.45μm滤膜过滤，再用0.2μm滤膜过滤，得过滤液[0025]S3调整过滤液：调整过滤液的pH为5.60～6.00，蛋白浓度为10～13g/L，电导率为0.2～1.90ms/cm，得层析前溶液；
[0026]S4层析：利用强阴离子交换凝胶进行层析，层析前，先对凝胶进行冲洗平衡：平衡至凝胶的pH与层析前溶液的pH值差值为-0.10～0.10，
[0027]依据层析前溶液的蛋白浓度，按照层析载量不高于600g/L凝胶层析上样，控制流速为0.5～1.5cm/min线性流速，并收集层析后溶液，
[0028]层析结束后，用洗脱液将吸附于凝胶上的杂质冲洗下来，得杂质溶液。

[0029]所述步骤S2中的过滤压力不超过0.15MPa。

[0030]所述步骤S3调整过滤液的pH用1.0mol/L醋酸溶液，并控制醋酸加入的速度在300
～400ml/min。

[0031]所述步骤S3中用平衡液调整过滤液蛋白浓度、电导率，所述平衡液包括pH为5.60～6.00的0.025mol/L醋酸盐缓冲液、pH为5.60～6.00的0.0025mol/L醋酸盐缓冲液、注射用水其中一种或多种组合。

[0032]所述步骤S4层析前对凝胶进行平衡包括如下步骤：按1.5～3.0cm/min的线性流速分别用0.5mol/L氢氧化钠溶液、pH为5.60～6.00的0.025mol/L醋酸盐缓冲液、pH为5.60～6.00的0.0025mol/L醋酸盐缓冲液进行冲洗平衡。

[0033]步骤S1中所述注射用水的温度为2～8℃，且注射用水用于溶解二次沉淀组分前检查内毒素，内毒素检查合格后再使用。

[0034]对溶解液、过滤液、层析后溶液进行取样测量蛋白质浓度、pH、电导率，用以指导下一步的操作。

[0035]生产企业不断优化制备静注人免疫球蛋白的工艺，解决问题出发的角度一般是利用免疫球蛋白的特性，既pH、电导率、蛋白质的含量等。

原料血浆中的免疫球蛋白，其活性是在水的介质中进行的，免疫球蛋白分子表面暴露了许多亲水集团，如氨基、羧基、羟基等，它们能与水分子起水合作用，因而每个蛋白质分子表面有一水化层包围从而使得各蛋白分子互相分离开来。

在一定pH溶液中，IgA、IgM和IgG的存在可解离的极性基团，其分子表面带有相同的电荷，与周围的电性相同的离子构成稳定的双电层，互相排斥。

另外，免疫球蛋白分子大小在胶体颗粒范围内，所以免疫球蛋白以稳定的亲水胶体形式存在于水溶液中。

但是，在水溶液中免疫球蛋白的稳定是有条件的，这种稳定性与水化作用、电荷及蛋白质大小有关，任何影响这些因素的条件都会破坏蛋白质溶液的稳定性。

[0036]现有的生产工艺通过不断调节pH、电导率、蛋白的浓度等来控制IgA、IgM和IgG的分离，但是效果不佳，工艺繁琐。

而且入手的角度越多，需要控制的因素也越多。

[0037]免疫球蛋白都是一种Y形结构包括轻链区、重链区，结构不相同。

IgG包括多个亚种，所以IgG的等电点并不是一个固定的值，而是一个范围。

但是IgA、IgM和IgG的结构差异不大，那么IgA、IgM和IgG的等电点也不一样。

当免疫球蛋白溶液环境中pH接近等电点时，蛋白质不带电，易聚集沉淀。

当pH小于等电点时蛋白质带正电，当pH大于等电点时蛋白质带负电。

[0038]强阴离子交换凝胶上的交换剂带有正电荷，能吸附带有负电荷的蛋白质。

根据免疫蛋白的性质，结合强阴离子交换层析的特点，控制IgG所处的微环境，使得形成负吸附过程，既IgA、IgM被吸附，而IgG随即流出，达到分析的效果。

[0039]通过强阴离子交换实现IgA、IgM与IgG分离的条件依赖于蛋白质的性质、IgG与IgA、IgM的结构特异性、免疫球蛋白所处的微环境，也就是免疫球蛋白的浓度、所述的pH环境、电导率等因素共同作用影响分离效果。

[0040]pH是一个重要的指标，pH的稳定主要通过用缓冲液实现的，所以缓冲液的选择是影响分离效果的重要因素。

pH和离子强度是选择缓冲液的关键因素，它不但影响到分离强阴离子交换剂对IgA、IgM和IgG分离效果，而且还影响IgG的收率。

选用的pH值决定于IgA、IgM和IgG的等电点、稳定性和溶解度，不但要使IgA、IgM成为可以进行交换的离子，还要维持IgG较高的活性。

同时也应该考虑到离子交换剂的pK值。

缓冲液由于本身带电，所以也可以与强阴离子交换剂结合。

这种结合会带来两方面的干扰，一方面降低了缓冲物的浓度，因
而降低了缓冲能力，另一方面是与蛋白质竞争，与强阴离子交换剂进行交换。

[0041]先用0.45μm滤膜过滤，再用0.2μm滤膜过滤，可以分步去除溶解液中的微型杂质。

同时控制过滤时的压力，一方面保证过滤的效果，另一方面保证溶解液中各种有效蛋白的活性。

[0042]流穿液：是指层析前溶液进入层析柱，IgA、IgM在强阴离子交换凝胶中完成交换吸附后，流出层析柱后IgG溶液。

[0043]工作液对分离效果的影响：这里所说的工作液包括缓冲液、洗脱液、凝胶CIP液，缓冲溶液用于平衡整个层析系统，用于为分离提供一个最佳微环境，或者层析后用于对离子交换凝胶的缓冲保护，增加凝胶的使用寿命。

洗脱液是指用于洗脱吸附在强阴离子交换凝胶上的杂质的溶液。

凝胶CIP液是指cleanning in place，在线清洗溶液，是用于洗脱液之后，用于对整个层析系统保护清洗。

[0044]为了得到高分辨率以及高负载量，工作液的制备以及性能也是非常重要的因素。

工作液的黏度、澄清度等不但影响离子交换剂的分离效果，还影响到强阴离子交换凝胶的使用寿命。

不但有简单的小分子，还有一些胶体物质、脂类物质等。

尤其是一些不可逆吸附的大分子往往包裹覆盖了强阴离子交换剂的功能基团，或堵塞强阴离子交换凝胶的孔道，造成不可逆污染，缩短强阴离子交换凝胶的使用寿命。

在进行分离前，应尽量将工作液进行适当的预处理，以确保分离的效果。

[0045]免疫球蛋白在分离纯化过程中由于冲洗过程中带走IgG，或洗脱不完全而使IgG滞留在强阴离子交换剂上，使IgG损失。

蛋白质的结构变化引起失活，也是影响活性回收的重要因素。

在离子交换过程中加入稳定剂或保护剂不但可以提高收率，还可以提高强阴离子交换剂对蛋白质的选择性，如聚乙二醇。

但是本发明可以不加入稳定剂或保护剂即可放大，用于生产线生产。

[0046]流速的影响：根据强阴离子交换剂的种类、粒径、工作液中有效成分的分子结构等确定流速。

黏度较大的工作液，因传质速率较低，也应采用较低的流速。

但若仅在分离强阴离子交换剂的表面进行交换吸附而不扩散到强阴离子交换剂的颗粒内部，流速可略快些。

使用大孔型离子交换树脂可以适当提高工作液的流速。

[0047]负吸附：将杂质离子化后被交换，而目标产物不被交换，直接流出。

采用此法通常可除去50％～70％的杂质。

适用于目标产物浓度高儿杂质含量低的工作液。

本发明中也就是IgG不被交换，直接被流出，而IgA、IgM被交换吸附在强阴离子交换剂上。

[0048]“载量可以达到600g/L”中“载量”是指离子交换剂工作容量(working capacity)或称有效容量(available capacity)是指每克干凝胶或每毫升湿凝胶在一定操作条件下交换吸附某一特定物质的实际容量。

“一定的操作条件”是指所用的缓冲液的种类、工作液的pH值、杂质存在情况及流速等特定的操作条件，同时还要标明目标蛋白的名称。

离子交换剂对各种分子的选择性不同，在初步选择凝胶之后，还应进一步确定适合的分离条件，才能充分发挥出离子交换剂的作用，才能获得较高的工作容量。

总之离子交换剂的有效容量具有实际应用意义，它不但取决于蛋白质的性质、离子交换剂性质，还与所选择的试验条件有密切关系。

本发明的工作容量是指：依据层析前溶液的蛋白浓度，按照层析载量不高于600g/L凝胶层析上样。

[0049]实施例
[0050]1、试验材料、仪器：强阴离子交换剂、紫外分光光度计、pH计。

[0051]2、IgA、IgM蛋白质含量检验用试剂盒：免疫球蛋白A酶联免疫试剂盒；免疫球蛋白M 酶联免疫试剂盒。

[0052]3、总蛋白含量检测：双缩脲法
[0053]4、试验材料：乙醇沉淀法制得的二次沉淀组分：01～18批，批号分别为M201709093、M201709093、M201709094、M201708087、M201708092、M201709095、M201709094、M201709094、M201709095、M201707066、M201707070、M201707071、M201709093、M201709093、M201707078、M201710096、M201710098、M201710099。

[0054]注：01、02批的批号为相同批号，13、14批的批号为相同批号，这是因为在前段低温乙醇生产过程中一批的生产量大，可分成多次进行层析。

[0055]5、所需试剂：
[0056]0.5mol/L氢氧化钠溶液；
[0057] 1.0mol/L醋酸溶液；
[0058]0.025mol/L醋酸钠/醋酸缓冲液，pH5.6～6.00；
[0059]0.0025mol/L醋酸钠/醋酸缓冲液，pH5.6～6.00；
[0060]凝胶CIP液：每1L凝胶CIP液中含有0.5mol的氢氧化钠、1mol的氯化钠、200ml的乙醇；
[0061]洗脱液：每1L洗脱液中含有0.0025mol的醋酸钠/醋酸缓冲液、1.0mol的氯化钠；[0062]凝胶封存液：每1L凝胶封存液中含有0.15mol氯化钠、200ml的乙醇。

[0063]实施例一：
[0064]1、试验对象：01批批号为M201709093
[0065]2、试验过程：
[0066]S1溶解：接取相当于01批二次沉淀组分体积8倍的6℃的注射用水，检测注射用水内毒素，待内毒素合格后，用于溶解01批二次沉淀组分，搅拌溶解，搅拌器控制转速以不起泡为准，3小时后停止搅拌，得到溶解液，进行第一次取样，并检测蛋白浓度、pH、电导率。

[0067]S2过滤：串联滤堆依次安装0.45μm孔径和0.2μm孔径的滤芯，冲洗过滤器，至合格。

过滤溶解液，控制过滤压力为0.13MPa，收集过滤后的溶液，过滤完成后用4.0℃注射用水顶洗滤器得顶洗液。

合并两种溶液，得过滤液。

测量过滤液体积，第二次取样，检测过滤液的蛋白浓度、pH、电导率。

[0068]S3调整过滤液：将1.0mol/L醋酸溶液以300ml/min加入过滤液中，调整过滤液的pH 至5.60，用pH为5.60～6.00的0.0025mol/L醋酸钠/醋酸缓冲液调整蛋白浓度13g/L，电导率为0.2ms/cm，得层析前溶液。

[0069]S4层析：按1.5cm/min的线性流速分别用0.5mol/L氢氧化钠溶液走3倍柱床体积、0.025mol/L醋酸钠/醋酸缓冲液，pH5.60～6.00走5倍柱床体积、0.0025mol/L醋酸钠/醋酸缓冲液，pH5.6～6.00走5倍柱床体积，平衡pH为5.60。

[0070]依据第二次取样，检验后的蛋白浓度，按照层析载量为600g/L凝胶层析按照1.5cm/min线性流速上样，上样至紫外起峰开始收集层析后溶液。

上样结束后用pH为5.60～6.00的0.0025mol/L醋酸钠/醋酸缓冲液顶出层析柱里的制品；搅拌均匀测量流穿液体积，第三次取样，检测蛋白含量、pH、电导率。

[0071]按1.5cm/min的线性流速分别走洗脱液5倍柱床体积、凝胶CIP液5柱床体积、凝胶封存液柱床体积。

收集洗脱液，测量体积，第四次取样，检测蛋白含量，并留样2个50ml。

[0072]实施例二
[0073]1、试验对象：02批，批号为M201709093
[0074]2、试验过程：
[0075]S1溶解：接取相当于02批二次沉淀组分体积5倍的6℃的注射用水，检测注射用水内毒素，待内毒素合格后，用于溶解02批二次沉淀组分，搅拌溶解，搅拌器控制转速以不起泡为准，2小时后停止搅拌，得到溶解液，进行第一次取样，并检测蛋白浓度、pH、电导率。

[0076]S2过滤：串联滤堆依次安装0.45μm孔径和0.2μm孔径的滤芯，冲洗过滤器，至合格。

过滤02批溶解液，控制过滤压力为0.14MPa，收集过滤后的溶液，过滤完成后用8.0℃注射用水顶洗滤器得顶洗液。

合并两种溶液，得过滤液。

测量过滤液体积，第二次取样，检测过滤液的蛋白浓度、pH、电导率。

[0077]S3调整过滤液：将1.0mol/L醋酸溶液以400ml/min加入过滤液中，调整过滤液的pH 至5.60，用pH为5.60～6.00的0.0025mol/L醋酸钠/醋酸缓冲液调整蛋白浓度13g/L，电导率为0.2ms/cm，得层析前溶液。

[0078]S4层析：按1.5cm/min的线性流速分别用0.5mol/L氢氧化钠溶液走3倍柱床体积、pH为5.60～6.00的0.025mol/L醋酸钠/醋酸缓冲液走5倍柱床体积、pH为5.6～6.00的0.0025mol/L醋酸钠/醋酸缓冲液走5倍柱床体积，平衡pH为5.70。

[0079]依据第二次取样，检验后的蛋白浓度，按照层析载量为600g/L凝胶层析按照1.5cm/min线性流速上样，上样至紫外起峰开始收集层析后溶液。

上样结束后用pH为5.60～6.00的0.0025mol/L醋酸钠/醋酸缓冲液顶出层析柱里的制品；搅拌均匀测量流穿液体积，第三次取样，检测蛋白含量、pH、电导率。

[0080]按1.5cm/min的线性流速分别走洗脱液5倍柱床体积、凝胶CIP液5柱床体积、凝胶封存液柱床体积。

收集洗脱液，测量体积，第四次取样，检测蛋白含量，并留样2个50ml。

[0081]实施例三
[0082]1、试验对象：03批，批号为M201709094
[0083]2、试验过程：
[0084]S1溶解：03批：接取相当于03批二次沉淀组分体积10倍的4℃的注射用水，检测注射用水内毒素，待内毒素合格后，用于溶解03批二次沉淀组分，搅拌溶解，搅拌器控制转速以不起泡为准，4小时后停止搅拌，得到溶解液，进行第一次取样，并检测蛋白浓度、pH、电导率。

[0085]S2过滤：串联滤堆依次安装0.45μm孔径和0.2μm孔径的滤芯，冲洗过滤器，至合格。

过滤03批溶解液，控制过滤压力为0.15MPa，收集过滤后的溶液，过滤完成后用2.0℃注射用水顶洗滤器得顶洗液。

合并两种溶液，得过滤液。

测量过滤液体积，第二次取样，检测过滤液的蛋白浓度、pH、电导率。

[0086]S3调整过滤液：将1.0mol/L醋酸溶液以300ml/min加入过滤液中，调整过滤液的pH 至5.60，用pH为5.60～6.00的0.0025mol/L醋酸钠/醋酸缓冲液调整蛋白浓度13g/L，电导率为0.2ms/cm，得层析前溶液。

[0087]S4层析：按1.5cm/min的线性流速分别用0.5mol/L氢氧化钠溶液走3倍柱床体积、
0.025mol/L醋酸钠/醋酸缓冲液，pH5.60～6.00走5倍柱床体积、0.0025mol/L醋酸钠/醋酸缓冲液，pH5.60～6.00走5倍柱床体积，平衡pH为5.60。

[0088]依据第二次取样，检验后的蛋白浓度，按照层析载量为600g/L凝胶层析按照1.5cm/min线性流速，上样，上样至紫外起峰开始收集层析后溶液。

上样结束后用pH为5.6～6.00的0.0025mol/L醋酸钠/醋酸缓冲液顶出层析柱里的制品；搅拌均匀测量流穿液体积，第三次取样，检测蛋白含量、pH、电导率。

[0089]按3.0cm/min的线性流速分别走洗脱液5倍柱床体积、凝胶CIP液5柱床体积、凝胶封存液柱床体积。

收集洗脱液，测量体积，第四次取样，检测蛋白含量，并留样2个50ml。

[0090]实施例一～三试验结果：
[0091]分别对实施例一、二、三的第二次取样、第三次取样的样品通过双缩脲法检测总蛋白含量，再通过IgA、IgM蛋白质含量检验用试剂盒检测样品中的的IgA的含量，得出下表：[0092]
试验批号01批02批03批
沉淀批号M201709093M201709093M201709094
层析前(ug/ml)205.37176.1666.40
层析后(ug/ml) 4.24 4.40 2.85
层析前(mg/g蛋白)17.114415.1861 5.5336
层析后(mg/g蛋白)0.44610.47850.3032
层析去除率97.39％96.85％94.52％
[0093]试验结论：本方法除去的IgA在94.52％～97.39％，除去效果明显。

[0094]实施例四～六：
[0095]1、试验对象：04～06批，批号分别为M201709094、M201708087、M201708092。

[0096]2、试验过程：步骤如下，其他步骤同实施例一：
[0097]S3调整过滤液：将1.0mol/L醋酸溶液以300ml/min加入过滤液中，调整过滤液的pH 至5.80，用0.0025mol/L醋酸钠/醋酸缓冲液，pH5.60～6.00调整蛋白浓度13g/L，电导率为0.2ms/cm，得层析前溶液。

[0098]S4层析：按1.5cm/min的线性流速分别用0.5mol/L氢氧化钠溶液走5倍柱床体积、0.025mol/L醋酸钠/醋酸缓冲液，pH5.6～6.00走5倍柱床体积、0.0025mol/L醋酸钠/醋酸缓冲液，pH5.60～6.00走5倍柱床体积，平衡pH为5.80。

[0099]依据第二次取样，检验后的蛋白浓度，按照层析载量为600g/L凝胶层析按照1.5cm/min线性流速上样，上样至紫外起峰开始收集层析后溶液。

上样结束后用pH为5.60～6.00的0.0025mol/L醋酸钠/醋酸缓冲液顶出层析柱里的制品；搅拌均匀测量流穿液体积，第三次取样，检测蛋白含量、pH、电导率。

[0100]按1.5cm/min的线性流速分别走洗脱液5倍柱床体积、凝胶CIP液5柱床体积、凝胶封存液柱床体积。

收集洗脱液，测量体积，第四次取样，检测蛋白含量，并留样2个50ml。

[0101]3、试验结果：
[0102]分别对实施例四～六的第二次取样、第三次取样的样品通过双缩脲法检测总蛋白含量，再通过IgA、IgM蛋白质含量检验用试剂盒检测样品中的的IgA的含量，得出下表：。