探讨鱼腥草蛋白酶抑制剂的分离和纯化
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探讨鱼腥草蛋白酶抑制剂的分离和纯化
摘要:目的以鱼腥草为材料,研究鱼腥草蛋白酶抑制剂(HCTI)的分离提取工艺。
方法HCTI的最佳粗提条件是采用pH 的双蒸水为提取溶剂,在体积比为1∶30,45 ℃条件下浸提 h,提取2次。
硫酸铵部分沉淀后,再经DEAE-52离子交换层析柱纯化。
结果粗提液经45%~60%饱和度的硫酸铵沉淀比活力最高,经过DEAE-52离子交换层析柱梯度洗脱后,检测到HCTI活性峰。
结论用DEAE-52离子交换层析柱可分离纯化HCTI,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,计算出该HCTI的分子量约为28 KDa。
关键词:胰蛋白酶抑制剂;鱼腥草;分离纯化
胰蛋白酶抑制剂(Trypsin inhibitor ,TI)除了在临床上用来治疗急性胰腺炎、肺气肿、脑水肿和脑缺血外,目前还发现它在HIV和肿瘤的治疗中也有重要意义[1]。
化学合成的TI生物利用度低、副作用大以及产生耐药性等缺点,植物来源的TI具有兼容性好、安全和特殊的药物特性等优点。
因此,从传统中药中筛选具有TI有活性的材料有很广阔的应用前景和市场价值。
鱼腥草为三白草科植物蕺菜Houttuynia cordata Thunb的地上部分,具有清热解毒、消痈排脓、利尿通淋之功效,是临床应用极其广泛的中药之一。
本文在前期研究的基础上,对鱼腥草中TI进行了分离纯化,获得的结果对开发植物来源的TI具有重要意义。
1 材料与仪器
试剂胰蛋白酶(北京麒麟宏伟公司) ,苯甲酰DL-精氨酸对硝基苯胺(上海三杰生物技术有限公司),DEAE-纤维素(Sigma),三-羟甲基-氨基甲烷,无水氯化钙,盐酸,三氯乙酸,氢氧化钠等为国产分析纯。
仪器可见光分光光度计,高速冰冻离心机,精密pH 计,数显恒温水浴锅,精密电子天平,蛋白质电泳仪等。
2 方法
鱼腥草胰蛋白酶抑制剂抑制率的测定参考杜旭东等[2,3]的苯甲酰DL-精氨酸对硝基苯胺(BAPNA)法。
鱼腥草胰蛋白酶抑制剂的分离与纯化参考康庄等[4]的方法进行。
3 结果
硫酸铵分级沉淀按照硫酸铵沉淀表,对样品浸提液添加硫酸铵至30%,
45%,60%,75%饱和浓度,分别测定各浓度下的体积、抑制活性和蛋白浓度。
pH值为的样品浸提液实验结果见表1,pH值为的样品浸提液实验结果见表2。
表1 pH 条件下硫酸铵分级沉淀TI的结果(略)表2 pH 条件下硫酸铵分级沉淀TI的结果(略)
从图1可以看出,两种不同pH体系活性析出均集中于30%~75%饱和度,但45%~60%饱和度下比活力最高,且pH 体系时比活力大。
因此,在以后的纯化过程中,均采用pH 溶液体系对样品液进行硫酸铵分级沉淀,加(NH4)2SO4至40%饱和度,以除去碱性或中性杂蛋白。
再加(NH4)2SO4至60%饱和度,收集沉淀,溶解透析供下步离子交换层析用。
抑制剂的析出在pH 体系比pH 体系要早,这说明抑制剂可能是一种酸性蛋白。
DEAE-52离子交换分离纯化取pH Tris-HCl缓冲液透析后的粗提液5 ml,上DEAE-52离子交换柱(ф cm×15 cm),流速为 ml/min,以50 ml缓冲液洗脱,使样品液压实,再分别用由缓冲液配制的60~400 mmol NaCl溶液进行梯度洗脱,所得各管洗脱液(每管收集3 ml)在紫外光280 nm下测其吸光度,检测蛋白含量,其梯度洗脱曲线见图2。
由图3可知, 在55~70号试管具有HCTI活性,以60~63号活性最高。
收集60号试管及附近活性较高的试管保存,进一步处理后进行HCTI相对分子量的测定。
洗脱液的浓度梯度与试管号的对应关系见表3。
表3 洗脱液的浓度梯度与试管号的对应关系(略)
鱼腥草胰蛋白酶抑制剂的相对分子量的测定
DEAE-52离子交换柱分离纯化后HCTI液的活性峰经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。
结果如图4。
由电泳图谱上测定的标准蛋白相对迁移率及其分子量,待测蛋白的迁移率为。
经计算机处理数据后,得回归方程:LogY=-+ 3 如图5所示,将待测的蛋白相对迁移率带入方程,计算出HCTI的分子量约为28 kDa。
4 讨论
本实验在粗提过程中采用分级盐析法除掉了部分杂蛋白,分离过程中用到了DEAE-52离子交换层析法,并检测到活性峰。
说明分级盐析发挥了一定作用,从而简化了分离纯化过程,测得HCTI分子量约为28 kDa。
为该胰蛋白酶抑制剂的进一步深入研究奠定了一定的理论基础。
【参考文献】
[1]刘同祥,牛建昭,杜旭东,等.具有蛋白酶抑制剂活性成分中药的筛
选[J].中国中药杂志, 20XX, 32 (7) :643.
[2]杜旭东,刘同祥,张宗申,等.正交实验法优选鱼腥草胰蛋白酶抑制剂的提取工艺[J].时珍国医国药,20XX,18(10):2337.
[3]杜旭东,刘同祥,张宗申,等.超声波法提取胰蛋白酶抑制剂[J].时珍国医国药,20XX,19(3):525.
[4]康庄,王竞,杜林方.菠菜种子胰蛋白酶抑制剂的分离纯化与部分性质研究[J].天然产物研究与开发,20XX,17(2):143.
论文在线 :s://。